细胞培养技术与实践：研究用细胞培养实验室中避免真菌和细菌污染的方法

细胞培养是一项精细的技术，用于在受控的实验室环境中生长各种类型的细胞和组织。进行细胞培养时最主要的关注点是污染问题。这种污染可能来自细菌、霉菌或支原体。

本视频中介绍的所有技术与操作规范将确保您的细胞保持活性、健康且无污染。这些操作规范必须严格遵守，所有实验室人员应至少每年接受一次培训。开始工作前，请穿戴专用于细胞培养室的洁净实验服。

佩戴未接触过其他表面的新手套。确保手套贴合紧密。最好使用无粉腈类手套。

实验服和手套无需无菌。准备操作时，用70%乙醇喷洒手套、实验服袖子以及生物安全柜内部。从内部和外部对工作台面、两侧、后部、柜内所有物品以及前部玻璃面板进行喷洒。

使用无绒纸巾将工作台面和玻璃面板擦干。花些时间整理生物安全柜内的工作区域。将水浴锅置于细胞培养室内，并仅将其用于细胞培养相关操作，例如预热培养基或解冻细胞。

水浴锅应每周排空并清洗一次。尽量减少带入柜内的物品数量，并避免遮挡生物安全柜的前部或后部格栅，以免干扰柜内气流。将放入柜内的所有物品用70%乙醇喷洒，并擦拭干燥。

首先喷洒培养基瓶的顶部，然后逐渐向下进行。用一张干净的纸巾从培养基瓶的顶部开始擦拭至干燥，并逐步向下移动。切勿再向上擦拭瓶盖区域。

这些柜子的工作原理是通过前部和后部的格栅从房间以及柜体内部抽取空气。空气流向柜子后方，然后上升至顶部。在那里，被污染的空气会经过一系列过滤器，部分经过过滤的洁净空气则被向下吹送至柜内的工作区域。

如果超净台足够大，可以容纳移液管，则可将移液管放置在台内；否则，可将其存放在安装于超净台外部的容器中。使用前应检查封装移液管的包装两侧是否存在孔洞、撕裂或穿刺，这是良好的操作规范。切勿撕掉包装。

相反，应轻轻剥离包装的末端。将刻度移液管插入移液辅助器中，并以流畅的动作一次性移除包装。切勿在任何敞口瓶或烧瓶上方悬停。

不建议伸手越过敞开的瓶子或烧瓶，或在敞口烧瓶上方操作。生物安全柜内的气流会向下吹拂柜内所有物品。伸手越过时，你的袖子或手套会位于物品上方，一旦袖子上存在污染物，气流可能将其直接压入细胞培养物中，造成污染。

尽可能不要倾倒液体，而应使用刻度移液管加入液体。充分混匀内容物，并在瓶上签名。

记录培养基中添加的成分。如果操作贴壁细胞且需要使用塑料培养瓶，请先将整个包装喷洒乙醇消毒，然后放入超净台内。一旦发现手套变干，请立即用乙醇再次喷洒。

处理贴壁细胞系时，使用经高压灭菌的玻璃移液管或一次性无菌塑料移液管吸取培养基或洗涤液。小心取下储存容器的金属盖。将容器倾斜并轻轻摇晃，以分离出一根玻璃移液管。

取用容器中的移液器时，避免触碰其他移液器。仅从一端拿取选定的移液器。打开瓶盖或瓶塞后，应尽快重新盖紧。

将瓶盖倒置放在工作台面上，确保边缘不接触台面。不要从顶部或底部抓取瓶盖，而应从两侧接触瓶盖。

吸取液体时，应使用位于生物安全柜外、置于地面次级容器中的真空抽滤瓶。在柜内操作过程中会产生废弃物。由于频繁将手伸入和移出柜内会干扰气流，因此可暂时将废弃物留在柜内。

将其放置在旁边，以免影响工作。当手套变干时，应大量喷洒70%乙醇。双手互相揉搓，直至不再滴水。

关于血清移液管的一个重要提示：如果它们意外接触到生物安全柜中的其他物品，请毫不犹豫地将其丢弃。最好使用新的无菌血清移液管重新开始操作，而不是使用可能已被污染的移液管。

将细胞放入培养箱之前，需在显微镜下观察其形态。应观察到单个细胞，这表明细胞已充分重悬。

切勿在培养箱内说话、打喷嚏、咳嗽或重呼吸。应迅速开关培养箱门。若长时间开启，可能导致空气中的污染物进入培养箱。

从柜中取出前，确保所有瓶子的瓶盖均已彻底盖紧。培养基对光敏感，不使用时应于4°C避光保存。

细胞培养操作完成后，再次用70%乙醇喷洒超净台内部，并用纸巾将表面擦干。清空生物危害废物袋。在更换不同细胞系时，重复此过程并更换手套。

处理在玻璃烧瓶中培养的悬浮细胞时，应确保手套湿润。先用湿手套接触铝箔，然后仅在将烧瓶放入生物安全柜之前对其底部进行喷洒消毒。取样进行细胞计数时，仅从容器中取出一个1.5 ml离心管。

请勿触碰其他任何试管。将管盖倒置放在工作台面上，切勿触碰其内缘。

从两侧小心操作，并在使用完毕后及时更换。处理悬浮细胞和玻璃烧瓶时，小心移除覆盖烧瓶整个瓶口的双层折叠铝箔。轻轻拉起四个角，将铝箔倒置放在工作台面上。

仅从底部持握玻璃烧瓶。一旦取下锡箔，切勿触碰瓶口部位。使用1 ml血清学移液管取样进行细胞计数。

不要让培养基沿瓶壁滴下。如果发生滴漏，应立即将纸巾喷上70%乙醇并及时清理。在将瓶子或烧瓶从生物安全柜中取出之前，确保瓶盖或铝箔已拧紧。

为不同类型的细胞使用独立的培养箱。这可以防止不同类型细胞之间的交叉污染。建议将用于收集液体废液的真空 Trap 瓶放置在生物安全柜外的地面，并置于标有“废液”的次级容器中。

软管连接至一个过滤器，该过滤器每月更换一次。软管从柜体侧面穿入。工作完成后，及时清除生物危害性垃圾。

在水槽旁边的墙上张贴玻璃器皿清洗规程。首先，用10%的次氯酸钠溶液浸泡废弃的细胞约五分钟。然后倒掉次氯酸钠混合液，并用水彻底冲洗烧瓶。

加入肥皂和水，用刷子彻底刷洗，再用大量水冲洗。最后一步是用右侧水龙头上的去离子水冲洗玻璃器皿。应尽快清洗玻璃烧瓶，并彻底刷洗玻璃器皿。

如果未彻底刷洗，Sf9 细胞会从这圈死细胞边缘脱离。这些烧瓶仅用于细胞培养，请将细胞培养用玻璃器皿进行高压灭菌，而不要送至玻璃器皿清洗机构。使用高压灭菌器的真空循环程序，灭菌时间为 40 分钟，干燥时间为 40 分钟。

将其与实验室主要区域的玻璃器皿分开存放。合理安排细胞培养室，使所有耗材集中放置于同一区域，从而最大限度减少实验室人员为寻找耗材而进出细胞培养室的次数。用于收集细胞并在后续细胞培养中重复使用的塑料瓶，应明确标注“仅用于细胞培养”。

使用指定的细胞培养瓶培养特定类型的细胞。将这些培养瓶存放于细胞培养室中，以便取用。对于悬浮培养的细胞，霉菌会在培养基中呈现为漂浮的小球状物。

至于细菌污染，会使培养基变白并浑浊。同样，对于贴壁细胞，霉菌污染可轻易识别为绒毛状斑块。细菌污染会使原本澄清的培养基变得白浊。

许多支原体物种可通过基于 PCR 的检测方法可靠地鉴定。左侧条带显示 DNA 的分子量标准。右侧的四条条带为阳性对照。

在测试的细胞类型下未出现条带，因为未检测到支原体。如果培养基中含有pH指示剂，其颜色会从红色变为黄色。黄色表明pH值较低，应更换培养基。

若在进行细胞计数时，于光学显微镜下观察到其他类型的生长物或细胞形态异常，则可能提示存在污染。需要注意的是，在细胞计数前应彻底清洁血细胞计数板，因为此类杂质可能仅存在于计数板表面，而非细胞培养物本身。尽管污染是细胞培养操作中的主要风险之一，但通过遵循本视频中所述的操作规范与技术，可有效降低此类风险。

如果每月定期进行支原体检测，实验室人员每年接受一次培训，并严格遵守这些操作规范，则您的细胞将保持健康且无污染。这还将有助于降低购买昂贵细胞培养基和新细胞的成本，并减少因培养箱去污染而导致的停机时间。请记住，成功进行细胞培养的关键在于及早采取行动，以防止污染的发生。