Name: 使用加热块确定浮游动物的热限值 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 了解如何使用加热块构建温度梯度来测定海洋无脊椎动物幼虫的热限值。本方案以沙钱幼虫为对象，通过逻辑回归分析存活率，为评估气候变化对海洋生物的影响提供可靠方法。

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本工作由斯沃斯莫尔学院教员研究基金 [KC] 以及罗伯特·雷诺兹和露辛达·刘易斯 '70 暑期研究奖学金（授予 BJ）资助。

1. 加热块的制备
<ol>
	<li>将120 V、100 W的条状加热器连接至变阻器（参见 材料表).</li>
	<li>通过在铝块上钻出60个呈6×10网格排列的孔洞（见 材料表）。确保孔与孔之间在两个方向上的中心间距为 2 cm，每个孔的直径为 1.1 cm，深度为 4.2 cm（图1). 
	注意：在铣床或钻床上使用高速钢钻头进行钻孔。加热元件和冷却元件均被选择为尽可能覆盖15.2 cm × 5 cm接触表面的大部分区域。</li>
	<li>在其中一个20.3 cm × 5 cm的表面上，于1之间再钻两个孔st 和 2nd 柱和9th 和 10th 柱，尺寸与温度控制器探头相匹配（参见 材料表).</li>
	<li>使用1.2厘米（0.5英寸）透明亚克力板构建一个外壳（参见 材料表）以固定各部件并为完成的加热块提供绝缘。使用两层丙烯酸材料对加热元件的背面进行绝缘（图1).</li>
	<li>在最终组装时，涂抹导热硅脂（参见 材料表以最大化加热元件向金属块以及金属块向冷却元件的热传导。</li>
</ol>
2. 热梯度设置的确定
<ol>
	<li>使用Tygon管将水浴槽/水族箱冷却器连接（参见材料表）。根据需要使用泡沫管绝缘材料对管道进行隔热。</li>
	<li>将温控探头插入铝块侧面的孔中。确保探头1位于加热元件附近。</li>
	<li>将装满自来水（1.5 mL）的微量离心管插入所有铣削孔中（共60个管）。</li>
	<li>打开温度控制器，将探头1的停止加热温度设置为35–37 °C，探头2设置为21.5–22.5 °C。 
	注意：所用温控器具有两个独立运行的输出端口；在此特定应用中，仅使用探头1来调节高温端。因此，将探头2的温度设为低温端温度。</li>
	<li>旋转调压变压器以启动加热元件，并将其调至中档。</li>
	<li>打开水浴槽/水族箱冷却器，并将冷却器温度设为15 °C。</li>
	<li>10分钟后检查铝块一端是否变热，另一端是否变冷。 
	警告：加热元件的裸露部分可能很烫，请勿触碰。</li>
	<li>此后每隔10分钟使用带有K型电极的热电偶（参见材料表）检测每个微量离心管内的温度。约60分钟后温度将趋于稳定，并呈现线性分布（图2）。</li>
	<li>根据需要调整温度控制器和水浴装置的设置，以校准两端温度值。</li>
</ol>
3. 热暴露及活细胞：死细胞计数
注意：一旦确定了温度梯度的所需设置，即可省略步骤2。
<ol>
	<li>开启循环水浴和加热器，并分别设置为 15 °C 和 37 °C，以形成从 19.5 °C 到 37 °C 的温度梯度。</li>
	<li>为确保热梯度呈线性分布，将装满自来水（1.5 mL）的微量离心管插入所有铣削孔中（共 60 支管）。</li>
	<li>等待 45–60 分钟，使加热模块达到设定温度。使用带有 K 型电极的热电偶测量每支微量离心管内的温度，确认其是否达到预期温度，并记录这些温度值。</li>
	<li>若研究对象的个体尺寸&#62;500 µm，且易于从一个容器转移至另一容器（例如桡足类），则在 1.5 mL 微量离心管中加入 750 µL 的 0.45 µm 滤海水；反之，若研究对象体型较小，则在 1.5 mL 微量离心管中加入 250 µL 的 0.45 µm 滤海水。 
	注：代表性数据中使用了沙钱（Dendraster excentricus）受精后第 2、4 和 6 天的幼体（参见材料表）。这些个体的平均大小（± 标准差，n = 15，每个年龄组）分别为 152 ± 7 µm、260 ± 17 µm 和 292 ± 14 µm。由于这些幼体易于浓缩（见步骤 3.5），因此微量离心管中均加入 750 µL 滤海水。</li>
	<li>通过反向过滤法浓缩研究对象的培养液（即将筛网置于盛有研究对象的容器中，从筛网上方抽除水分），使研究对象保留在烧杯底部11。 
	注：本实验中所用沙钱幼体采用 30 µm 尼龙筛网（参见材料表）。</li>
	<li>用滤海水冲洗浓缩后的动物样品（例如在使用藻类食物或其他化学物质培养时）。再进行一次反向过滤，以进一步浓缩动物样品。</li>
	<li>将已知数量的个体放入半满的微量离心管中。在体视显微镜下计数小型浮游生物（参见材料表），并使用玻璃巴斯德移液管进行转移。 
	注：放入的生物数量取决于其大小；对于约 200 µm 大小的沙钱幼体，每支微量离心管放入 20 个个体较为合适。 
	注意：优先使用玻璃移液管而非塑料移液管，因为某些浮游生物具有疏水性，会粘附在塑料表面。</li>
	<li>向含有动物的微量离心管中加入 0.45 µm 滤海水，直至最终体积为 1 mL。</li>
	<li>为使生物逐步升温至目标实验温度，将步骤 3.7 中准备好的含动物的微量离心管从加热模块的低温端开始放置。每排放置一对微量离心管（共 12 支管）。</li>
	<li>静置 10 分钟。</li>
	<li>将步骤 3.9 中插入的成对微量离心管移至相邻温度更高的钻孔中，并在每排的低温端补充新的成对微量离心管。此时每排将有四支管。再静置 10 分钟。</li>
	<li>持续以成对方式将含动物的微量离心管从低温端向高温端移动并补充新管，每次移动后静置 10 分钟，直至加热模块完全填满。 
	注：步骤 3.9–3.12 被视为升温阶段，旨在使研究对象经历的温度逐步升高。</li>
	<li>让动物在指定温度下孵育 2 小时。此步骤为实验的恒温暴露阶段。
	<ol>
		<li>若孵育时间超过 2 小时，应每小时使用热电偶检测一次微量离心管的温度。 
		注：根据实验需求调整孵育时间。若孵育时间超过 2 小时，需定期使用热电偶检查管内温度，以防设备意外故障。为尽量减少对研究对象的干扰，可随机将六支或更多仅含滤海水的微量离心管插入模块中用于温度监测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育结束后，使用带 K 型电极的热电偶测量每支微量离心管内的温度，并记录这些数值。</li>
	<li>取出全部 60 支含动物的微量离心管，并将其放入预先标记好的支架中。</li>
	<li>将这些管（步骤 3.14）在预定温度（如培养温度）下继续孵育 1 小时，作为恢复期。 
	注：恢复期时长可能因物种而异。对于沙钱幼体，培养温度为 18 °C，因此样品被置于环境培养箱中。请参考相关文献和/或开展预实验，以确保存活与死亡计数不受恢复期长短的影响。在代表性数据中，恢复 1 小时后存活的动物数量与恢复 12 或 24 小时后的数量一致。</li>
	<li>为统计热暴露后存活的研究对象比例，使用玻璃移液管将单支微量离心管的内容物转移至 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>在体视显微镜下观察并记录仍具活动能力（存活）的个体数量，以及停止游动或溶解（死亡）的个体数量。确保观察到的个体总数等于步骤 3.7 中放入管内的数量。若数量不符，应检查微量离心管壁及培养皿边缘是否有遗漏个体。</li>
</ol>
4. LT50 的计算
<ol>
	<li>生成一个 CSV 格式的表格，至少包含以下列标题：感兴趣的分组变量、试管温度（°C）、存活个体数和死亡个体数。 
	注意：在代表性数据中，感兴趣的分组变量被“年龄”替代，因为目标是比较不同年龄组之间的差异。</li>
	<li>为使用逻辑回归拟合数据，应采用二项分布的广义线性模型。补充代码文件 1 展示了使用开源软件 R22 的示例脚本。</li>
	<li>为确定中位上临界热耐受值（LT50），需计算个体存活率为 50% 时对应的预测变量值（即温度）。补充代码文件 2 展示了在 R22 中使用 MASS23 包的 dose.p 函数的示例脚本。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案通过急性热暴露，提供了一种简便且可定制的方法，用于测定小型浮游生物的热耐受极限。该装置采用10孔设计，低温端由水浴控制，高温端由加热器控制，具有灵活的温度终点设置，可精确测定LT50。使用该方法可检测到小于&lt;1 °C的热耐受差异（图3）。该方法可在数小时内快速测定多种物种的热耐受极限，所得数据已应用于多个物种分布模型2,21。然而需要注意的是，与慢性暴露相比，急性暴露所获得的热耐受估值可能存在差异8,26。
当前设计的一个主要优势是，在较小的空间（20.3 cm × 15.2 cm × 5 cm）内即可实现10个温度处理和6个重复。以往采用类似热梯度方法测定热耐受极限的研究使用了更大的铝制导热条（例如，文献27...

耐热性对生物体的生存和功能至关重要1,2。由于人类活动导致的碳排放持续引起地球变暖，人们对热耐受极限的测定及其应用日益关注3。已有多种终点指标被用于确定生物的上限和下限热耐受极限，例如死亡、发育失败以及运动能力丧失等4。这些热耐受极限通常被用作生物体热生态位的替代指标。该信息进而可用于识别对全球变暖更为脆弱的物种，并预测未来物种的分布格局及其相互作用关系3,5,6,7。然而，确定热耐受极限，特别是对于小型浮游生物而言，仍具有挑战性。
对于浮游生物，特别是海洋无脊椎动物的幼虫阶段，其热耐受极限可通过长期暴露实验来确定。长期暴露实验通过在数天至数周内将幼虫在多个不同温度下培养，并确定导致幼虫存活率和/或发育速率下降的温度来实现8,9,10。然而，这种方法较为耗时，且需要大型培养箱以及幼虫培育方面的经验（有关海洋无脊椎动物幼虫培养的入门介绍，请参见参考文献11）。
此外，也可通过急性热应激暴露来确定生物的耐热极限。该方法通常包括将装有幼虫的小瓶置于温度可控的干浴器中12,13,14，利用PCR仪的温度梯度功能15,16，或将玻璃小瓶或微量离心管放置于大型铝块的孔洞中，铝块两端分别施加加热和冷却以形成温度梯度，小瓶紧密嵌入孔中17,18,19。典型的干浴器仅能产生单一温度，因此需同时运行多个设备以评估不同温度下的表现。热循环仪可生成温度梯度，但仅适用于小体积样品（120 µL），且操作需格外谨慎。与热循环仪类似，大型铝块可建立线性且稳定的温度梯度。这两种方法均可结合逻辑回归或概率单位回归分析，计算导致50%个体死亡的致死温度（LT50）12,20,21。然而，所用铝块长度约为100 cm，占用较大的实验室空间，且需要专用的数控铣床来钻孔。此外，还需配备两台科研级水浴装置以维持目标温度，整套装置的构建成本较高。
因此，本研究旨在利用市售部件开发一种替代方法，以产生稳定的线性温度梯度。该装置应具有较小的占用空间，并能够方便地用于浮游生物的急性热应激暴露实验。本实验方案以体型小于&#60;1 mm的浮游动物为研究对象，因此已针对1.5 mL或2 mL微量离心管的使用进行了优化。对于体型更大的研究对象，则需要使用大于1.5 mL微量离心管的容器，并扩大铝块上的孔径。
除了提高实验装置的可及性之外，本研究&#160;旨在&#160;简化数据处理流程。尽管商业统计软件提供了使用逻辑回归或概率回归计算 LT50 的常规方法，但其授权费用不容忽视。因此，依赖开源统计软件 R22 的易用脚本将使数据分析更加便捷。
本方案展示了如何使用市售部件制作一个紧凑型加热块，并将其应用于对浮游动物（沙钱Dendraster excentricus的幼虫）施加急性热应激，以确定其最高耐热极限。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;micro;m 膜过滤器</td><td>VWR</td><td>74300-042</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; 丙烯酸板</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K266</td><td>用于构建具有足够隔热性能的刚性外壳。</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>VWR</td><td>76290-420</td><td></td></tr><tr><td>双通道 7 型热电偶数据记录仪</td><td>Omega Engineering</td><td>HH506A</td><td>可用任何可放入微型离心管的温度计替代</td></tr><tr><td>自动移液器&amp;nbsp;</td><td>Ranin&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带 430 不锈钢护套的螺栓和夹具安装条形加热器&lt;br/&gt; 120V 交流，1-1/2&quot; 宽，100W</td><td>McMaster-Carr</td><td>3619K32</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Sea 生物测定混合物</td><td>Pentair</td><td>CM2B</td><td>用于配制人工海水&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Denraster excentricus&lt;/em&gt;</td><td>M-Rep&amp;nbsp;</td><td></td><td>来自加利福尼亚的沙钱&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>解剖显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>DIYhz 铝制水冷块，适用于 PC 计算机 CPU 图形散热器的液态水冷却散热系统，吸热头银色（40 mm x 120 mm x 12 mm）</td><td>Amazon</td><td></td><td>连接至水浴，用于冷却模块的一端。</td></tr><tr><td>易加工 MIC6 铸造铝板，厚度 2&quot;，尺寸 8&quot; x 8&quot;&amp;nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>86825K953</td><td>加工成 2&quot; x 6&quot; x 8&quot;，带有 60 个等距孔（直径 11 mm，深度 42 mm），并在一侧额外钻两个孔用于恒温探头。</td></tr><tr><td>经济型柔性聚乙烯泡沫管绝缘材料</td><td>McMaster-Carr</td><td>4530K121</td><td>覆盖在冷却器与模块之间的塑料管上，以减少热量损失。若温度范围接近室温，可省略&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EVERSECU 72w 110-240v 水族箱水冷加热/冷却温度控制器，适用于鱼虾缸、海洋珊瑚礁缸，适用于 20 L/30 L 以下水族箱冷却器</td><td>Amazon</td><td></td><td>可替代实验室级水浴&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>以幼体沙钱为例&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENNEL 100 g 银色硅胶导热硅脂，适用于 GPU、CPU、IC、LED、烤箱冷却</td><td>Amazon</td><td></td><td>提高模块与加热和冷却元件之间的热传导效率。</td></tr><tr><td>Inkbird WiFi 爬行动物恒温控制器，带两个探头和两个输出口，IPT-2CH 爬行动物加热垫恒温器（每输出口最大 250 W）</td><td>Amazon</td><td></td><td>监测热端和冷端，维持热端在设定范围内</td></tr><tr><td>Lauda Ecoline Silver 风冷式制冷循环器</td><td>VWR</td><td>89202-386</td><td>可用 aquarium chiller 替代&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微型离心管</td><td>VWR</td><td>76019-014</td><td>若使用较大的动物，可选用扫描瓶（VWR 66022-004）作为替代方案&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nitex 网格滤膜</td><td>&amp;nbsp;自制</td><td></td><td>使用热熔胶将 Nitex 网格固定在 1/2&quot; PVC 管上&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（0.35 M）&amp;nbsp;</td><td>Millpore-Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>R 统计软件&amp;nbsp;</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>VWR</td><td>89219-346</td><td>根据目标生物的大小，可选用 14 号或 16 号规格的针头</td></tr><tr><td>Tygon 管&amp;nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233K65</td><td>可根据所用冷却器和模块调整尺寸&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zoo Med Repti Temp 可变电阻恒温器</td><td>Chewy.com</td><td></td><td>额定功率 150 W，已重新布线以直接向加热元件供电，用于控制热量输出速率</td></tr></tbody></table>

利用加热块测定浮游动物的热耐受极限

Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block

温度耐受极限和耐受范围被广泛用于预测物种分布。随着全球气温持续上升，了解温度耐受极限如何随驯化而变化，以及其在不同生活阶段和种群间的差异，对于评估物种在未来变暖环境下的脆弱性至关重要。大多数海洋生物具有复杂的生活史，包含早期浮游阶段。尽管量化这些微小早期发育阶段（数十至数百微米）的温度耐受极限有助于识别发育瓶颈，但由于目标生物体积极小、实验台空间需求大以及初始制作成本高，这一过程可能具有挑战性。本文介绍了一种适用于小体积（毫升至数十毫升）样品的实验装置。该装置结合多种市售组件，可产生稳定且线性的温度梯度。同时提供了该装置的制作规格，以及引入样本、区分并计数存活与死亡个体、计算致死温度的操作步骤。

本实验方案的目的是确定浮游动物的最高耐热极限。为此，需要建立一个稳定且线性的温度梯度。通过将水浴温度设定为 8 °C、加热器设定为 39 °C，该装置可产生 14 °C 至 40 °C 的温度梯度（图 2A）。通过调整两端温度值，可缩小或移动该温度梯度范围。例如，将加热器设定为 37 °C、水浴设定为 15 °C 时，也可建立一个范围较窄的温度梯度（19 °C 至 37 °C）。装置搭建后 45 分钟至 1 小时内，温度模块中的温度即可达到稳定（图 2B）。
为了说明本方案在浮游动物中的应用，研究了沙钱（Dendraster excentricus）幼虫在个体发育过程中上临界温度耐受性（以LT50表示）的变化。 gravid沙钱从商业渠道获得（见材料表）。通过注射0.5–1 mL的0.35 M氯化钾诱导配子释放。收集的卵用0.45 µm过滤海水经63 µm尼龙筛网冲洗。精子以干燥方式收集并置...

本方案介绍了利用市售组件产生稳定且线性温度梯度的方法。该温度梯度可用于测定浮游生物（尤其是无脊椎动物幼虫）的最高耐热极限。

热耐受极限与耐受范围已被广泛用于预测物种分布。随着全球气温持续上升，了解热耐受性如何影响……

随着全球气温持续上升，量化物种的耐热极限及其与驯化和个体发育的关系，对于评估物种在未来变暖环境中的脆弱性至关重要。对于具有复杂生活史的海洋生物而言，确定其耐热极限在实际操作上具有挑战性。本实验方案介绍了一种占地面积小、易于构建的方法，用于估算小型浮游生物的关键温度。尽管该方法是为小于一毫米的小型浮游生物开发的，但也可适用于可放入约50毫升体积闪烁小瓶的较大海洋生物。首先将条状加热器连接至调压器。在尺寸为20.3厘米×15.2厘米×5厘米的铝块上钻出60个孔，排列成6行10列的网格，确保孔与孔之间在两个方向上的中心间距均为2厘米。在第一列与第二列之间以及第九列与第十列之间再钻两个孔，孔径需与温度控制器探头的尺寸相匹配。为固定元件并为完成的加热块提供绝缘，使用透明亚克力板制作一个外壳，并确保在加热元件背面铺设两层亚克力板。在最终组装时，涂抹导热硅脂，以最大化热量从加热元件向加热块的传导，以及从加热块向冷却元件的传导。使用Tygon管将水浴锅连接，并将恒温探头插入铝块侧面的孔中。在所有铣削孔中放置装有自来水至管口的1.5毫升微量离心管。打开温度控制器，将探头一的停止加热温度设置为35至37摄氏度，探头二的停止加热温度设置为21.5至22.5摄氏度。调节变阻器以开启加热元件，并将其调至中档。打开水浴锅，将制冷器温度设置为15摄氏度。使用带有K型电极的热电偶，此后每10分钟检测一次各微型离心管内的温度。根据需要调整温度控制器和水浴装置的设置，以改变端点值。开启循环水浴和加热器，并将其分别设置为15摄氏度和37摄氏度，以形成从19.5摄氏度到37摄氏度的温度梯度。当微型离心管放入铣削孔中且加热块达到设定温度后，使用带有K型电极的热电偶检测每个微型离心管内部的温度。记录这些温度。取一个1.5毫升的微量离心管，装入通过0.45微米滤膜过滤的海水。通过反向过滤浓缩目标生物的培养物，使生物体保留在烧杯底部。用过滤的海水冲洗浓缩后的培养物，并再次进行反向过滤以进一步浓缩样品。在解剖显微镜下计数小型浮游生物，使用玻璃巴斯德吸管将已知数量的生物转移至半满的微量离心管中。然后加入过滤海水，直至这些离心管中的最终体积达到1毫升。现在将这些离心管成对放入加热块中，从低温端开始，使生物体逐渐升温至所需的实验温度。等待10分钟后，将成对的微量离心管移至相邻温度较高的钻孔中。在每一排的低温端继续放入新的成对微量离心管，并持续成对地向高温端移动。当整个模块填满后，在指定温度下孵育两小时。孵育结束后，测量每支试管的温度并记录。然后将所有试管转移至预先标记好的容器中，在预设温度下继续孵育一小时，以使其恢复。为计数活体生物部分，使用玻璃移液管将单个微量离心管中的内容物转移至35毫米培养皿中。在解剖显微镜下，分别计数活体与死亡的生物个体，并记录相应数量。所观察到的生物总数应与最初取用的生物数量一致。如果未达到要求，请检查微型离心管和培养皿的侧面，生成一个以 CSV 格式表示的数据表，表头包括感兴趣的分组变量、管内温度（摄氏度）、存活个体数量和死亡个体数量。为对数据进行逻辑回归拟合，请使用二项分布的广义线性模型。运行模型时，输入 source，并使用 R 文件 modelloop.r。计算个体存活率达到50%时的预测值，以确定中位上临界热耐受极限。采用本实验方案，测定了受精后2天、4天和6天的沙钱幼体在19至37摄氏度温度范围内的存活率。随着沙钱幼体的发育，其上临界热耐受极限从受精后2天的28.6摄氏度上升至受精后4天的28.8摄氏度，并在受精后6天时达到约29摄氏度。孵育和恢复时间因物种而异。进行预实验以确保所选时间能够可靠地区分活细胞与死细胞至关重要。

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生物学

使用加热块确定浮游动物的热限值

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