Name: 小鼠 体内 胎盘靶向CRISPR操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学习使用CRISPR技术对小鼠胎盘进行时间特异性基因操作的方法。该技术通过注射和电穿孔实现胎盘基因表达调控，为研究妊娠中晚期基因功能提供了可靠手段，有助于深入理解胎盘发育机制。

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作者感谢以下资助来源：R01 MH122435、NIH T32GM008629 和 NIH T32GM145441。作者感谢爱荷华大学的 Val Sheffield 博士和 Calvin Carter 博士实验室提供手术室和设备的使用，同时也感谢 Eric Van Otterloo 博士、Nandakumar Narayanan 博士和 Matthew Weber 博士在显微成像方面的协助。作者还感谢 Sara Maurer 博士、Maya Evans 和 Sreelekha Kundu 在初步手术中的协助。

所有操作均按照联邦法规和爱荷华大学政策进行，并经机构动物护理和使用委员会批准。
1. 动物与饲养
<ol>
	<li>将动物置于12小时光照周期中，并提供食物和水 随意摄取.</li>
	<li>使用8-15周龄的CD-1雌性小鼠。通过检测交配栓的存在来确定E0.5。</li>
	<li>在E0.5天，将怀孕的母鼠单独饲养。</li>
</ol>
2. 微量移液器的校准
注意：应尽可能在手术前完成微量移液器的校准。
<ol>
	<li>在制备和校准微移液管之前，将所有质粒用无DNase的水稀释至推荐浓度（0.1 µg/µL）。将质粒与适当稀释的快绿染料（1 µg/µL，溶于PBS）混合（质粒终浓度：0.06 µg/µL）。</li>
	<li>使用拉针仪，采用长度为10 cm、外径为1.5 mm、内径为0.86 mm的玻璃毛细管拉制微电极。</li>
	<li>用无菌镊子小心折断微量移液器尖端（2-3 mm）。</li>
	<li>将微量移液器装入连接至显微注射仪的微毛细管尖端。确保显微注射仪已连接至显微注射装置，并且氮气储备充足，以校准微量移液器。</li>
	<li>将微移液管连接至显微注射仪后，用快绿染料溶液（1 µg/µL，溶于PBS）填充微移液管以进行校准。校准微移液管，使其注射体积约为3.5 µL。排空（&#34;清晰&#34;将微量移液器准备好，以便按如下步骤加载质粒溶液。 
	&#8203;注意：每支微量移液器的性能略有不同。为避免注射过程中损伤胎盘，注射时间应设置在0.5–1.5秒之间，压力应设置在1–8.5 psi之间。每支微量移液器需单独校准；若无法在此参数范围内完成校准，则不应使用。</li>
</ol>
3. 手术（图1A）
注意：准备时，使用70%乙醇清洁准备区域和手术区域的表面。在准备区域放置一张吸水垫。在手术区域，先放置加热垫，然后在其上方放置一张吸水垫。手术前对所有器械进行灭菌。麻醉状态下大鼠的持续时间应少于1小时。
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>在手术前30分钟至1小时，向妊娠母鼠给予5 mg/kg的非甾体抗炎药（美洛昔康）或另一种经批准的镇痛剂。</li>
		<li>将妊娠母鼠放入连接异氟烷挥发罐的诱导室中。</li>
		<li>将挥发罐设置为4%异氟烷和3.5 L/min氧气。</li>
		<li>当通过脚趾夹捏无反应且呼吸频率降低确认麻醉成功后，将母鼠从诱导室转移至准备区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术准备
	<ol>
		<li>在准备区域，将母鼠仰卧放置，并连接鼻罩。</li>
		<li>当母鼠处于鼻罩下时，将挥发罐调整至2%异氟烷和3.5 L/min氧气。</li>
		<li>彻底剃除母鼠腹部毛发&#160;并清除多余毛发。使用无菌棉签，交替涂抹聚维酮溶液和70%乙醇三次。最后再涂一层聚维酮溶液。为防止角膜干燥，在母鼠双眼上涂抹人工泪液凝胶（图2A，B）。</li>
		<li>完成准备后，将连接鼻罩的母鼠转移至指定的手术区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>子宫剖腹术 
	注意：整个手术过程中应佩戴无菌手套。若手套接触任何非无菌表面，应立即更换。&#160;
	<ol>
		<li>在手术区域，将母鼠仰卧放置，并用胶带固定鼻罩。将加热垫置于吸水垫下方，温度设定为45 °C。</li>
		<li>使用镊子和剪刀，沿中线切开约2 cm的皮肤切口。用镊子提起皮肤，做垂直切口。随后，再通过腹膜做另一个大小相似的切口，以暴露子宫角。在切开腹膜时，使用镊子提起腹膜并进行垂直切口（图2C，D）。 
		注意：若在切开腹膜时未能正确提起组织，可能导致肠管被意外切开，造成致命后果。</li>
		<li>通过切口轻轻按摩子宫角，按压腹部两侧实现。操作时仅用手指小心引导子宫，避免使用工具，以防意外损伤。将暴露的子宫置于覆盖母鼠腹部的无菌手术单&#160;上方&#160;，并在整个手术过程中用无菌生理盐水滴加保持湿润，生理盐水可根据需要预先加热至30 °C（图2E，F）。 
		注意：子宫角的识别方法可参考Wang等人的描述27。</li>
		<li>子宫暴露后，选择三对胎盘进行操作。 
		注意：胎盘的识别方法可参考Elmore等人的描述24。为最大程度提高胚胎存活率，处理的胎盘数量不应超过6个。若胚胎数量少于12个，则注射的胎盘不应超过4个。选择两个相邻的胎盘，其中一个接受对照注射，另一个接受实验质粒注射。使用两个相邻胎盘有利于在子宫内相似位置进行更准确的比较，同时提高胚胎存活率。所选胎盘对随机分布于两侧子宫角（图1B）。</li>
		<li>记录胎盘操作的位置以及胚胎在子宫角内的排列情况，以便在后续收集时能够识别胚胎和胎盘，因为单只母鼠将同时携带对照组和实验组处理的胎盘/胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照质粒的胎盘注射与电穿孔 
	注意：为保持无菌操作，使用冷灭菌剂对电穿孔电极板和微量注射器进行灭菌。若手套接触任何非无菌表面，应立即更换。&#160;
	<ol>
		<li>使用校准过的微量移液器，装载足够用于三次注射的适当对照质粒。所有注射均在胎盘侧向深度约0.5 mm处进行，位于蜕膜（白色）与连接区（深红色）之间（图3A-F）。</li>
		<li>对三个对照胎盘进行注射。 
		注意：为避免质粒通过微量移液器交叉污染，应在实验组注射前完成所有对照质粒的注射。这样可重复使用同一支微量移液器，若频繁更换移液器并重新校准，将显著延长手术时间并降低母鼠存活率。</li>
		<li>在注射后2分钟内，对注射了对照质粒的胎盘进行电穿孔。</li>
		<li>进行电穿孔时，使用连接电穿孔仪的一对3 mm电极板。为确保CRISPR整合效率及胚胎存活率，采用以下电穿孔参数：2个脉冲，30 V，脉冲持续30 ms，脉冲间隔970 ms，单极模式。</li>
		<li>注射后但在电穿孔前，立即在接触部位涂抹无菌生理盐水，使用滴管或注射器精确地将生理盐水滴加至子宫壁上的三个位点及电极板上。</li>
		<li>轻轻将电穿孔电极板压在胎盘的两侧。将阳极电极板置于注射部位上方，阴极电极板置于正对面（图4A-C）。</li>
		<li>按下电穿孔仪的脉冲按钮，待两个脉冲完成后，再移除电穿孔电极板。 
		注意：脉冲过程中，电极板与胎盘之间常可见少量白色泡沫。若未出现此现象，应在继续使用前用伏特表检测电极板电压。若伏特表读数与电穿孔设定电压不符，则电极板无法正常工作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验质粒的胎盘注射与电穿孔
	<ol>
		<li>使用实验质粒代替对照质粒，按照步骤3.4.1至3.4.2的相同说明进行操作。</li>
		<li>在注射后2分钟内，对全部三个注射实验质粒的胎盘进行电穿孔。操作方式应与对照质粒注射组相同。遵循步骤3.4.4至3.4.7。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术完成
	<ol>
		<li>胎盘操作完成后，仅用手指轻轻按摩子宫角，将其缓慢复位至腹腔内（图5A）。</li>
		<li>首先，使用长45 cm、带13 mm 3/8c针头合金的涂层编织可吸收缝线，对腹膜层进行双结单缝合。缝合间距为2–3 mm（图5B）。</li>
		<li>腹膜层缝合完成后，使用可吸收缝线缝合皮肤。单缝合处打三重结，间距2–3 mm，以确保母鼠无法自行解开缝线（图5C）。</li>
		<li>缝合完成后，将异氟烷调至1%，氧气保持3.5 L/min，并在皮肤缝合处涂抹组织粘合剂（图5D）。 
		注意：组织粘合剂为可选步骤，但建议使用，以防止母鼠啃咬导致切口重新打开。</li>
		<li>待组织粘合剂干燥后，关闭挥发罐，将母鼠从手术区域移出，仰卧放置于支持性笼具中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 术后护理与监测
<ol>
	<li>将怀孕的母鼠置于清洁的笼子中，在监护下恢复至少30分钟，以确保手术无即刻并发症。观察至其完全恢复行动能力，能够自行翻身站立。术后单独饲养母鼠。</li>
	<li>按照机构规定的术后护理和监测程序进行，直至胚胎采集。记录母鼠体重，并每日检查缝线及切口部位。</li>
</ol>
5. E14.5 胎盘采集
<ol>
	<li>在E14.5天，使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（1 mg/mL氯胺酮和0.1 mg/mL赛拉嗪）对母鼠进行深度麻醉，随后行颈椎脱位处死母鼠。</li>
	<li>用剪刀在母鼠腹部做V形切口，取出子宫，并立即置于冰上盛有5 cm培养皿中。使用镊子小心地从子宫中分离出胚胎及其对应的胎盘。 
	注意：请记录胚胎在子宫角中的位置及对应胎盘，以便确定手术过程中接受直接操作的胚胎。</li>
	<li>记录胎盘重量。使用无RNase的镊子和刀片，沿中线将胎盘切成两半。将其中一半放入4 °C的4%多聚甲醛（PFA）中固定。将另一半再均分为两份，剩余的两个四分之一部分分别存于−80 °C的两个离心管中，其中一份置于RNA保存试剂中。 
	&#8203;注意：胚胎及其他母体组织可在采集后储存于−80 °C，供后续使用。</li>
</ol>
6. 胎盘基因表达分析
<ol>
	<li>使用保存在 −80 °C RNA 保存试剂中的胎盘四分之一组织。</li>
	<li>按照 Elser 等人的方法，使用 Trizol 法提取 RNA，分光光度计测定 RNA 浓度，cDNA 合成试剂盒合成 cDNA，并使用 SYBR Green Master Mix 进行 qPCR 分析，对胎盘组织进行 qPCR 检测28。在 Trizol 法提取 RNA 后，不使用 Elser 等人提到的 Turbo DNAfree 试剂盒中的 DNase，而改用 RNA 纯化试剂盒，以确保样品中不含污染物28。 
	注意：请阅读 Trizol 的材料安全数据表（MSDS），并在化学通风橱中操作。</li>
	<li>使用 GFP 引物检测对照质粒的质粒插入情况，使用 BLAST 引物检测实验质粒的插入情况（引物列于补充表 1中）。通过 CT 值判断质粒是否存在。 
	注意：CT 值高于 35 的结果为假阳性，仅当 CT 值低于 35 时，才可视为质粒成功插入的阳性指标。</li>
	<li>检测IGF-1胎盘表达水平，并以看家基因18s进行标准化（引物列于补充表 1中）。采用 ddCT 法计算相对表达倍数，再将实验样本的标准化后表达倍数与对照样本的平均表达倍数进行比较。</li>
</ol>
7. 胎盘蛋白水平分析
<ol>
	<li>使用保存在 −80 °C 的胎盘四分之一部分。将组织在缓冲液中匀浆，缓冲液由 11.5 mM Tris HCl、5 mM MgCl2 和 10 mM 蛋白酶抑制剂溶于重蒸水（diH2O）配制而成，最终 pH 值为 7.4。使用手持式匀浆器和研杵破碎组织。 
	注意：样品体积不应超过缓冲液体积的 10%。</li>
	<li>将匀浆后的样品按 1:12 的比例用缓冲液稀释，使其处于双辛可宁酸法（BCA）检测试剂盒的可检测范围内。按照试剂盒说明书进行 BCA 检测，并使用酶标仪定量总蛋白含量。</li>
	<li>完成 BCA 检测后，参照 Gumusoglu 等人29 的方法，将所有样品归一化至相同的总蛋白浓度（2 mg/mL），用于后续胰岛素样生长因子-1（IGF-1）酶联免疫吸附测定（ELISA）。</li>
	<li>按照试剂盒说明书进行 IGF-1 ELISA 检测，并利用标准浓度曲线，通过酶标仪定量 IGF-1 蛋白水平。</li>
</ol>
8. 利用荧光原位杂交标记进行空间CRISPR验证
<ol>
	<li>将胎盘半块在4%多聚甲醛中于4 °C条件下固定1-3天后，转移至20%蔗糖溶液中于4 °C条件下浸泡，再置于最佳切割温度（OCT）包埋剂中冷冻。</li>
	<li>在−20 °C恒冷箱切片机中将OCT包埋的胎盘半块进行连续切片，切片厚度为10 µm，将切片转移至载玻片上用于标记。切片时应确保胎盘三个亚区均可见。切片载玻片于−80 °C保存至后续使用 原位 杂交。</li>
	<li>进行荧光检测 原位 杂交（FISH）标记，按照制造商的说明书进行操作。将一个载玻片与dCas9-3xNLS-VP64探针杂交，另一个载玻片 &#34;姐妹&#34; 同一胎盘切片使用Prl8a8探针的检测结果。 
	注意：dCas9-3xNLS-VP64 探针用于检测过表达质粒的存在。Prl8a8 探针可标记胎盘连接区的海绵状滋养层细胞，从而能够识别胎盘的不同亚区域。这两个探针分别标记在不同的 &#34;姐妹&#34; 避免多通道荧光与胎盘中绿色自发荧光之间的干扰。</li>
	<li>用检测染料（Opal 620）标记两个探针。完成FISH的厂商操作步骤后，加入DAPI封片剂，并在载玻片上加盖盖玻片。用透明指甲油密封盖玻片。</li>
	<li>使用直立式复合荧光显微镜对载玻片进行成像，并使用适当的图像处理软件进行处理。此处使用了 CellSens 软件。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

胎盘是胎儿生长的主要调控器官，如前所述，胎盘基因表达或功能的改变可能对胎儿发育产生显著影响6. 本方案可用于进行靶向 体内 利用相对先进的手术方法对小鼠胎盘进行CRISPR操作。该技术可获得大量存活胚胎及其对应胎盘，可用于后续研究图6A,B）。该技术使我们能够成功地过表达胎盘 IGF-1 在 E14.5（图7A,B）。所使用的质粒具有特异性，因为插入的质粒保留在经操作的胎盘中，而在相邻未处理的胎盘中未检测到。图7C,D）。其空间分布 IGF-1 通过FISH检测dCas9-3xNLS-VP64和Prl8a8的激活质粒，结果表明该激活质粒存在于IGF1-OE胎盘的三个亚区中，而在未经处理的胎盘任何亚区中均不存在图7E</...

胎盘是胎儿发育过程中至关重要的器官。胎盘的主要功能是提供必要的因子，并调控母体与胎儿之间营养物质和代谢废物的转运。哺乳动物的胎盘由胎儿组织和母体组织共同构成，形成母胎界面，因此母体和胎儿的遗传因素均会影响胎盘的功能1。胎盘的遗传异常或功能受损会显著改变胎儿的发育过程。既往研究表明，胎盘的遗传特征和发育状况与胎儿特定器官系统的发育异常密切相关。特别是胎盘的异常与胎儿大脑、心脏及血管系统的改变存在关联2,3,4,5。
激素、生长因子及其他分子从胎盘向胎儿的转运在胎儿发育过程中起着重要作用6。研究表明，改变胎盘中特定分子的生成可影响神经发育。母体炎症可通过改变胎盘中色氨酸（TRP）代谢相关基因的表达，增加血清素的生成，进而导致胎儿大脑中血清素的积聚7。其他研究发现胎盘异常常伴随心脏缺陷。目前认为，胎盘的异常可能促进先天性心脏病的发生，而先天性心脏病是人类最常见的出生缺陷8。最近一项研究鉴定出多个在胎盘和心脏中具有相似细胞通路的基因。若这些通路受到干扰，可能导致两个器官同时出现缺陷9。胎盘的缺陷可能加剧先天性心脏病的严重程度。胎盘遗传学及其功能对特定胎儿器官系统发育的影响，正成为一个新兴的研究领域。
小鼠具有血绒毛膜胎盘及其他与人类胎盘相似的特征，这使其成为研究人类疾病的高度有用模型1尽管胎盘具有重要意义，但目前仍缺乏针对性的 体内 基因操作。此外，目前在胎盘中可用于基因敲除或基因沉默的技术选择，多于基因过表达或功能获得性操作的方法10存在多种转基因 Cre-表达谱系特异性操控的胎盘细胞系，分别在不同时间点针对不同的滋养层细胞谱系。这些包括 Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER，以及 Gcm1-Cre11,12,13,14。尽管这些 Cre 转基因技术虽然高效，但可能无法在特定时间点操控某些基因。另一种常用的方法是将慢病毒载体插入囊胚培养物中，以实现对胎盘基因表达的敲除或过表达，该方法可引起滋养层特异性的遗传操作15,16该技术可在发育早期有效改变胎盘基因表达。RNA干扰技术的应用 体内 在胎盘中的应用较为有限。shRNA质粒的插入操作可参照本文所述CRISPR技术进行，已有研究在E13.5时期成功实现靶基因表达的下调 PlGF 胎盘中的表达对子代脑血管系统的影响17.
除了主要用于基因敲除或基因沉默的技术外，诱导过表达通常通过腺病毒或外源蛋白插入实现。用于过表达的技术成功率各异，且大多在妊娠中后期实施。为研究胰岛素样生长因子1（IGF-1）在胎盘功能中的作用，采用腺病毒介导的胎盘基因转导技术以诱导IGF-1的过表达 IGF-1 基因18,19在小鼠妊娠晚期的E18.5天进行 通过&#160;直接胎盘注射。为了提供更多的选择，并避免已建立的胎盘基因操作方法可能出现的失败，例如 Cre-Lox 组合失败、腺病毒可能存在的毒性以及shRNA的脱靶效应， 体内 直接对胎盘进行CRISPR操作可用于20,21,22该模型的开发旨在解决过表达模型的缺乏问题，并构建一个具有灵活性的模型。
该技术基于 Lecuyer 等人的研究，其中 shRNA 和 CRISPR 质粒被直接靶向 体内 小鼠胎盘以改变 PlGF 表达17该技术可用于在多个时间点通过CRISPR操作直接改变胎盘基因表达；本研究选择了E12.5时间点。此时胎盘已发育成熟且体积足够大，便于操作，可在E12.5时插入特定的CRISPR质粒，从而对妊娠中期至晚期的胎儿发育产生显著影响23,24与转基因方法不同，但类似于病毒诱导或RNA干扰技术，该方法通过一种相对先进的外科手术手段，可在特定时间点实现基因的过表达或敲除，从而避免因早期改变导致的胎盘形成障碍或胚胎致死。由于每窝动物中仅有少数胎盘接受了实验或对照质粒，该方法可提供两种类型的内部对照：一种是注射并电穿孔了相应对照质粒的胎盘，另一种是未接受任何直接操作的胎盘。该技术已优化用于实现基因的过表达 IGF-1 小鼠胎盘中的基因 通过 一种协同激活介质（SAM）CRISPR质粒。该 IGF-1 选择该基因是因为IGF-1是一种重要的生长激素，在出生前主要由胎盘产生并输送给胎儿25,26这种新型的胎盘靶向CRISPR技术将实现直接操控，有助于阐明胎盘功能与胎儿发育之间的关联。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>USA Scientific 公司</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>PBS 中的 4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J61899.AP</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>科宁斯</td><td>3598</td><td>对于BCA试剂盒</td></tr><tr><td>吸水垫</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>激活对照质粒</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-437275</td><td>用于稀释的无DNase水</td></tr><tr><td>AMV逆转录酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0277L</td><td>用于cDNA合成</td></tr><tr><td>麻醉气体蒸发器</td><td>Vetamac</td><td>VAD-601TT</td><td>VAD-compact 蒸发器</td></tr><tr><td>人工泪液凝胶</td><td>阿克恩</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23227</td><td>蛋白质定量</td></tr><tr><td>Biovortexer</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>198050000</td><td>手持式组织匀浆器</td></tr><tr><td>CellSens 软件</td><td>Olympus</td><td>V4.1.1</td><td>FISH图像的图像处理</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>平板离心机</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J67241-AP</td><td>RNA提取</td></tr><tr><td>棉签</td><td>ProAdvantage</td><td>77100</td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 对照质粒</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-418922</td><td>用于稀释的无DNase水</td></tr><tr><td>CryoStat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>M125 C</td><td>用于尸体解剖后成像</td></tr><tr><td>可吸收缝线</td><td>医学与兽医国际</td><td>J385H</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Gibco</td><td>15230162</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190144</td><td>(-) 钙；(-) 镁</td></tr><tr><td>ECM 830 电穿孔仪（电穿孔设备）</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0662</td><td>发电机仅</td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td>Wahl</td><td>CL9990</td><td>Kent Scientific</td></tr><tr><td>电穿孔板/镊子电极</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td>3 mm 直径电极片；包含导线</td></tr><tr><td>包埋盒：250 个/包</td><td>格雷格纳</td><td>21RK94</td><td>胎盘包埋盒</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>268280010</td><td></td></tr><tr><td>F-Air 采气罐</td><td>Penn Veterinary Supply 公司</td><td>BIC80120</td><td>过量异氟烷过滤器</td></tr><tr><td>快绿FCF染料</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>溶解至1 &amp;mu;g/ml，过滤；避光</td></tr><tr><td>基于滤光片的微孔板光度计（酶标仪）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14377576</td><td>可用于 BCA 和 ELISA</td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>精细尖头，直刃，锯齿状</td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管 - 硼硅酸盐玻璃（微量移液管）</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-10</td><td>外径：1.5 mm，内径：0.86 mm，长度：10 cm</td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（100倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1861281</td><td>蛋白匀浆缓冲液</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Thermotech</td><td>S766D</td><td>数字控温加热湿敷垫</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>VWR</td><td>10806-188</td><td>完全饱和的下颌；弯曲</td></tr><tr><td>热水浴</td><td>Fisher Scientific</td><td>20253</td><td>Isotemp 205</td></tr><tr><td>Igf-1 SAM 质粒 (m1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-421056-ACT</td><td>用于稀释的无DNase水</td></tr><tr><td>诱导室</td><td>Vetamac</td><td>941443</td><td>无需特定的升数规格</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Pharma Limited</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇/2-丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮 100 mg/ml</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-114-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2/氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td>1M 蛋白匀浆缓冲液</td></tr><tr><td>MicroAmp&amp;trade; 带条形码的光学384孔反应板</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>无需条形码板</td></tr><tr><td>微毛细管尖端</td><td>Eppendorf</td><td>5196082001</td><td>连接至 BTX 显微注射仪</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0766</td><td>不锈钢移液器架，130 mm 长，适用于 1 至 1.5 mm 移液器</td></tr><tr><td>Microject 1000A（注射装置）</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0751</td><td>MicroJect 1000A Plus 系统</td></tr><tr><td>显微注射仪 P-97 型</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown型微电极拉制仪</td></tr><tr><td>微孔板混合器（板式摇床）</td><td>scilogex</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>小鼠/大鼠IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA试剂盒</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>MG100</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>BD - 贝克顿·迪金森公司</td><td>305106</td><td>30 G × 1/2（0.3 mm × 13 mm）</td></tr><tr><td>氮气罐</td><td>Linde</td><td>7727-37-9</td><td>任何惰性气体</td></tr><tr><td>非甾体抗炎药（NSAID）</td><td>诺布鲁克实验室有限公司</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>镇痛药，例如美洛昔康</td></tr><tr><td>鼻锥</td><td>Vetamac</td><td>921609</td><td>9-14 毫米</td></tr><tr><td>Opal 620 检测染料</td><td>Akoya Biosciences</td><td>SKU FP1495001KT</td><td>用于FISH</td></tr><tr><td>最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂</td><td>樱花</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>氧气瓶</td><td>Linde</td><td>7782 - 44 - 7</td><td>医用级氧气</td></tr><tr><td>研钵杵</td><td>USA Scientific 公司</td><td>14155390</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液，5%</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>NDC 67618-155-16</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR&amp;trade; 绿色 PCR 预混液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4367659</td><td>用于qPCR</td></tr><tr><td>随机六聚体（随机引物）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>S1330S</td><td>用于cDNA合成</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>格雷格纳</td><td>26X080</td><td></td></tr><tr><td>RNA纯化试剂盒 &amp;和浓缩器</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope试剂盒v.2.5</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>323100</td><td>包含荧光原位杂交所需的所有试剂。探针需单独购买。</td></tr><tr><td>RNAscope&amp;trade; 探针-Mm-Prl8a8-C2</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>&amp;nbsp;528641-C2</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope&amp;trade; 探针-载体-dCas9-3xNLS-VP64</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>527421</td><td></td></tr><tr><td>Roto-Therm Mini</td><td>基准测试</td><td>R2020</td><td>原位杂交用干烤箱</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>解剖剪，尖头，4&amp;sup1;/?</td></tr><tr><td>氯化钠（生理盐水）</td><td>Hospra</td><td>NDC 0409-4888-03</td><td>无菌的，&amp;nbsp; 0.9%</td></tr><tr><td>柠檬酸钠二水合物，三钠盐，[柠檬酸三钠二水合物]</td><td>Research Product International</td><td>03-04-6132</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Chemical 1N 氢氧化钠浓缩液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS277</td><td>蛋白匀浆缓冲液</td></tr><tr><td>蒸锅</td><td>贝拉</td><td>B00DPX8UBA</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>Busse</td><td>696</td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath 盖玻片 24x60</td><td>Leica</td><td>3800160</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD - 贝克顿·迪金森公司</td><td>309659</td><td>BD鲁尔滑动针头注射器，无菌，一次性使用，1 mL</td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技&amp;trade; Invitrogen&amp;trade; Nanodrop&amp;trade; 一台带WiFi功能的Qubit荧光计&amp;trade; 4 氟光计</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-400-525</td><td>此配置随 Qubit 4 荧光仪提供。&amp;nbsp; 无需进行Qubit定量。</td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>VetBond</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15568025</td><td>1M 蛋白匀浆缓冲液</td></tr><tr><td>TRIzol&amp;trade; 试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15596018</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>TSA缓冲液套装</td><td>Advanced Cells Diagnostics</td><td>322810</td><td>用于稀释 Opal 620 检测染料</td></tr><tr><td>通用F-电路</td><td>Vetamac</td><td>40200</td><td>连接至蒸发器及蒸发器配件</td></tr><tr><td>正置复合荧光显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>BX61VS</td><td>用于FISH成像</td></tr><tr><td>含DAPI的Vectorshield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>盖玻片封片介质</td></tr><tr><td>ViiA&amp;trade; 7实时荧光定量PCR系统，配备384孔反应模块</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4453536</td><td>这是用于SYBR 384孔板检测。&amp;nbsp; TaqMan 和/或较小的片段可供使用</td></tr><tr><td>Wet n Wild 指甲油 Wild Shine，透明指甲保护剂，指甲彩绘</td><td>亚马逊</td><td>C450B</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 20mg/ml</td><td>Anased</td><td>343730_RX</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠 体内 胎盘靶向crispr操作

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

胎盘是一种关键器官，可调节并维持哺乳动物的发育 在子宫内胎盘负责母体与胎儿之间的营养物质和废物交换，以及生长因子和激素的产生与输送。在小鼠中进行胎盘特异性的遗传操作对于理解胎盘在产前发育中的特定作用至关重要。目前使用的胎盘特异性表达Cre的转基因小鼠在效率上存在差异，因此其他胎盘基因操作方法可作为有益的替代方案。本文描述了一种利用CRISPR基因编辑技术直接调控胎盘基因表达的方法，可用于改变特定靶基因的表达水平。通过相对精细的外科手术操作，在胚胎发育第12.5天（E12.5）对怀孕母鼠实施剖腹手术，使用玻璃微量移液管将CRISPR质粒分别注入各个胎盘组织中，每次注射后立即进行电穿孔转染。母鼠术后恢复后，胎盘和胚胎可继续发育，直至在后续时间点进行分析评估。通过该技术处理后对胎盘及子代的检测，可揭示特定发育时期胎盘功能在胚胎发育过程中的作用。此类基因操作手段将有助于更深入地理解在多种疾病背景下，胎盘遗传机制与功能如何影响胎儿的生长与发育。

关键词：胎盘, 基因操作, CRISPR, 电穿孔, 胚胎发育, 小鼠模型, 胎儿生长, 转基因技术, 剖腹手术, 基因表达调控

常规实验流程结果（图6) 
在本研究中，共有三个被操纵的组别，包括注射了通用CRISPR Cas9对照质粒（Cas9 Control）、激活对照CRISPR质粒（Act Control）或一个 IGF-1 SAM激活质粒（Igf1-OE）。Cas9对照更适合敲除质粒，而激活对照更适合过表达/激活质粒。用于评估通过操控胎盘所引起的活力变化 通过 注射与电穿孔后，于E14.5分析同窝胚胎的存活情况（图6A）。选择这一时间点是因为其他已开展的研究也曾进行过该操作 体内 通过电穿孔插入CRISPR质粒已表明，可在8–22小时内实现基因表达变化30,31,32在E14.5时进行收集，可使CRISPR质粒有大约48小时的...

本文介绍了一种时间特异性方法，可有效调控小鼠胎盘中关键的发育通路 体内通过在胚胎发育第12.5天向妊娠母鼠胎盘注射CRISPR质粒并进行电穿孔来完成该操作。

小鼠 体内 胎盘靶向CRISPR操作

胎盘是一种关键器官，在哺乳动物的子宫内发育过程中起到调节和维持作用。胎盘负责营养物质的转运……

该方案具有重要意义，因为它能够利用CRISPR技术对小鼠胎盘进行时间特异性的靶向操作。这将使研究人员能够阐明妊娠中晚期特定基因的功能。在小鼠胎盘内引起基因过表达的遗传操作极为罕见。该技术的主要优势在于能够实现胎盘内多种基因表达水平的变化。如果初步尝试该技术未获成功，切勿气馁。由于该技术难度较高，需要投入相当多的时间进行练习才能掌握。首先，将麻醉后的母鼠仰卧位放置于准备区域，并使用鼻罩维持麻醉状态。彻底剃除母鼠腹部的毛发。为防止角膜干燥，将人工泪胶滴于母鼠双眼表面。然后使用无菌棉签，以聚维酮碘溶液对手术部位进行至少三轮交替消毒，每轮聚维酮碘消毒后使用70%乙醇，最后再涂布一层聚维酮碘溶液。消毒完成后，将带有麻醉鼻罩的鼠袋移至指定手术区域。进行子宫剖腹手术时，将鼠袋仰卧置于手术台上，并用胶带固定鼻罩位置。将加热垫放置在吸水垫下方，并调至45摄氏度。通过确认脚趾夹捏反射消失以验证麻醉深度后，使用镊子和剪刀在绷起的皮肤上做一条长约两厘米的正中切口。然后使用无菌镊子将腹膜轻轻提起，远离子宫角，再通过腹膜做垂直切口。通过用手指按压腹部两侧，按摩两个子宫角以进行引导。将暴露的子宫置于覆盖在下腹部的无菌手术单上，并根据需要滴加温热的无菌生理盐水以保持湿润。子宫暴露后，选取三对胎盘用于操作。记录胎盘操作的位置以及胚胎在子宫角内的排列情况。对于对照质粒的胎盘注射，使用校准过的微量移液器吸取足量的相应对照质粒，以满足三次注射所需。所有注射均应在蜕膜与连接区之间进行，进针深度约为0.5毫米，横向进入胎盘组织。注射后、电穿孔前立即用无菌生理盐水涂抹接触部位，使用滴管或注射器将生理盐水精确涂于子宫壁的三个位点以及电极板上。注射后两分钟内，使用连接至电穿孔仪的一对3毫米电极板进行电穿孔。为确保CRISPR的整合效率及胚胎存活率，将参数设置为30伏、30毫秒脉冲、2次脉冲、脉冲间隔970毫秒、单极模式。轻轻将电穿孔电极板按压在胎盘侧方的子宫壁上。将阳极电极板置于注射部位，阴极电极板置于其正对侧。启动电穿孔仪的脉冲按钮，待两次脉冲完成后再移除电穿孔电极板。然后按照之前展示的方法进行实验质粒的胎盘注射。在注射后两分钟内，对所有三个注射了实验质粒的胎盘进行电穿孔，操作方式与对照组相同。胎盘操作完成后，仅用手指轻轻按摩子宫角，将其缓慢推回腹腔内。使用长度为45厘米、带涂层的编织可吸收缝合线，配合13毫米、三八圆弧形针头合金，对腹膜层进行间断缝合。腹膜层缝合完毕后，采用与腹膜缝合相同类型的可吸收缝合线对皮肤进行缝合。缝合完成后，在皮肤缝合处涂抹组织粘合剂。当组织粘合剂干燥后，关闭蒸发器，并将动物从手术区域转移至背部朝上的支撑笼中。胎盘被注射了通用的 CRISPR Cas9 空载质粒和激活对照 CRISPR 质粒，或 IGF-1 SAM 激活质粒。代表性尸检后图像显示，各处理组均未出现明显损伤或表型外观改变。未处理胚胎在操作后的产仔中存活率下降至平均79.05%，而操作胚胎的存活率显著降低，平均为55.56%。各组胎盘重量之间无显著差异。手术后母体体重增加与假手术组相比无显著差异。许多妊娠母鼠在术后当天出现轻微体重下降或体重无变化，可能由于手术期间及术后短暂时间内进食受到干扰所致。大多数母鼠在E14.5时体重增加，但偶尔仍可观察到体重下降。qPCR结果显示，与对照组胎盘相比，IGF-1过表达胎盘中IGF-1的表达显著升高。对E14.5胎盘进行的ELIZA检测显示，与对照组胎盘相比，IGF-1过表达胎盘中的IGF-1蛋白水平显著升高。绿色自发荧光显示了胎盘母胎界面的亚区域，仅在IGF-1过表达胎盘中观察到红色Cas9标记，表明CRISPR已在胎盘全部三个亚区域成功整合。C2原位杂交荧光标记证实了IGF-1激活质粒的整合，且未向未经处理的胎盘发生迁移。通过Prl8a8染色标记的红色连接区周围，可识别出蜕膜层和迷路区。请务必记录胎盘及其对应胚胎的操作类型和位置。强烈建议记录子宫角内宫颈以及胚胎的位置。完成此操作后，可对胎盘、胚胎及母体进行分析。这将有助于更深入地理解基因在妊娠、胎盘功能和胚胎发育中的胎盘特异性作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

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小鼠体内胎盘靶向CRISPR操作

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