Name: 神经细胞移植的人脑类器官模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习在人脑类器官中移植和追踪标记神经细胞的实验方法，利用iPSC来源的神经祖细胞进行长期体外评估。该技术为细胞治疗研究提供了灵活的药物测试平台。

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本工作得到了马塞尔和让·库图基金会（Marcelle and Jean Coutu foundation）提供的IRIC慈善基金以及魁北克健康研究基金（Fonds de recherche du Québec - Santé，FRQS #295647）的资助。D.J.H.F.K. 获得了FRQS颁发的初级研究员一级奖学金（Chercheurs-boursiers Junior 1，#283502）提供的薪资支持。M.I.I.R. 获得了癌症免疫学与研究研究所（Institut of Research in Immunology and Cancer）颁发的IRIC博士奖、蒙特利尔大学硕士到博士加速过渡奖学金（Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat）以及高等学位优异奖学金（Bourse de Mérite aux cycles supérieurs）的支持。

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<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
<li>Sun, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鉴于细胞治疗在中枢神经系统（CNS）损伤和神经退行性疾病治疗中受到广泛关注1,2,3,4,5,6,7,8，研究细胞在移植环境中的功能模型正变得日益重要。本文介绍了一种将标记的人类神经前体细胞（NPCs）移植至人脑类器官的方法，并通过组织学和免疫荧光染色对移植细胞进行活细胞追踪及终点评估。重要的是，我们发现移植的细胞能够在类器官环境中迁移、分化并长期（4个月）存活。这种长期存活能力显著优于脑切片培养系统的维持时间17。因此，该系统适用于评估潜在治疗场景中所需考察的多种细胞行为，如存活、增殖和分化。事实上，最近一项正交研究显示，移植的NPCs在脑类器官中的行为与移植到NSG小鼠脑中的NPCs相似20，从而证实了类器官作为移植受体的实用性。由于这是一个体外（in vitro）系统，可直接添加感兴趣的细胞因子或药物。这有助于更好地理解特定微环境（如炎症状态或免疫抑制剂）对移植细胞的影响，从而更真实地模拟其在治疗环境中的遭遇。我们所展示的循环免疫荧光染色方案（基于先前研究21）进一步增强了该方法的能力，可在单个切片中同时检测大量谱系特异性以及潜在的疾病特异性标志物，从而实现对移植细胞及其对组织影响的精确追踪。当然，根据分析目标的不同，也可采用其他终点评估方法。例如，若主要关注细胞形态，可采用组织透明化结合三维重建技术；若最终目标是定量特定细胞类型的数量，则可采用组织解离后流式细胞术分析。我们预计该方法可轻松扩展至其他细胞类型，如中枢神经系统肿瘤，从而可能在具有微环境相关性的背景下对其进行研究。类似地，作为受体使用的类器官也可替换为疾病模型类器官25,26,27，从而有望为这些疾病的移植治疗策略建立模型。
与所有模型一样，本文所介绍的模型也存在其自身的局限性。首先，由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官在发育上尚不成熟19，因此与许多神经退行性疾病发生的衰老大脑相比，存在重要差异。脑类器官在发育过程中也存在异质性19，因而无法始终如一地将其注射到完全相同的生理微环境中。此外，尽管这些类器官包含相关脑区的细胞类型18, 19，但缺乏内皮细胞、小胶质细胞以及免疫成分，而这些成分在in vivo环境中同样至关重要14。这限制了对宿主如何响应细胞移植的研究。目前已有新技术正在发展，用于向类器官中引入血管28和小胶质细胞29，并提高类器官的一致性和区域特异性18，从而增强类器官移植系统的建模能力。然而，这些技术仍需在本方案所描述内容之外进行进一步测试和优化。尽管本方案成本较低且无需特殊设备，但仍存在若干重要的技术考量因素——例如注射深度。这主要是因为类器官缺乏灌注，若生长过大，常出现坏死的核心19；同时，活细胞追踪时光线无法穿透类器官核心。因此，注射过深的细胞以及迁移到内部的细胞克隆可能被遗漏。虽然使用穿透性更强的长波长荧光染料可在一定程度上缓解该问题30，但根据类器官大小和检测设备的不同，这仍可能是一个需要考虑的因素。最后，由于脑类器官处于持续发育状态，移植时机是另一个关键考量因素，因为移植环境可能随类器官发育阶段的不同而有所差异。尽管可通过确保注射时类器官年龄一致在一定程度上控制该变量，但无疑这是必须加以考虑的一个因素。
该方案成本低廉、操作简便、无需使用动物，且不需要特殊设备，从而使移植建模可被更广泛的实验室所采用。随着神经细胞治疗和类器官模型系统研究的快速进展，我们预计本文所介绍的类器官移植方案将成为多种疾病及治疗策略研究的有用模型。

人脑是一个复杂的器官，由神经细胞系和胶质细胞系的多种细胞类型组成。这些细胞共同形成一个复杂的网络，从而产生认知功能。目前，将细胞移植到这一系统中作为治疗多种神经系统疾病（包括创伤性脑损伤（TBI））的方法，正受到广泛关注。1,2神经退行性疾病3,4,5,6,7，以及中风8然而，此类策略发展的一个主要局限在于可用于预测移植效果的临床前模型相对匮乏。目前最常用的模型是 体外 用于确定细胞潜能的培养方法及向小鼠进行异种移植。尽管细胞培养方法可评估分化潜能与自我更新能力9，这些操作是在最佳生长条件下进行的，而这些条件并不能模拟细胞在移植环境中所会遇到的微环境。此外，细胞的培养方式可能会影响其行为特性10.
小鼠大脑包含微环境中的所有细胞类型，因此是移植研究极为强大的模型系统11。然而，小鼠与人类大脑皮层之间存在重要差异12,13，且并非所有生长因子在物种间具有交叉反应性。灵长类动物模型是更接近人类系统的替代方案，能够更好地模拟人类生理，并已产生重要的临床前研究成果14。然而，即使是这些亲缘关系较近的物种，其细胞组成仍存在显著差异15。尽管上述两种模型系统均可为移植过程中细胞行为的研究提供有价值的信息，并包含未来治疗中所需的手术要素，但它们仍不完善。此外，这些模型成本高昂且技术难度较大（例如需对动物实施脑部手术），从而限制了实验通量。同时，将人类脑细胞移植至动物体内还涉及大量伦理问题16。脑切片培养技术可将单个大脑切割用于多种处理，从而在一定程度上克服动物移植的部分局限性；然而，此类切片寿命有限（数周），仍来源于动物，且由于仅为薄层结构，缺乏足够的体积和表面完整性，难以模拟细胞注射过程17。因此，在严格的细胞培养/潜在模型与in vivo移植之间，仍存在重要空白。
脑类器官是一种 体外 包含大脑主要神经细胞类型的模型，可通过人诱导性多能干细胞（iPSCs）大量生成18,19因此，这类类器官提供了细胞环境，可用于评估待测细胞在移植环境中的功能潜力。事实上，最近一项研究表明，移植到人脑类器官中的神经前体细胞（NPCs）能够存活、增殖并分化，其行为与移植到动物脑内的神经前体细胞相似 n非肥胖型糖尿病 s严重联合免疫缺陷 gNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠20因此，脑类器官代表了一种无残忍行为、长寿命的（&#62;6个月）、经济高效的系统，可捕获人类大脑的细胞类型。因此，它们可作为神经细胞再生能力早期测试的理想移植受体。
本文介绍了一种将标记的人类神经前体细胞（NPCs）移植到人脑类器官中并进行后续追踪的实验方案。图1）。这始于将表达GFP标记的NPCs注射到成熟的（2至4个月大）脑类器官中18通过活细胞荧光显微镜对移植的细胞进行为期4个月的追踪。在此期间，我们不仅观察到细胞在注射部位的持续存在，还观察到其向类器官远端区域的迁移。在实验终点，我们展示了来源于这些类器官的组织学切片的抗原修复、染色及成像方法，包括一种基于前期研究的淬灭现有AlexaFluor标记荧光染料的方案，以实现多轮额外的染色与成像。21因此，该方案可用于评估细胞在移植环境中的分化能力、移植物的持久性以及细胞扩增情况 原位以及移植部位的细胞迁移。我们预计该技术在再生医学/细胞治疗应用中具有实用价值，同时也可用于将肿瘤细胞植入特定区域的类器官中以构建肿瘤模型。

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>蛋白水解-胶原水解酶混合物</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗-GFP 抗体</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗-MAP2（克隆 SMI 52）</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗-GFAP 抗体（克隆 SMI 25）</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗-Nestin（克隆 10C2）</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗-Tubulin &amp;beta; 3 (TUBB3)（克隆 TUJ1）</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>一水柠檬酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 细胞成像多功能读板仪</td><td>Biotek</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>变性乙醇（无水）</td><td>ChapTec</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12/Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO），无菌</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 生长因子减少型（GFR）</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>无酚红，无LDEV</td></tr><tr><td>MX35 切片机刀片&amp;nbsp;</td><td>Epredia&amp;nbsp;</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS（无钙无镁）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&amp;nbsp;不锈钢底模</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&amp;nbsp;UNISETTE 活检处理/包埋盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 前脑神经元分化试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 神经前体细胞培养基</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi 神经诱导试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME 切片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>组织处理液</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&amp;nbsp; AI 组织处理仪</td><td>Sakura Finetek</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>甲苯（组织学用）</td><td>ChapTec</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝；0.4%（重量/体积）</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

一种人脑类器官神经细胞移植模型

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

细胞移植技术的进步需要能够准确评估移植细胞功能活性的模型系统。对于中枢神经系统而言，尽管异种移植仍是当前最先进的技术，但这类模型在技术上具有挑战性，通量有限且成本高昂。此外，其环境信号与人类细胞的相互作用并不完全匹配。本文介绍了一种经济、便捷且适用于高通量操作的模型，可用于将人类神经细胞移植至人脑类器官并进行追踪。这些类器官可利用商业试剂盒由人诱导多能干细胞轻松制备，并包含大脑的关键细胞类型。
我们首先通过将表达EGFP标记的人iPSC来源的神经前体细胞（NPCs）注射到这些类器官中，来演示该移植方案。接下来，我们讨论利用活细胞荧光显微镜追踪这些细胞在类器官中生长时需考虑的因素，并展示在4个月期间对移植的EGFP标记NPCs在类器官内的追踪过程。最后，我们提供了一套针对移植细胞及其局部微环境进行切片、循环免疫荧光染色和成像的实验方案。本文所介绍的类器官移植模型，可通过一种成本低廉且操作简便的方案，实现对移植人源细胞在人类微环境中的长期（至少4个月）直接追踪。因此，该模型不仅对神经细胞治疗（移植）研究具有重要价值，也可能为更准确地模拟中枢神经系统（CNS）肿瘤提供有力工具。

为验证脑类器官的身份特征，对成熟的（2个月大）脑类器官进行组织切片染色，检测PAX6（背侧神经前体细胞的标志物23）和SATB2（成熟、有丝分裂后上层神经元的标志物24）。如预期所示，PAX6+细胞位于类器官内部，而SATB2+细胞分布于上层区域（图2）。这些结果表明，所使用的脑类器官确实为分化试剂盒中指定的背侧前脑组织。为建立脑类器官移植系统的剂量依赖性，将不同数量的EGFP+诱导性多能干细胞（iPSC）来源的神经前体细胞（NPCs）注入2个月大的脑类器官中。GFP荧光信号随输入细胞数量呈现明显的剂量依赖关系，在输入细胞数达到10,000个及以上时，可稳定检测到EGFP+细胞团块（图3）。接下来通过长期追踪移植后的类器官，评估移植NPCs的存留与迁移能力。为此，将50,000个来自同一iPSC细胞系的EGFP+ iPSC来源NPCs移植至2–3个月大的脑类器官中。在随后的3–4个月内，于指定时间点对移植组及对照组类器官进行EGFP阳性成像观察。在此系列移植实验中，注射部位在整个为期4个月的追踪期间均保持可见（图4A）。移植后第9天起出现新的EGFP+细胞团块，并持续存在至实验终点（3–4个月，依类器官而定），表明移植细胞发生了迁移并在新位置实现整合（图4A）。在更高倍镜下观察，可见清晰的神经元形态，具有向类器官内部延伸的长突起（图4B），进一步证实了移植细胞的成功整合。
为了确定注射后晚期阶段注射细胞的分化状态，将追踪了4个月的类器官及其对照组固定，进行石蜡包埋，切成15 µm厚的切片，并贴附于载玻片上。随后对切片进行处理，采用单轮荧光染色（EGFP、TUJ1、NESTIN）或两轮连续染色以增加额外标记物（MAP2、GFAP）。初始的单轮染色证实了在注射部位存在EGFP+细胞，其中包括保持神经前体细胞（NPC）状态的细胞（NESTIN+TUJ1−）以及已向神经谱系分化的细胞（NESTIN−TUJ1+）（图5）。在对照组和注射组类器官中，仅观察到极少数NESTIN+的NPCs（其中大多数但并非全部为在注射部位的EGFP+移植NPCs），而绝大多数为TUJ1+的未成熟至成熟神经元（图5）。两轮染色提供了更详细的图像，显示在类器官外周大部分区域存在成熟神经元（NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−），而中间区域则为未成熟神经元（NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−）（图6A、B）。星形胶质细胞（NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+）在注射组和对照组类器官中均存在，并分散分布于外缘区域（图6A、B）。对注射组类器官中进行两轮染色的切片显示，在远离注射部位处存在一小簇EGFP+细胞的卫星克隆，这些细胞呈现出成熟神经元的表型（图6B、C）。其中一些细胞似乎与星形胶质细胞位置邻近；然而，未发现EGFP+细胞与GFAP染色完全重叠，提示它们是相邻存在而非自身转化为星形胶质细胞（图6B、C）。
<img alt="背侧前脑类器官：GFP标记细胞注射、显微成像、活细胞成像、免疫荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：标记细胞移植至脑类器官的模型示意图。 通过慢病毒转导生成标记细胞，将其移植到脑类器官中，并通过活细胞成像和免疫荧光进行追踪的流程示意图。缩写：GFP = green fluorescent protein。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；DNA、PAX6、SATB2染色；细胞标志物共定位分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：组织切片的免疫荧光染色显示早期和晚期类器官的结构特征。 一个2个月大的脑类器官经固定、石蜡包埋、切片后，使用PAX6、SATB2和DAPI进行染色。未染色切片用于设定曝光和积分时间，以避免自发荧光导致的假阳性信号。PAX6阳性细胞位于类器官内部，而SATB2阳性细胞则分布于表层区域。在整个15 µm厚的组织切片中，每隔4.2 µm采集一次Z轴图像序列。使用Gen5软件中的焦平面叠加功能（默认参数）将各光学切片合并。比例尺 = 100 µm。缩写：PAX6 = paired box 6蛋白；SATB2 = special AT-rich sequence-binding protein 2；DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞数量对染色摄取的影响；显示不同细胞密度的显微图像及实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：神经前体细胞在脑类器官中移植的剂量依赖性。 将0（阴性对照）、1,000、5,000、10,000 或 50,000 个GFP+ 诱导性多能干细胞（iPSC）来源的神经前体细胞（NPCs）移植到类器官中。移植后1周，使用配备GFP滤光立方体的Cytation 5成像系统对类器官进行成像。采用阴性对照设定曝光时间和积分时间，以最小化自发荧光。颜色越深，表示相对于阴性对照的EGFP荧光信号越强。比例尺 = 100 µm。这些为类器官整体的4倍放大图像。成像后，在显示前采用像素半径为50的滚动球背景扣除法，以校正类器官间背景强度的差异。移植部位以红色箭头标示，该区域显示最高程度的细胞植入。缩写：NPCs = 神经前体细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；EGFP = 增强型GFP；iPSC = 诱导性多能干细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞移植结果，显示移植细胞在数周内的生长情况；显微镜图像，比例尺为 100 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过荧光活细胞成像追踪移植细胞的生长、迁移和存留情况。（A）对照组和移植组（50,000 个 GFP+ iPSC 来源的 NPCs）类器官在两个独立的移植实验中，通过荧光活细胞成像连续追踪 2–4 个月。使用阴性对照类器官设定曝光时间和积分时间，以在每个时间点最大限度地减少自发荧光。在移植后指定时间点，使用 Cytation 5 上的 GFP 滤光立方体采集 EGFP 图像。颜色越深，表示相对于该时间点的阴性对照，EGFP 荧光信号越强。在显示前采用半径为 50 像素的滚动球背景扣除法，以校正类器官间背景强度的差异。每次成像时类器官大致保持相同的方向，图像经过旋转以保证显示的一致性，并清晰展示移植细胞的生长情况。最早时间点中确定的最高移植区域即为注射位点，用红色箭头标示。图中底部展示了一个阴性对照类器官的示例。（B）显示了移植后第 1 周和第 15 周时成功移植类器官的 20 倍放大图像示例。在显示前使用 FIJI 软件增强局部对比度，以确保神经突的可见性。比例尺 = 100 µm。缩写：NPCs = 神经前体细胞；GFP = 绿色荧光蛋白；EGFP = 增强型 GFP；iPSC = 诱导性多能干细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="类器官注射的荧光显微镜图像；DNA、GFP、NESTIN、TUJ1 标记物；比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：组织切片的免疫荧光染色显示移植的神经前体细胞在注射部位持续存在，并伴有迁移和神经分化。 来自（A）未注射和（B）移植类器官的单通道荧光图像。右侧的叠加图像显示了三个目标通道（NESTIN、TUJ1 和 EGFP），但未包含 DAPI。显示最小值设置为刚好排除阴性细胞的信号（EGFP 的阴性对照来自未注射组，其他通道则基于已知标记物组合确定）；显示最大值基于该抗体在任何细胞中观察到的最高信号。为便于直接比较，未注射组与移植组类器官的显示范围保持一致。比例尺 = 100 µm。缩写：NPCs = 神经前体细胞；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；TUJ1 = β-III 微管蛋白；EGFP = 增强型绿色荧光蛋白。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫荧光显微镜 DNA、GFP、MAP2、GFAP；图像配准示意图；细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：通过组织切片的循环免疫荧光染色评估移植细胞的分化状态与定位。 显示了未注射对照（A）与移植类器官（B）在第一轮和第二轮染色中的单通道荧光图像。显示的最低值设定为刚好排除阴性细胞的信号（EGFP 的阴性对照来自未注射样本，其他通道则基于已知标志物组合确定）；显示的最高值基于该抗体在任意细胞中观察到的最强信号。为便于直接比较，对照组与注射组类器官的显示范围（以及成像参数）保持一致。比例尺 = 100 µm。右侧显示了每个类器官每轮染色的叠加图像（不含 DAPI）。（B）对于进行了图像配准的注射类器官，所有图像均裁剪至两轮染色中均可见的区域。（B、C）对于注射类器官，EGFP+ 细胞区域以蓝色轮廓标出。（C）展示了如何利用 DAPI 匹配图像配准过程中的特征结构，随后为配准后图像的整体合并结果。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；TUJ1 = β-III 微管蛋白；EGFP = 增强型绿色荧光蛋白；MAP2 = 微管相关蛋白 2；GFAP = 胶质纤维酸性蛋白。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>克隆</td>
			<td>荧光染料</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗NESTIN</td>
			<td>10C2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗PAX6</td>
			<td>O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：染色所用抗体浓度。 缩写：TUBB3 = β-微管蛋白III；GFP = 绿色荧光蛋白；GFAP = 胶质纤维酸性蛋白；MAP2 = 微管相关蛋白2；PAX6 = 成对盒蛋白6；SATB2 = 富含AT序列结合蛋白2。

本文介绍了一种将标记的神经细胞移植并追踪其在人脑类器官中分布的实验方案。

细胞移植技术的进步需要能够准确评估移植细胞功能活性的模型系统。对于……

随着细胞治疗领域的日益发展，人们需要新的方法来评估这些细胞的功能。本方案可实现体外长期评估这些细胞在神经环境中的植入情况。该技术的主要优势在于所有组分均来源于人类。此外，移植物的植入情况可以轻松追踪，并且类器官所处的环境也易于改变，从而便于测试不同的药物或治疗方法。演示该技术的是我实验室中一位才华横溢的博士生 Iliana Ibanez。首先将诱导多能干细胞或iPSC来源的神经前体细胞（NPCs）的单细胞悬液从冰上取出，在4°C条件下以300g离心5分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于3毫克/毫升的溶解性基底膜基质中，以获得每注射2微升的终体积。立即将悬液放回冰上，直至使用。将预冷的注射器从20摄氏度冰箱转移至冰桶中，以备后续使用。接下来，将脑类器官培养板从培养箱中取出，使用宽口吸头将类器官转移至35毫米培养皿中。为稳定类器官并便于注射，尽可能吸除培养基，注意避免损伤类器官。将含有类器官的35毫米培养皿置于解剖显微镜下，以利于进行注射操作。当类器官准备就绪可用于注射时，使用预冷的P20枪头轻轻重悬表达EGFP的NPC细胞，并将2微升细胞悬液转移至预冷的无菌玻璃载片上。从冰上取出预先装好的胰岛素注射器，将针头斜面朝下，缓慢吸取2微升细胞悬液。在将显微镜对准培养皿之前，先打开含有类器官的培养皿盖子。用一只手握住培养皿，将针头斜面朝上，另一只手缓慢将细胞注入类器官表面。注射细胞后，盖上培养皿盖，将注射后的类器官孵育一至两分钟。然后，使用宽口枪头将类器官转移至24孔板前，轻轻向孔板中加入500 µL类器官培养基。将类器官置于37°C、5% CO₂条件下培养，每隔两天更换一次完全培养基。将未注射或阴性对照类器官置于荧光显微镜下进行观察。将光照强度设置在1至2之间，曝光时间设置在80至100毫秒之间，以尽量减少自发荧光。接下来，加载阳性对照类器官，并提高曝光时间以确保标记细胞可见。使用宽口移液器吸头重新定位类器官，以找到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）阳性区域进行注射。在接种类器官之前，彻底移除类器官中的培养基，并使用选定的设置对其进行成像。成像完成后，立即添加新鲜培养基，以防止类器官干燥。在对所有类器官重复完成培养基更换和成像操作后，将类器官放回正常培养条件并进行常规培养基更换。按照所需时间间隔重复成像操作。将载玻片置于盛有甲苯的考普林染色缸中处理两分钟，并重复此步骤一次。然后，将玻片转移至盛有100%乙醇的玻璃染色缸（Coplin缸）中，浸泡2分钟。重复此步骤一次，随后将玻片转移至盛有水的Coplin缸中，浸泡2分钟。再用清水重复洗涤一次。然后，将一个塑料容器放入水浴中，确保塑料容器不接触水浴底部。将柠檬酸缓冲液倒入塑料容器内，并加热至95至100摄氏度。当缓冲液达到所需温度后，将玻片放入缓冲液中，并用盖子松松地盖住容器，将玻片在水浴中孵育30至40分钟。孵育后，将塑料容器从水浴中取出，在室温下冷却20分钟。用PBS洗涤载玻片三次，每次两分钟。用纸巾吸去PBS，注意不要触碰样本。配制通透缓冲液，并用其填充玻璃载片染色缸。将载片浸入通透缓冲液中，孵育10分钟。用PBS重复洗涤三次，每次两分钟。然后，配制染色液以覆盖每个样本，并在室温下孵育1小时，向类器官载玻片上加入25 µL染色液。孵育结束后，用PBS洗涤3次，每次2分钟，随后将载玻片置于玻璃染色缸中，用蒸馏水冲洗以去除盐分。接着，向每个样本加入10 µL封片液和DAPI，然后使用荧光显微镜对载玻片进行成像。向已装有半满的2X淬灭缓冲液的玻璃染色缸中加入45毫升PBS，并将载玻片放入该染色缸中。在4摄氏度下孵育过夜。在重复染色和成像之前，使用荧光显微镜检查荧光染料是否已有效淬灭。绿色荧光蛋白（GFP）荧光强度与接种细胞数量之间存在明显的剂量依赖关系，在接种细胞数达到10,000个及以上时，可稳定检测到EGFP阳性细胞团块。对移植类器官及其对照组进行EGFP阳性成像，结果显示移植部位在长达四个月的追踪期间持续存在。移植后第9天出现额外的EGFP阳性细胞团块，并持续至实验终点，表明细胞发生了迁移并在新位点成功整合。在更高倍率下，可观察到清晰的神经形态，细胞具有延伸至类器官内部的长突起，证实了注射细胞的成功整合。最初的单轮染色确认了注射部位存在 EGFP 阳性细胞，其中包括仍保持神经前体细胞（NPC）状态的细胞，以及已向神经谱系分化的细胞。在对照组和注射组的类器官中，仅观察到极少数 Nestin 阳性的神经前体细胞，而大多数为 TUJ1 阳性的未成熟及成熟神经元。双轮染色显示了更多细节，揭示出类器官大部分外周区域周围存在成熟的神经元，而中间区域则分布着未成熟神经元。星形胶质细胞存在于注射组和对照组的类器官中，并分散分布于外缘区域。对注射组类器官进行双轮染色的切片显示，在远离注射部位的位置存在一个小的EGFP阳性细胞卫星克隆群，这些细胞已呈现出成熟神经元的表型。这些细胞集落中有一些似乎靠近星形胶质细胞。然而，没有任何EGFP阳性细胞与GFP染色完全重叠，这表明它们只是与星形胶质细胞相邻，而非自身生成了这些星形胶质细胞。在注射类器官时，必须避免施加过大的力量或操作过快，否则可能完全破坏类器官。因此，在进行活细胞示踪后，类器官可被收集并用于流式细胞术分析或单细胞测序等方法，从而帮助我们了解细胞的分子状态。该技术对于推动神经退行性疾病的细胞治疗，以及脑肿瘤或转移瘤的建模研究具有重要意义。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

神经细胞移植的人脑类器官模型

来源：Palma-Tortosa, S., et.al. 成人人类皮层的类器官培养作为人类干细胞移植与验证的离体模型. J. Vis. Exp.

将干细胞来源的神经祖细胞移植至人脑皮层切片

来源： Ibanez-Rios, M.I., 等一种人脑类器官神经细胞移植模型。 J. Vis. Exp.

将荧光标记的神经前体细胞注射至人脑类器官以建立移植模型

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in...

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。...

利用自制微型生物反应器由诱导性多能干细胞生成脑类器官

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稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

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靶向显微注射与电穿孔法对灵长类大脑类器官进行遗传修饰

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