Name: 大鼠背根神经节外植体和雪旺细胞共培养中外周轴突的体外髓鞘形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习大鼠背根神经节外植体与雪旺细胞共培养技术，用于研究外周神经系统髓鞘形成机制。该方法可定量分析髓鞘化程度，评估化合物对髓鞘完整性的影响，为神经退行性疾病治疗研究提供体外筛选模型。

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我们感谢 Ralf Gold 教授和 Gisa Ellrichmann 副教授的建议与支持。

所有操作均依照欧洲共同体理事会关于实验动物护理与使用的指令进行。
1. 施万细胞培养
<ol>
	<li>施万细胞培养用包被
	<ol>
		<li>在无菌条件下包被细胞培养皿。向两个60 mm的组织培养（TC）皿中各加入2 mL 0.01%的聚-L-赖氨酸（PLL），4 ℃孵育过夜。 &#176;C.</li>
		<li>去除PLL，用蒸馏水洗涤TC培养皿2次，并与2 mL的1 &#181;g/cm2 4℃过夜孵育 laminin &#176;C. 用去离子水清洗组织培养皿 2 次，并让培养皿自然晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>施万细胞培养基的制备
	<ol>
		<li>通过添加10%热灭活胎牛血清（FCS）和2 &#181;50 微摩尔 forskolin，10 纳摩尔 neuregulin，和 50 &#181;g/mL 庆大霉素加入杜尔贝科&#8242;改良型伊格尔培养基&#8242;s 培养基（DMEM）/F-12（高糖）在无菌条件下。</li>
		<li>准备 70 mL 含 50 的 Leibovitz's L-15 培养基 &#181;g/mL 两性霉素 B，在无菌条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>坐骨神经制备 
	注意：所有坐骨神经制备步骤均在洁净工作台内进行。
	<ol>
		<li>准备一个100 mm的TC培养皿，加入5 mL冰冻的不含Ca的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）2+ 和 Mg2+，一个含有5 mL冰冻Leibovitz's L-15培养基的100 mm TC培养皿，以及一个含有5 mL冰冻Leibovitz's L-15培养基和50 &#181;g/mL 庆大霉素</li>
		<li>通过高压灭菌对所有仪器进行灭菌。用70%乙醇喷洒仪器及工作区域。</li>
		<li>使用 CO₂ 处死五只3周龄的雄性 Sprague Dawley 大鼠2 吸入麻醉并断头。用70%乙醇喷洒大鼠躯干。</li>
		<li>用剪刀打开左后肢腹侧，小心移除股二头肌。用弯头镊子轻柔抬起坐骨神经以松解，注意避免损伤神经。</li>
		<li>用弯头镊夹住神经最靠近近端的部分以拉直神经，并用剪刀尽可能高位剪断神经。随后，用剪刀在靠近骶丛和足部的位置剪断神经。对右侧重复步骤 1.3.4–1.3.5。 
		注意：打开肢体时，注意不要损伤任何血管。</li>
		<li>用镊子将左右坐骨神经放入含有冰冷 DPBS 的 100 mm 细胞培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>坐骨神经修复
	<ol>
		<li>使用镊子将所有神经转移至含有冰浴的 Leibovitz's L-15 培养基和 50 &#181;g/mL 两性霉素。继续使用体视显微镜，用两把精细镊子去除神经周围的脂肪、肌肉和血管。用镊子夹取神经，转移至含有冰冻 Leibovitz's L-15 培养基的 100 mm 细胞培养皿中。</li>
		<li>辨认坐骨神经的近端和远端。用一对精细镊子从近端向远端方向剥离神经外膜，同时用另一对精细镊子夹持神经近端。</li>
		<li>将纯化的神经转移至含有冰浴 Leibovitz's L-15 培养基和 50 &#181;g/mL 庆大霉素。用两对精细镊子分离和剥离孤立的神经束，以分离单根神经纤维。</li>
		<li>使用10 mL血清移液管将神经纤维转移至50 mL离心管中，尽量减少培养基的带入。加入50 mL含50 &#181;向神经纤维中加入 g/mL 庆大霉素，并在 50 mL 管中缓慢混匀数次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>坐骨神经的酶消化 
	&#8203;注意：以下步骤（步骤1.5–1.8、2.1和2.2）需在无菌条件下进行。
	<ol>
		<li>制备含有0.25% dispase II、0.05% I型胶原酶和50 &#181;g/mL 两性霉素 B，10 mL DMEM（高糖）中含 g/mL 庆大霉素。</li>
		<li>将试管以 188 x g 4 ℃下，5 分钟 &#176;C，用25 mL血清移液管吸除上清液，并用1,000 μL移液器将沉淀连同残留的Leibovitz's L-15培养基转移至60 mm细胞培养皿中。</li>
		<li>用10 mL酶消化液冲洗50 mL离心管，并将液体加入含有神经纤维的培养皿中。用移液枪枪头轻轻搅动培养皿中的组织，以充分暴露组织表面，利于消化。</li>
		<li>在37℃下孵育 &#176;C 和 5% CO₂2 孵育18小时，然后加入10 mL含40% FCS的Hanks平衡盐溶液（不含Ca）以终止消化反应2 和 Mg2+ (HBSS)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞分离
	<ol>
		<li>使用移液管将消化后的神经转移至50 mL离心管中，于188 x g 4℃下孵育10分钟 &#176;C. 弃去上清液，将沉淀重悬于 10 mL 含 10% FCS 和 50 &#181;g/mL 庆大霉素。用 10 mL、5 mL、2 mL、1 mL 和 200 μL 移液器将沉淀重悬，各吹打 20 次 &#181;L移液器吸头</li>
		<li>将细胞悬液通过100 μm细胞滤网过滤 &#181;m 细胞滤网过滤并以 188 x g 4℃下孵育10分钟 &#176;C. 弃去上清液，用含有10% FCS和50的DMEM重悬沉淀 &#181;g/mL 庆大霉素</li>
		<li>向两个经PLL和层粘连蛋白包被的60 mm TC培养皿中各加入2 mL细胞悬液，并在37 °C下孵育 &#176;C 和 5% CO₂2在培养箱中静置培养板2天，以保护细胞免受机械应力并促进细胞贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>施万细胞分化
	<ol>
		<li>2天后，移除培养基，并用含10% FCS和50 μg/mL维生素C的DMEM（高糖）小心冲洗培养板2次。 &#181;g/mL 庆大霉素。随后，加入 2 mL 施万细胞培养基。每 2 天更换一次施万细胞培养基nd&#160;每天在显微镜下观察细胞形态和汇合度。 
		&#8203;注意：施万细胞和背根神经节（DRG）组织块的制备需及时并协调进行，以用于共培养。当施万细胞接近80%融合度时，应确保有胚胎发育至E13.5阶段的大鼠可供用于DRG的制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞胰蛋白酶消化与磁性分离 
	注意：有关不同雪旺细胞培养阶段的示例图片，请参见 补充图1.
	<ol>
		<li>当细胞培养至约80%融合度（培养6–12天）时，用3 mL DPBS小心洗涤培养板2次，并加入2 mL预热至37℃的0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，孵育。 &#176;C) 3 分钟。当细胞从培养板底部脱落时，加入 2 mL 含 10% FCS 和 50 &#181;g/mL 庆大霉素 
		注意：胰蛋白酶消化时间严格控制在3分钟，并立即迅速进行后续操作。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 2 mL 磁性细胞分离缓冲液中，缓冲液成分为含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 nM EDTA 的 DPBS。混合 10 &#181;细胞悬液中的 L 与 10 &#181;加入 L 量的台盼蓝，使用染色计数板对细胞进行计数。</li>
		<li>将细胞悬液在188 x g下离心 g 4℃下孵育10分钟 &#176;C，并将细胞沉淀重悬于90 &#181;每1 × 10⁶细胞使用1 mL磁性细胞分选缓冲液7 细胞。加入10 &#181;每1×10⁶细胞使用L型Thy-1磁珠7 细胞。轻轻重悬溶液数次，避光孵育15分钟，温度为8℃ &#176;C.</li>
		<li>向细胞悬液中加入 2 mL 磁性细胞分选缓冲液，于 300 x g 4℃下孵育10分钟 &#176;C. 弃去上清液，将沉淀重悬于 500 &#181;L 磁性细胞分离缓冲液</li>
		<li>用 1 mL 磁性细胞分离缓冲液润洗磁性细胞分离柱。将磁性细胞分离柱置于磁性细胞分离器中。将细胞上样至磁性细胞分离柱。收集穿流液，于 300 x g 在 4 &#176;10 分钟，C 
		&#8203;注意：成纤维细胞被正向选择并保留在柱中，而施万细胞通过柱。成纤维细胞可用打孔器收集（例如，作为施万细胞染色方案的阴性对照）。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL共培养培养基中（见步骤3.1.1）。用台盼蓝染色后，使用染色室对细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 背根神经节外植体培养
<ol>
	<li>DRG 生长培养基的制备
	<ol>
		<li>通过向神经基础培养基中添加 2% B27、2% 马血清、1% L-谷氨酰胺、0.5% 青霉素/链霉素以及 10 ng/mL 神经生长因子（NGF）来制备 DRG 生长培养基。将生长培养基储存在 4 °C。 
		注意：该生长培养基可在 2 天内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DRG 外植体的包被
	<ol>
		<li>将盖玻片在 70% 乙醇中孵育 1 小时，然后使用弯头镊子将其放入 4 孔板的孔中。待乙醇挥发后，每孔加入 300 µL 的 0.2 mg/mL 多聚-D-赖氨酸（PDL），并在 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜孵育。</li>
		<li>用 DPBS 连续洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。吸除 DPBS 后，每孔加入 300 µL 的 1 µg/mL 层粘连蛋白，于 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜孵育。</li>
		<li>用 DPBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟后，将 DPBS 替换为 190 µL DRG 生长培养基。将 4 孔板置于 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DRG 的制备 
	注意：在洁净工作台下获取胚胎大鼠的 DRG。
	<ol>
		<li>制备前，用 70% 乙醇清洁所有器械。准备 10 个（每个胚胎 2 个）35 mm 细胞培养皿，每皿加入 2 mL 冰浴 HBSS，另准备两个 100 mm 细胞培养皿，每皿加入 5 mL 冰浴 HBSS。</li>
		<li>通过 CO2 吸入法处死妊娠大鼠（成年雌性 Sprague Dawley 大鼠，E13.5），并进行断头。</li>
		<li>用 70% 乙醇喷洒大鼠尸体，切开腹部体壁。小心取出子宫并将其放入盛有冰浴 HBSS 的 100 mm 细胞培养皿中。</li>
		<li>用弯头镊子夹持子宫，用精细镊子切开子宫壁。取出一个羊膜囊，并用精细镊子夹一个小孔小心打开。</li>
		<li>从周围组织中取出胚胎，剪断脐带，并用精细镊子将胚胎断头。用弯头镊子和刮匙将躯干部分放入盛有 HBSS 的 100 mm 细胞培养皿中。</li>
		<li>迅速将所有胚胎从子宫中取出，并转移至一个盛有 HBSS 的 100 mm 细胞培养皿中。若胚胎数量超过五个，则根据步骤 2.3.1 另外准备一个含 2 mL HBSS 的 35 mm 细胞培养皿。</li>
		<li>用刮匙和弯头镊子将一个胚胎躯干轻轻放入盛有 HBSS 的 35 mm 细胞培养皿中。在体视显微镜下，用精细镊子和显微剪刀切开躯干背部，将胚胎分为两半。将其中一半侧放，识别位于胚胎背部呈线状排列的 DRG 链。</li>
		<li>用精细镊子和显微剪刀将 DRG 完整地剪下成一条。将 DRG 放入盛有 2 mL HBSS 的新鲜 35 mm 细胞培养皿中，并用精细镊子和显微剪刀从剩余组织中分离出单个 DRG。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DRG 细胞培养
	<ol>
		<li>从培养箱中取出含有 190 µL DRG 生长培养基的 4 孔板，置于洁净工作台进行 DRG 操作。用精细镊子和刮匙小心地将单个 DRG 转移至 4 孔培养板的一个孔中。将 DRG 置于每孔中央，因为中心位置对 DRG 的贴附至关重要。</li>
		<li>此后操作均需在无菌条件下进行。将外植体培养物置于 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。次日，使用 100 µL 移液器小心地向每孔加入 50 µL DRG 生长培养基。</li>
		<li>每日在显微镜下观察 DRG 外植体的贴附情况及轴突生长情况，并在培养第 3 天时弃去已从盖玻片脱落或未长出轴突的 DRG 外植体。 
		&#8203;注意：DRG 外植体在培养初期非常脆弱，需小心操作，尤其是在更换培养基时移动培养板进出培养箱，甚至关闭培养箱门时。每孔精确的 190 µL 培养基体积对于培养第一天保持 DRG 外植体的位置至关重要。松动的 DRG 外植体在日常观察中易于识别，因其在培养基中漂浮而非贴附于盖玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 共培养
<ol>
	<li>将施万细胞转移至背根神经节外植体培养物
	<ol>
		<li>通过在背根神经节生长培养基中添加 0.1% 抗坏血酸，制备共培养培养基。</li>
		<li>在背根神经节外植体培养的第 3 天，小心地将背根神经节生长培养基更换为含有 30,000 个施万细胞（来自步骤 1.8）的共培养培养基，每孔加入 250 µL。</li>
		<li>将背根神经节外植体与施万细胞共培养最多 22 天。每隔一天小心更换 250 µL 共培养培养基，并使用显微镜观察细胞形态。 
		注：有关共培养体系中背根神经节轴突和施万细胞在培养初期的示例，请参见 图 1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫细胞化学染色 
	注：染色过程中需极其小心地处理共培养样品，因其容易受损。
	<ol>
		<li>为固定盖玻片上的细胞，缓慢移除培养基，用 DPBS 轻柔洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后在 4% 多聚甲醛（PFA）中孵育 10 分钟。用 DPBS 替换 PFA，并将固定后的细胞在 4 °C 下保存最多 1 周。 
		注意：操作 4% PFA 时，应穿戴推荐的个人防护装备。</li>
		<li>用 DPBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟，然后在 DPBS 中加入封闭液（10% 山羊血清、10% 牛血清白蛋白 [BSA]、0.1% 明胶和 0.05% Triton X-100）封闭 1 小时。将一抗 βIII-微管蛋白（1:7,500）和髓鞘碱性蛋白（MBP）（1:750）用封闭液稀释后，于 4 °C 孵育过夜。</li>
		<li>用 DPBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。将荧光标记的二抗按 1:1,000 比例稀释于封闭液中，在室温（RT）下孵育 2 小时。</li>
		<li>用 DPBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，然后使用含 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的荧光封片剂将细胞封片于显微载玻片上。将载玻片置于 4 °C 避光保存，直至进行显微成像记录。 
		注意：操作荧光封片剂时，应穿戴推荐的个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析
	<ol>
		<li>使用倒置显微镜拍摄背根神经节外植体中心周围八个特定区域的图像。</li>
		<li>使用图像分析软件定量分析 βIII-微管蛋白阳性轴突以及 MBP 染色的髓鞘化区域面积。</li>
		<li>以髓鞘化轴突与非髓鞘化轴突的比值计算髓鞘化百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在此，我们介绍一种快速且简便的方案，用于生成 体外 通过合并两种独立的细胞类型培养物——施万细胞和背根神经节外植体——实现髓鞘化。
该实验方案的关键步骤是背根神经节（DRG）外植体的培养，尤其是在培养的最初几天。在形成稳定的轴突网络之前，DRG非常脆弱，因此在从培养箱中取出或更换培养基时必须极其小心地操作。如果DRG从孔板底部脱落并漂浮在培养基中，则表明培养失败。对于施万细胞而言，由于培养条件和添加物（如培养基中的血清）不同而导致的增殖速率变化，可能对共培养体系构成挑战。如果施万细胞过度增殖，导致培养物从孔板底部脱落，则该培养物将无法使用。因此，建议对培养中施万细胞的数量进行滴定优化。在建立施万细胞培养方案的过程中，应通过SOX10或S100免疫染色进行纯度检测。总体而言，所有培养操作，包括更换培养基、洗涤和固定步骤，都必须谨慎进行，以确保实验成功。根据研究目的选择合适的观察时间点非常重要；第14天是首次出现密集有髓轴突的起始时间，因此可作为髓鞘形成起始阶段的观察时间点，而更晚的时间点则可观察到更完整的髓鞘结构。
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在周围神经系统（PNS）中，快速的信息转导由髓鞘包裹的轴突介导。轴突的髓鞘化对于实现电信号的快速传导至关重要，因为神经纤维的传导速度与轴突直径和髓鞘厚度相关1。从外周向中枢神经系统（CNS）的感觉信号传递依赖于位于背根膨大部分的第一级感觉神经元的激活，这些膨大部分称为背根神经节（DRG）。轴突与施万细胞之间必须持续进行通讯，才能实现髓鞘的形成和维持，其中施万细胞是PNS中负责髓鞘形成的胶质细胞2。
周围神经系统（PNS）的许多疾病会通过原发性轴突损伤或脱髓鞘损伤干扰信息的传导，导致感觉减退或感觉异常。初级感觉神经元在神经损伤后具有一定程度的再生能力，这依赖于神经元与周围施万细胞之间复杂的相互作用3。在此过程中，施万细胞可发生细胞重编程，清除轴突和髓鞘碎片，并促进轴突再生，从而实现再髓鞘化4。了解健康与疾病状态下髓鞘形成的机制，对于寻找周围神经系统脱髓鞘疾病的潜在治疗方法至关重要。急性神经创伤也可导致髓鞘损伤，目前正研究促进髓鞘形成以加快周围神经损伤后的功能恢复的各种策略5。
我们对周围神经系统髓鞘形成的认知在很大程度上得益于施万细胞与感觉神经元的髓鞘化共培养体系。自从首次应用该方法以来6,7,8，髓鞘化已通过多种共培养系统被深入研究9,10,11. 本文提供了一种快速且简便的可靠方案 体外 背根神经节轴突的髓鞘形成。施万细胞制备方案基于Andersen等人的方案。12，先前发表于 Pitarokoili 等人13我们采用来自幼年大鼠的施万细胞与胚胎背根神经节（DRG）外植体共培养体系，该体系中髓鞘形成通常在第14天左右出现。本方法旨在建立一个可用于研究轴突与施万细胞直接相互作用所介导的髓鞘形成过程，并用于研究周围神经系统（PNS）髓鞘形成的调控因子的实验系统。与解离的神经元细胞培养相比，DRG外植体在解剖结构上更为完整，并能形成较长的轴突突起。通过量化有髓轴突区域面积，可充分反映共培养体系中的髓鞘化水平。该方法是筛选潜在影响PNS髓鞘形成的治疗化合物的有力工具，也可与其他 体内 动物模型研究14.

<table><tbody><tr><td>抗 MBP 抗体，兔源</td><td>Novus Biologicals, Centannial, 美国</td><td>ABIN446360</td><td></td></tr><tr><td>抗 &amp;szlig;III-微管蛋白抗体，小鼠源&amp;nbsp;</td><td>Biolegend, San Diego, 美国</td><td>657402</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>A4403-100MG</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere 滤芯吸头，100 &amp;micro;L</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>70760212</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere 滤芯吸头，1250 &amp;micro;L</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>701186210</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere 滤芯吸头，20 &amp;micro;L</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>701114210</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere 滤芯吸头，300 &amp;micro;L</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>70765210</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, 德国&amp;nbsp;</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛，100 &amp;micro;M</td><td>BD Bioscience, Heidelberg, 德国</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>离心机 5810-R</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, 德国</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱 Heracell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, 德国&amp;nbsp;</td><td>51017865</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 12 mm</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, 德国&amp;nbsp;</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>弯头精细镊&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国</td><td>11370-42</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 氟封片剂 (R)</td><td>Biozol, Eching, 德国</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水（水纯化系统）&amp;nbsp;</td><td>Millipore, Molsheim, 法国</td><td>ZLXS5010Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>31331093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>VWR, Radnor, 美国&amp;nbsp;</td><td>1009862500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>F7524</td><td>FCS 必须经过雪旺细胞培养测试</td></tr><tr><td>精细镊（Dumont #5）</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>福斯科林（Forskolin）</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国</td><td>5710064</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>14170138</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell 培养箱</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, 德国&amp;nbsp;</td><td>51017865</td><td></td></tr><tr><td>Heraguard ECO 1.2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>51029882</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Pan-Biotech, Aidenbach, 德国</td><td>P30-0712</td><td></td></tr><tr><td>Image J 软件</td><td>HIH, Bethesda, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;acute;s L-15 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国</td><td>130042303</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;</td><td>Motic, Wetzlar, 德国</td><td>Motic BA 400</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 Axio observer 7</td><td>Zeiss, Oberkochen, 德国&amp;nbsp;</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR, Radnor, 美国&amp;nbsp;</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国</td><td>130091632</td><td></td></tr><tr><td>MS 柱</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 计数板&amp;nbsp;</td><td>Assistant, Erlangen, 德国</td><td>40441 &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>神经调节蛋白</td><td>Peprotech, Rocky Hill, 美国</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>神经生长因子（NGF）</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>N1408</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Biozol, Eching, 德国</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon &amp;Delta; 多孔板，4 孔</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Acros Organics, New Jersey, 美国&amp;nbsp;</td><td>10342243</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, 德国</td><td>4430000018&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, 德国</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>反应管，15&amp;nbsp;mL</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>反应管，50&amp;nbsp;mL</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>反应管，1.5 mL</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>安全柜 S2020 1.8</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>51026640</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国</td><td>14083-08</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，10 mL</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>861254025</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，25 mL</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>861685001</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，5 mL</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>861253001</td><td></td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜 Discovery.V8</td><td>Zeiss, Oberkochen, 德国&amp;nbsp;</td><td>495015-0012-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, 德国</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 100，细胞+</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>833902300</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 35，细胞+</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>833900300</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 60，细胞+</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, 德国&amp;nbsp;</td><td>833901300</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 磁珠（MACS 试剂盒）</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国</td><td>130-094-523</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（2.5%），无酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, 德国&amp;nbsp;</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, 德国&amp;nbsp;</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅，型号 1008</td><td>GFL, Burgwedel, 德国&amp;nbsp;</td><td>4285</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠背根神经节外植体与施万细胞共培养体系中周围神经轴突的体外髓鞘化

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

髓鞘形成过程对于实现神经系统中快速而充分的信号传导至关重要。在周围神经系统中，神经元与施万细胞通过复杂的相互作用共同调控轴突的髓鞘化。这种相互作用的紊乱以及髓鞘结构的破坏是炎性神经病的典型特征，并在神经退行性疾病中继发性出现。本文介绍一种背根神经节外植体与施万细胞的共培养模型，该模型可实现周围轴突的显著髓鞘化，用于研究周围神经系统中的髓鞘形成过程、轴突-施万细胞相互作用，并分别评估治疗药物对两种细胞类型的潜在影响。在方法上，取胚胎期13.5天（E13.5）大鼠的背根神经节，剥离周围组织后以完整外植体形式培养3天。施万细胞则从3周龄成年大鼠的坐骨神经中分离，通过酶消化法获取，并利用磁性激活细胞分选技术进行纯化，随后在含神经调节蛋白和佛司可林的培养条件下扩增。在背根神经节外植体培养3天后，将30,000个施万细胞加入一个外植体中，培养基中添加抗坏血酸。共培养第10天时，免疫细胞化学染色显示髓鞘碱性蛋白的散在信号，提示髓鞘化初始迹象。自第14天起，髓鞘沿轴突逐步形成并延伸。可通过髓鞘碱性蛋白染色定量髓鞘化程度，以髓鞘面积与轴突面积的比值作为指标，以校正轴突密度差异带来的影响。该模型为研究周围髓鞘化的多个方面提供了实验平台。

关键词：髓鞘形成，施万细胞，背根神经节，共培养，轴突-胶质细胞相互作用，髓鞘碱性蛋白，周围神经系统，神经退行性疾病，炎性神经病 体外这对于理解周围神经系统炎症性和神经退行性疾病中脱髓鞘和神经退行性变的病理机制及潜在治疗机会至关重要。

在共培养的第10、12、14、16、18和20天评估髓鞘形成情况。对背根神经节（DRG）外植体和施万细胞进行MBP、βIII-微管蛋白和DAPI染色。共培养中的轴突网络密集，在整个观察期间无明显变化。在第10天可检测到以微小片段形式出现的髓鞘形成的最初迹象，并在第12天有所增加（图2）。MBP阳性区域随培养时间延长逐渐增加，直至培养第20天。髓鞘化程度以MBP阳性区域与βIII-微管蛋白阳性区域的比值进行量化。与第10天相比，第18天和第20天的髓鞘化显著增加（图3；**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001）。
<img alt="用于静力平衡研究的神经元网络显微图像；细胞经染色用于结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64768/64768fig01.jpg" data-altupd...

在背根神经节与施万细胞的共培养体系中，可以研究周围神经系统的髓鞘形成。该模型为观察和量化周围髓鞘化过程，以及研究感兴趣化合物对髓鞘影响提供了实验机会。

髓鞘形成过程对于实现神经系统中快速而充分的信号传导至关重要。在周围神经系统中，……

该模型为体外研究周围神经系统髓鞘形成的各个方面提供了实验机会。它能够实现髓鞘的定量分析以及轴突-施万细胞相互作用的观察。共培养体系从第14天开始形成稳定的髓鞘化。与解离的神经元培养相比，背根神经节（DRG）组织块培养具有保持完整结构架构的优势。该方法可用于筛选针对周围神经系统炎症性和神经退行性疾病的影响性化合物。首先，用70%乙醇对已处死大鼠躯干的工作区域进行消毒。用剪刀打开大鼠左后肢背侧，小心剥离股骨上的股二头肌。用弯头镊子轻柔抬起以松解坐骨神经，注意避免挫伤神经。用镊子将剪下的神经转移至含有冰冷的Leibovitz's L-15培养基的组织培养皿中，培养基中含50 微克/毫升的庆大霉素。然后，在体视显微镜下，使用两把精细镊子去除神经周围的脂肪、肌肉和血管。辨认坐骨神经的近端和远端，用一把精细镊子沿近端至远端方向剥离神经外膜，同时用另一把精细镊子固定神经近端。将纯化后的神经转移至另一含有冰冷Leibovitz's L-15培养基（含庆大霉素）的组织培养皿中，再用两把精细镊子轻轻分离已解剖出的神经束，以分离并获取单根神经纤维。使用10毫升血清移液管将神经纤维转移至50毫升离心管中，并尽量减少培养基的携带量。然后向神经纤维中加入50毫升含庆大霉素的Leibovitz's L-15培养基，轻轻吹打数次。将含有神经纤维的离心管在4摄氏度、188 G条件下离心5分钟。吸除上清液后，将沉淀物连同残留的Leibovitz's L-15培养基转移至60毫米组织培养皿中。用10毫升酶消化液冲洗50毫升离心管，并将冲洗液加入神经纤维培养皿中。用移液器枪头小心地将神经纤维在培养皿中分散均匀。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育18小时。加入10毫升含40% FCS的HBSS终止酶消化。将消化后的神经组织转移至50毫升离心管中，在4摄氏度下以188 ×g离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于10毫升含有10%胎牛血清（FCS）和50微克/毫升庆大霉素的DMEM培养基中。接着，将细胞悬液通过100微米细胞筛过滤。在4℃、188 ×g条件下离心10分钟后，将沉淀用4毫升含胎牛血清（FCS）和庆大霉素的DMEM培养基重悬。将两毫升细胞悬液分别加入两个经多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的60毫米组织培养皿中。在37°C和5%二氧化碳条件下孵育，将培养皿置于培养箱中静置两天。在4°C条件下，以188 ×g离心施万细胞悬液10分钟，并将细胞沉淀重新悬浮于每1×10⁷个细胞90微升的磁性细胞分选缓冲液中。然后每1 × 10⁷个细胞加入10 µL的ti1微珠。将重悬的细胞溶液在8 °C避光孵育15分钟。接着，向细胞悬液中加入2 mL磁性细胞分选缓冲液。在4°C条件下以300 G离心10分钟后，将沉淀重悬于500 µL磁性细胞分离缓冲液中。将磁性细胞分离柱置于细胞分离器中，并用1 mL磁性细胞分离缓冲液润洗柱子。然后将细胞上样至柱中，收集流出液用于后续离心。从安乐死的妊娠大鼠体内小心取出子宫，并将其放入含有冰冻 HBSS 的 100 毫米组织培养皿中。用弯头镊子夹住子宫，用精细镊子切开子宫壁。取出一个羊膜囊，用精细镊子轻轻夹出一个小孔，小心地打开羊膜囊。迅速将所有胚胎从子宫中取出，并转移至盛有HBSS的培养皿中。在体视显微镜下，轻柔地将一个胚胎躯干放入盛有HBSS的35毫米培养皿中，切开躯干的背侧，将胚胎分为两半。将其中一半胚胎侧放，辨认位于胚胎背侧沿线的背根神经节（DRG）条索结构。使用精细镊子和显微剪刀将背根神经节整条剪下。将背根神经节置于盛有2 mL HBSS的新培养皿中后，再用精细镊子和显微剪刀从其余组织中分离出单个背根神经节。取一个4孔板，每孔中加入190微升DRG生长培养基，使用精细镊子和刮勺小心地将单个DRG转移至每孔中央。随后将DRG外植体培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。次日，每孔小心添加50微升DRG生长培养基，并每日在显微镜下观察DRG外植体的贴壁情况及轴突生长。在DRG外植体培养的第三天进行共培养时，小心地将DRG生长培养基更换为250微升共培养基，每孔含有30,000个施万细胞。进行免疫细胞化学染色时，用DPBS洗涤细胞后，将细胞在4%多聚甲醛中固定10分钟。使用倒置显微镜，在位于中央的DRG外植体周围八个特定区域拍摄免疫细胞化学染色样本的图像。此处展示了背根神经节轴突与呈细长纺锤形的施万细胞在共培养中的形态特征。通过在不同时间点对背根神经节外植体和施万细胞进行髓鞘碱性蛋白（MBP）、βIII微管蛋白以及DAPI染色，评估共培养体系中的髓鞘形成情况。共培养中的轴突网络密集，在整个观察期间内未发生明显变化。共培养第10天和第12天可见髓鞘形成的最初迹象。从第14天开始，MVP信号更加明显，并检测到被髓鞘包裹的轴突。随着共培养时间延长至第20天，髓鞘形成逐渐增加。髓鞘化程度通过MVP与βIII微管蛋白阳性区域的比值进行量化。与第10天相比，第18天和第20天的髓鞘化程度显著增加。DRG外植体培养物较为脆弱，需小心操作。例如，在将样品从培养箱中取出、更换培养基或固定时。可通过共培养样品的基因表达分析，更深入地研究髓鞘。在此，我们在第22天检测到了髓鞘标志物PMP22、MAG、Oct6、Egr2和Olig1。

in-vitro-myelination-peripheral-axons-coculture-rat-dorsal-root

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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大鼠背根神经节外植体与施万细胞共培养体系中周围神经轴突的体外髓鞘化

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