利用改良酶联免疫吸附测定法检测和定量人血浆中降钙素基因相关肽（CGRP） 关键词：降钙素基因相关肽，CGRP，酶联免疫吸附测定，ELISA，人血浆，肽检测，定量分析

该改良的ELISA方案可用于人血浆中降钙素基因相关肽（CGRP）的纯化及准确定量。本方案已通过必要的验证实验，可为未来定量方法的标准化提供参考。该方案具有以下优势：在发生显著蛋白酶降解前进行样本处理，通过固相萃取实现纯化，并通过向微孔板中加入封闭缓冲液以减少非特异性结合。

CGRP 在偏头痛的病理生理过程中起着重要作用，可能成为生物标志物的候选者。CGRP 还被发现与心脏疾病、皮肤病、病毒感染甚至与 COVID-19 相关的疾病过程有关。首先，采用标准静脉穿刺方法，从肘前静脉采集 5 毫升全血，注入 6 毫升含 EDTA 的真空采血管中。

为阻断目标肽段的降解，加入0.5毫升抑肽酶（aprotinin）竞争性丝氨酸蛋白酶抑制剂。将离心管颠倒10次，并置于冰上保存至下一步操作。随后在4摄氏度条件下以600 ×g离心4分钟。

将血浆组分转移至一个2毫升圆底无菌冻存管中。立即将冻存管在-80°C条件下保存，最长可保存两周。为提取血浆样本，将提取柱放入一个15毫升锥形离心管中。

将5毫升100%甲醇和10毫升超纯水依次通过固相萃取柱以活化柱子。液体将在重力驱动下流经萃取柱并收集于离心管中。弃去积聚的过量液体，以防止其淹没萃取柱，并确保柱子在实验过程中不干燥。

将250微升血浆用750微升4%乙酸稀释，缓慢通过柱子。然后用10毫升乙酸洗涤柱子。去除多余液体后，将柱子转移至新的15毫升锥形离心管中。

准备3毫升甲醇乙酸溶液，用于洗脱降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide）或CGRP。每次通过1毫升该溶液穿过小柱，并在每次洗脱之间等待25分钟。最后一次洗脱后，试管中总共含有3毫升洗脱液。

将1毫升洗脱液转移至1.7毫升微量离心管中，在小型离心机中离心1秒以沉淀洗脱液。然后在真空离心机中以1,400转/分钟、4摄氏度的条件干燥样品。在进行检测前，立即用解冻的酶免疫分析（EIA）缓冲液重新溶解干燥样品。

进行板孔封闭时，向每个孔中加入 250 微升 TBS 鱼明胶封闭缓冲液。用封板膜覆盖板孔，在室温下孵育 2 小时。孵育结束后，移去封板膜，通过倒置平板排空孔内液体。

然后将酶标板在纸巾上轻压以去除残留液体，并在超净工作台中干燥10分钟。待酶标板明显干燥后，将其放入带有硅胶干燥剂小包的自封铝箔袋中。于-20摄氏度保存24小时。

进行检测前，将所有样品和配制好的试剂在室温下解冻。清洗板孔时，每孔加入 300 微升洗涤缓冲液，静置 30 秒，然后弃去洗涤缓冲液，重复洗涤五次。

最后一次洗涤后，按先前示范的方法吸干酶标板。接着，向指定的两个非特异性结合（NSB）孔中各加入100微升EIA缓冲液。然后，向相应的孔中加入100微升CGRP标准品，随后将复溶后的样本和质控品分别重复加样至对应孔中。

除空白孔外，向每个孔中加入 100 微升 CGRP 示踪剂。最后，使用透明封板膜密封酶标板，防止样品和试剂蒸发，并在 4 摄氏度下孵育 16 至 20 小时。孵育结束后，根据制造商说明书配制 Ellman 试剂。

将平板倾去内容物后，按先前演示的方法每孔洗涤三次。最后一次冲洗后，以120转/分钟的速度振荡平板两分钟。再次将平板洗涤三次，并用吸水纸拍干。

轻敲倒置的酶标板，直至孔中液体明显去除。然后在除空白孔外的每个孔中加入200微升Ellman's试剂。将酶标板覆盖后，用铝箔包裹以避光，并在室温下避光孵育1小时，随后测定吸光度。

本研究表明，加入封闭步骤后，每个CGRP加标样本的回收率均在可接受范围内。然而，当省略封闭步骤时，非特异性结合导致回收率超过125%的上限。采集血液样本后应立即加入抑肽酶，以减少CGRP的降解。此外，在进行ELISA检测前，应将封闭缓冲液加入微孔板中，以进一步降低非特异性结合。

因此，该方案可通过定量偏头痛、前庭性偏头痛患者与对照组血浆中降钙素基因相关肽（CGRP）的水平，来探索CGRP作为前庭性偏头痛生物标志物的潜在价值。