利用加热块测定浮游动物的热耐受极限

随着全球气温持续上升，量化物种的耐热极限及其与驯化和个体发育的关系，对于评估物种在未来变暖环境中的脆弱性至关重要。对于具有复杂生活史的海洋生物而言，确定其耐热极限在实际操作上具有挑战性。本实验方案介绍了一种占地面积小、易于构建的方法，用于估算小型浮游生物的关键温度。

尽管该方法是为小于一毫米的小型浮游生物开发的，但也可适用于可放入约50毫升体积闪烁小瓶的较大海洋生物。首先将条状加热器连接至调压器。在尺寸为20.3厘米×15.2厘米×5厘米的铝块上钻出60个孔，排列成6行10列的网格，确保孔与孔之间在两个方向上的中心间距均为2厘米。

在第一列与第二列之间以及第九列与第十列之间再钻两个孔，孔径需与温度控制器探头的尺寸相匹配。为固定元件并为完成的加热块提供绝缘，使用透明亚克力板制作一个外壳，并确保在加热元件背面铺设两层亚克力板。在最终组装时，涂抹导热硅脂，以最大化热量从加热元件向加热块的传导，以及从加热块向冷却元件的传导。

使用Tygon管将水浴锅连接，并将恒温探头插入铝块侧面的孔中。在所有铣削孔中放置装有自来水至管口的1.5毫升微量离心管。打开温度控制器，将探头一的停止加热温度设置为35至37摄氏度，探头二的停止加热温度设置为21.5至22.5摄氏度。

调节变阻器以开启加热元件，并将其调至中档。打开水浴锅，将制冷器温度设置为15摄氏度。使用带有K型电极的热电偶，此后每10分钟检测一次各微型离心管内的温度。

根据需要调整温度控制器和水浴装置的设置，以改变端点值。开启循环水浴和加热器，并将其分别设置为15摄氏度和37摄氏度，以形成从19.5摄氏度到37摄氏度的温度梯度。当微型离心管放入铣削孔中且加热块达到设定温度后，使用带有K型电极的热电偶检测每个微型离心管内部的温度。

记录这些温度。取一个1.5毫升的微量离心管，装入通过0.45微米滤膜过滤的海水。通过反向过滤浓缩目标生物的培养物，使生物体保留在烧杯底部。

用过滤的海水冲洗浓缩后的培养物，并再次进行反向过滤以进一步浓缩样品。在解剖显微镜下计数小型浮游生物，使用玻璃巴斯德吸管将已知数量的生物转移至半满的微量离心管中。然后加入过滤海水，直至这些离心管中的最终体积达到1毫升。

现在将这些离心管成对放入加热块中，从低温端开始，使生物体逐渐升温至所需的实验温度。等待10分钟后，将成对的微量离心管移至相邻温度较高的钻孔中。在每一排的低温端继续放入新的成对微量离心管，并持续成对地向高温端移动。

当整个模块填满后，在指定温度下孵育两小时。孵育结束后，测量每支试管的温度并记录。然后将所有试管转移至预先标记好的容器中，在预设温度下继续孵育一小时，以使其恢复。

为计数活体生物部分，使用玻璃移液管将单个微量离心管中的内容物转移至35毫米培养皿中。在解剖显微镜下，分别计数活体与死亡的生物个体，并记录相应数量。所观察到的生物总数应与最初取用的生物数量一致。

如果未达到要求，请检查微型离心管和培养皿的侧面，生成一个以 CSV 格式表示的数据表，表头包括感兴趣的分组变量、管内温度（摄氏度）、存活个体数量和死亡个体数量。为对数据进行逻辑回归拟合，请使用二项分布的广义线性模型。运行模型时，输入 source，并使用 R 文件 modelloop.r。

计算个体存活率达到50%时的预测值，以确定中位上临界热耐受极限。采用本实验方案，测定了受精后2天、4天和6天的沙钱幼体在19至37摄氏度温度范围内的存活率。随着沙钱幼体的发育，其上临界热耐受极限从受精后2天的28.6摄氏度上升至受精后4天的28.8摄氏度，并在受精后6天时达到约29摄氏度。

孵育和恢复时间因物种而异。进行预实验以确保所选时间能够可靠地区分活细胞与死细胞至关重要。