Name: 用化学发光法实时检测水稻免疫反应中活性氧的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学习使用L-012化学发光法实时检测水稻组织中活性氧的产生。该方法标准化且可重复，适用于研究植物免疫反应中的ROS动态变化。

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本工作获得了以下资助：上海市自然科学基金（项目编号：21ZR1429300/BS1500016），&#160;上海交通大学（农业交叉项目，项目编号：AF1500088/002）、上海市农业种子协同创新中心（项目编号：ZXWH2150201/001）&#160;对范江波的资助，&#160;以及上海交通大学医工交叉合作项目（项目编号：21X010301734）对李灿的资助。

注意：该实验方案适用于不同的植物组织。本方案中使用水稻叶鞘和叶片圆片进行PAMP诱导后的ROS检测。由于差异主要源于取样方法的不同，下文仅描述通用步骤，必要时会注明具体操作。
1. 植物培养
<ol>
	<li>用70%乙醇对去壳的水稻种子进行1分钟的灭菌处理，然后用40%次氯酸钠（NaClO）处理1小时。随后用无菌水冲洗种子5次，以去除残留的氯。</li>
	<li>将种子无菌接种于1/2 MS培养基（2.37 g/L Murashige和Skoog（MS）培养基，30 g/L蔗糖，2.1 g/L植胶，pH 5.7，经高压灭菌）上。
	<ol>
		<li>在水稻叶鞘法中，将种子直接接种于含MS培养基的无菌玻璃容器中。</li>
		<li>在叶盘法中，将种子接种于MS平板上培养5–7天，然后移栽至生长基质或土壤中（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将幼苗置于光照培养室中，在12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下培养。</li>
</ol>
2. 组织制备与预处理
<ol>
	<li>水稻叶鞘
	<ol>
		<li>在活性氧检测前1天，用锋利的剃须刀片或外科刀片将10日龄水稻幼苗的叶鞘切成3 mm长的片段（图1B）。</li>
		<li>将五个叶鞘片段放入96孔微孔板的单个孔中，每孔加入100 µL ddH2O，在25 °C黑暗条件下孵育10–12小时，以使伤口损伤相关的离子渗漏和防御反应减弱（图2）。 
		注意：切割时应确保切口垂直，以保证各片段暴露于诱导溶液的表面积一致，这是获得高度可重复结果的重要步骤。操作时应轻柔移动片段，避免在片段上制造额外切口或损伤，以免引起数据变异。原则上，每次实验至少应设置五个重复，因为活性氧数值的变异较大；重复数量越多，数据越可靠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>叶圆片
	<ol>
		<li>使用带推杆的活检打孔器，从4–6周龄水稻植株上切取直径为4 mm的叶圆片。为减少数据变异，应始终从主茎第二片叶（从顶部数起）的中部三分之一区域切取叶圆片（图1C）。</li>
		<li>将一个叶圆片放入含100 µL ddH2O的96孔微孔板单个孔中，进行10–12小时的预处理，以消除伤口相关反应，防止其干扰PAMPs诱导的活性氧产生（图2）。 
		注意：操作时应轻柔处理叶圆片，避免在实验过程中造成额外切割或损伤，以防引起数据变异。活性氧的诱导主要发生在切缘细胞，因为水稻组织（叶片或叶鞘）表面覆盖有疏水层，只有切缘细胞能与诱导溶液接触（参见讨论部分）。</li>
		<li>在微孔板孔中进行水预处理时，应使所有叶圆片漂浮，且背面朝上，以避免因叶片正反面差异导致的实验变异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="组织培养植物，生长阶段；植物发育和种子形成过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于鞘组织取样的水稻幼苗生长条件与生长阶段，以及实验中所用的水稻叶鞘和叶片部位示意图。（A）在无菌条件下于1/2 MS培养基中培养10天的水稻幼苗可用于活性氧（ROS）检测。无菌处理的水稻种子接种于1/2 MS培养基上，在透明玻璃试管（直径8.5 cm，高15 cm）中按12小时光照/12小时黑暗的光周期培养。（B）叶鞘取样部位的示意图。叶鞘取自培养10天的水稻幼苗，位于根部上方、第一片叶下方。（C）叶圆片取样位置的示意图。叶圆片可取自健康水稻植株主茎第二片叶（从顶部计数）的中间三分之一区域，适用于任意生长阶段的植株。缩写：ROS = reactive oxygen species（活性氧）；MS = Murashige and Skoog（Murashige与Skoog培养基）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="ELISA 板示意图，显示材料 A-H 中 PAMP 与 ddH2O 的结合分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：使用不同细胞系测量ROS产生的培养板设置示意图 Oryza sativa. 使用96孔板对水稻组织进行预处理与检测。第1行、第2行和第3行（每块板最多可设八行）可为任意感兴趣的材料，如不同品种、突变体或转基因株系。组织分别用含PAMP的诱导溶液（PAMP，白色）或不含PAMP的溶液（ddH₂O，蓝色）进行处理。2O，灰色）来检测ROS反应。需要注意的是，待测样本越多，读数之间的时间间隔就越长。缩写：ROS = 活性氧；PAMP = 病原体相关分子模式；ddH₂O = 双蒸水2O = 双蒸水。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 准备诱导溶液
<ol>
	<li>用 ddH2O 将 L-012 粉末溶解配制成 20 mM（6.23 mg/mL）的水溶液，制备成储存液。然后用 50 mM Tris HCl 缓冲液（pH 7.5）将储存液稀释，得到终浓度为 500 µM L-012 的工作液。储存液应冷冻保存，使用前再稀释成工作液。</li>
	<li>配制含有 PAMP、L-012 和辣根过氧化物酶（HRP；10 mg/mL 溶于 ddH2O）的诱导溶液。对于 10 mL 诱导溶液，混合 9.4 mL 的 50 mM Tris HCl（pH 7.5）溶液、400 µL L-012 溶液、100 µL HRP 和 100 µL flg22（PAMP；10 mM 溶于 ddH2O）。对于阴性对照，用 100 µL ddH2O 替代 PAMP。 
	注意：配制好的诱导溶液应置于室温下，以避免对水稻组织造成冷应激。根据需要也可使用其他 PAMP 进行处理，例如几丁质（终浓度为 20 ng/mL）。由于 L-012 对光敏感，所有含有 L-012 溶液的管子均需用铝箔包裹避光。</li>
</ol>
4. 启动软件并使用参考的酶标仪设置实验方案（参见材料表）
注意：设置微孔板读数仪软件的参数需要一定时间。建议在加入诱导溶液前，提前准备好仪器和程序（可一键启动）。
<ol>
	<li>启动软件。点击 实验 单击按钮以创建新方案或使用现有方案。</li>
	<li>点击 步骤 在弹出窗口中设置酶标板。选择需要监测的孔位。</li>
	<li>点击 开始动力学 建立总量 运行时间 和 读取间隔. 设置 运行时间 35分钟或更长时间，具体取决于实验要求。为了尽可能频繁地获取读数，请选择 最短间隔根据信号强度，选择1 s或更长的积分时间。 
	注：读数间隔取决于样本数量和信号积分持续时间。</li>
	<li>点击 验证 | 确定 以确认设置。</li>
	<li>点击 检测新培养板 在弹出窗口中等待软件提示加载板对话框。将待测板放置在载体上。</li>
	<li>在此暂停，等待诱导系统的建立（见下一节）。一旦诱导系统准备就绪，立即点击 运行 开始读数。</li>
</ol>
5. 建立诱导系统并实时测定活性氧的产生
<ol>
	<li>小心移除含有预处理组织的孔中 ddH2O，避免对组织造成损伤或干燥。</li>
	<li>使用多通道移液器向含有组织的孔中加入 200 µL 诱导溶液。</li>
	<li>轻轻振荡混匀。点击 运行 开始检测。 
	注意：经 PAMP 处理后，植物组织会迅速响应并产生活性氧（ROS）。因此，当存在多种处理时，建议先处理不含 PAMP 的阴性对照，以缩短操作时间。应尽可能快速操作，以减少不同处理之间的诱导延迟。从加入诱导溶液到开始检测的时间越短，越有利于捕获重要的实验数据。</li>
</ol>

<ol><li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li>
<li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+are+good%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li>
<li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+calcium%2C+and+electric+signals%3A+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li>
<li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+gene+network+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li>
<li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+burst+of+plant+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+oxidases%3A+the+engines+of+ROS+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li>
<li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li>
<li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li>
<li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li>
<li>Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li>
<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究旨在建立一种高效的方法，用于定量检测水稻组织在PAMP处理后早期活性氧（ROS）的产生。该方法为实时测定经处理水稻组织中质外体ROS的生成提供了标准化操作流程。该方法操作简便、成本低廉、组分明确，且不依赖商业试剂盒。利用该方法，研究人员可研究植物在遭受生物或非生物胁迫时质外体ROS的实时生成情况。
在本实验方案中，选择L-012作为化学发光试剂，因为它是一种无毒的化合物。鲁米诺（luminol）被广泛用于化学发光检测以测定活性氧（ROS）的产生。然而，鲁米诺在用于水稻及其他植物组织中活性氧检测时存在三个缺点：水溶性差、发光反应持续时间短以及反应所需的pH条件较为剧烈。鲁米诺仅在碱性条件下发光，最适pH为9.5，该条件对植物细胞过于严苛，会引发非特异性反应。此外，鲁米诺的发光效率远低于L-012；而L-012在中性或接近中性的生理条件下具有最高的发光灵敏度。因此，L-012正越来越多地被应用于活体组织或细胞系统中检测活性氧的产生。
PTI反应中的活性氧产生受到多种内外因素的影响，因此PTI反应中活性氧诱导的变异性较大。为了...

活性氧（ROS）是一类化学性质活泼的氧衍生物，包括超氧阴离子自由基（O2-）及其衍生物、羟基自由基（OH-）、过氧化氢，以及单线态氧或氧化还原反应的产物，这些物质在质体和叶绿体、线粒体、过氧化物酶体及其他亚细胞区域中持续产生1。活性氧在多种生物过程中发挥重要作用，对所有植物的正常生理功能至关重要2,3,4。活性氧的功能谱广泛，从调控植物生长发育到感知非生物和生物胁迫均有参与5,6,7,8。
在植物免疫系统中，定位于植物细胞质膜的受体——即模式识别受体（PRRs）——可识别病原体来源的化学物质——病原体相关分子模式（PAMPs）。这种识别会触发一系列快速免疫反应，包括钙离子内流、活性氧爆发以及MAPK级联反应；因此，这一层次&#160;免疫的一种形式被称为PAMP触发的免疫（PTI）。活性氧爆发是PTI的标志性反应，其检测被广泛应用于与PTI相关的研究中9,10由PAMPs触发的ROS产生归因于定位于质膜的NADPH氧化酶，即呼吸爆发氧化酶同源物（RBOH）家族蛋白，这类蛋白将细胞质中的NADPH或NADH的电子转移至胞外氧气，从而生成超氧阴离子（O₂⁻）2-），可自发转化为过氧化氢（H₂O₂）2O2) 由超氧化物歧化酶8PAMP诱导的ROS爆发非常迅速，通常在PAMP处理后仅几分钟内出现，并在约10–12分钟时达到峰值。绝大多数ROS分子为过氧化氢（H₂O₂）。2O2），可通过化学发光检测法轻松且稳定地检测。
在化学发光过程中，化学发光试剂在催化剂作用下与活性氧反应，生成激发态中间产物。随后，产物中的电子通过非辐射跃迁返回基态，并释放出光子。常见的化学发光试剂包括鲁米诺（luminol）和L-012，其中鲁米诺应用最为广泛11,12,13。然而，越来越多的研究人员选择使用L-012来检测活性氧（ROS）的产生，因为在中性或接近中性的pH条件下，L-012的发光效率远高于鲁米诺。
本文介绍了一种基于L-012的优化化学发光法，用于实时检测水稻（Oryza sativa）组织——叶片圆片和叶鞘——在PAMPs诱导后活性氧（ROS）的产生。该方法操作简便、稳定且标准化，能够高度灵活地适应不同的实验需求。在严格控制的条件下，采用该方法获得的数据具有高度可重复性。

<table><tbody><tr><td>96孔微孔板</td><td>WHB</td><td>WHB-96-01</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Innochem</td><td>A43543</td><td></td></tr><tr><td>flg22</td><td>生工生物</td><td>p20973</td><td>PAMP</td></tr><tr><td>Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>L-012</td><td>FUJIFILM</td><td>120-04891</td><td>8-氨基-5-氯-7-苯基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]吡嗪-1,4-二酮，CAS编号：143556-24-5</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>MS培养基</td><td>Solarbio</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCLO</td><td>阿拉丁</td><td>S101636</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）</td><td>Sigma</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>植物凝胶</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>取样器</td><td>Miltex&amp;nbsp;</td><td>15110-40</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>生工生物</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>生工生物</td><td>A610195</td><td></td></tr></tbody></table>

利用化学发光法实时检测水稻免疫反应中的活性氧产生

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

活性氧（ROS）在多种生物过程中发挥着关键作用，包括对非生物和生物胁迫的感知。当植物受到病原体侵染或病原体相关化学物质（即病原体相关分子模式 [PAMPs]）刺激时，会迅速诱导一系列免疫反应，其中包括活性氧的爆发，这一过程被称为PAMP触发的免疫（PTI）。活性氧爆发是PTI反应的标志性特征，由定位于质膜上的一类NADPH氧化酶——RBOH家族蛋白——催化产生。绝大多数活性氧为过氧化氢（H2O2），可通过基于鲁米诺的化学发光法方便且稳定地检测。化学发光是一种产生光子的反应，其中鲁米诺或其衍生物（如L-012）在催化剂作用下与活性氧发生氧化还原反应。本文介绍了一种优化的基于L-012的化学发光方法，用于实时检测水稻组织在PAMP诱导后胞外空间（apoplast）中活性氧的生成。该方法操作简便、结果稳定、标准化程度高，在严格控制的条件下具有高度可重复性。

此处以水稻材料为例，检测经flg22处理后产生的活性氧（ROS）。诱导后ROS的生成呈瞬时性。在水稻中，ROS产量的增加最早在1-2分钟时被检测到，10-12分钟达到峰值，约30-35分钟后恢复至基础水平（图3）。与未添加PAMP的对照实验（诱导溶液中不含PAMP，未引起明显的ROS诱导）相比，仅在含有flg22或其他PAMP（如几丁质）的诱导溶液中才会特异性地引发ROS爆发。同时，ROS的总产量可通过曲线计算得出（图4）。
<img alt="flg22 和 ddH2O 随时间变化的化学发光图，显示反应强度的变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
<strong class="x...

本文介绍一种用于实时检测水稻组织在病原体相关分子模式触发的免疫反应中胞外空间活性氧（ROS）产生的方法。该方法操作简便、标准化程度高，在受控条件下可获得高度可重复的实验结果。

活性氧（ROS）在多种生物过程中发挥着关键作用，包括对非生物和生物胁迫的感知。当病原体侵染时……

本方案描述了一种优化的基于L-012的化学发光法，用于实时检测水稻组织在PAMP诱导下活性氧（ROS）的产生。该方法简便、标准化，在严格控制的条件下具有高度可重复性。本实验操作将由我实验室的博士生On Ying进行示范。首先，用70%乙醇对去壳的水稻种子进行一分钟的灭菌处理，然后用40%次氯酸钠处理一小时。用无菌水冲洗种子五次，以去除残留的氯。在水稻叶鞘法中，将种子直接接种于含有Murashige和Skoog（MS）培养基的无菌玻璃容器中。在采用叶盘法接种种子时，先将种子接种于MS培养基平板上培养5至7天，然后移栽至生长基质或土壤中。将幼苗置于光照培养室中生长，光照周期为12小时光照、12小时黑暗。在进行活性氧检测（ROS assay）前一天，用锋利的剃须刀片或手术刀片将10天大的水稻幼苗的叶鞘切成3毫米长的片段，用于预处理。将五段叶鞘放入含有100微升双蒸水的96孔微孔板的单个孔中，浸泡10至12小时。使用带推杆的活检打孔器，从4至6周龄的水稻植株上切取叶盘。为减少数据变异，应始终从主茎第二片叶的中间三分之一区域切取叶盘。接下来，将一个叶圆片放入含有 100 µL 双蒸水的 96 孔微孔板的单个孔中，预处理 10 至 12 小时。确保所有叶圆片在微孔板的孔中漂浮且正面朝上，以进行水预处理，避免因叶面差异带来的变异。通过混合 9.4 mL 50 µmol 的 Tris HCl、400 µL L012 溶液、100 µL 辣根过氧化物酶和 100 µL Flg22 来配制诱导溶液。向孔中加入 200 微升诱导溶液。启动软件，点击“实验”按钮以创建新方案或使用现有方案。在弹出窗口中点击“程序”以设置酶标板，并选择需要监测的孔。单击“开始动力学”并根据实验需求将运行时间设置为30分钟或更长。选择最小间隔以尽可能频繁地获取读数。积分时间则根据信号强度选择1秒或更长时间。单击“验证”，然后单击“确定”以确认设置，接着在弹出窗口中单击检测新板，等待软件提示加载板对话框。小心地从含有预处理组织的孔中移除双蒸水，避免对组织造成损伤或干燥。使用多通道移液器向含有组织的孔中加入 200 µL 诱导溶液。将待测平板放置于载体上并开始检测。为通过Flg22诱导活性氧（ROS），使用叶圆片及三毫米长的叶鞘。ROS生成过程监测35分钟。柱状图表示由五次技术重复计算得出的标准差均值。在水稻中，活性氧（ROS）的产生增加最早在1至2分钟时被检测到，10至12分钟时达到峰值，约30至35分钟时恢复至基线水平。ROS的总量由曲线计算得出。为了获得ROS值的总量，需将公式应用于相应的数据集，以计算每个时间间隔内产生的ROS量，再通过应用求和公式将各时间点的ROS量相加，从而计算出总生成量。将一个完整孔或两个半片的叶圆片放入已预处理的96孔微孔板中，该微孔板各孔已预先加入100 µL双蒸水，并在10至12小时内进行孵育，随后用Flg22处理以诱导ROS产生。两个半片叶圆片样品的读数显著高于完整叶圆片的读数。通常情况下，两个半圆叶片样品的总值之和约为整个叶片圆片样品的1.6倍，该比值与样品的边缘长度成正比，而非与样品的面积成正比。这一结果支持活性氧（ROS）主要在伤口部位的细胞中产生。在进行该实验操作时，应轻柔处理组织，避免造成额外切口，以免引入数据变异。该方法可应用于植物组织中任何其他产生活性氧的生理过程。

real-time-detection-reactive-oxygen-species-production-immune

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科研

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Biology

生物学

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本视频演示了一种检测拟南芥（Arabidopsis）叶片在免疫激发后氧化爆发的实验方法。从植物叶片上切取叶圆片，与作为微生物相关分子模式（MAMPs）的细菌多肽共同孵育。当植物细胞识别MAMPs后，会诱导产生活性氧（ROS），通过化学发光法检测胞外ROS的生成。...

一种检测氧化爆发的实验方法 拟南芥 免疫诱导后的叶片圆片

本视频展示了一种在病原体相关分子模式（PAMP）诱导下，实时检测水稻组织中活性氧（ROS）产生的实验方法。将剪切的叶鞘段和叶片圆片暴露于一种来源于细菌鞭毛的肽段，该肽段作为PAMP发挥作用。当植物细胞上的模式识别受体（PRRs）识别该肽段后，会迅速引发短暂的ROS产生，该过程可被检测到 通过...

一种检测水稻组织免疫诱导后活性氧产生的测定方法

我们改进了一套可用于多种阿米巴和哺乳动物细胞模型中活性氧（ROS）检测的方案，适用于定性和定量研究。...

在阿米巴模型系统中检测、可视化与定量活性氧的生成

本文介绍了两种在免疫诱导物处理后定量分析拟南芥（Arabidopsis...

模式触发的氧化爆发与幼苗生长抑制实验 拟南芥

本文介绍了一种利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内总活性氧（ROS）的实验方案。该方法可通过荧光显微镜观察贴壁细胞中活性氧的定位，并利用荧光酶标仪对活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便、高效且成本较低。...

通过2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯染色法检测贴壁细胞中的总活性氧物种

Escherichia coli 是新生儿革兰氏阴性菌性脑膜炎的主要致病原因。在细菌感染过程中，中性粒细胞产生的活性氧物质发挥重要的杀菌作用。本文介绍一种检测脑膜炎致病性 E. coli...

实时定量检测感染脑膜炎病原体的中性粒细胞中的活性氧 大肠杆菌

本文介绍了一种改进的趋化性检测实验方案。该方案旨在减少传统细菌趋化性方法的操作步骤和成本，为研究植物-微生物相互作用提供有价值的资源。...

一种改进的趋化性检测方法用于快速鉴定根系分泌物中的根际细菌趋化物

本方案描述了一种利用二氢乙啶（DHE）作为荧光染料探针，通过高通量筛选方法定量检测细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案详细介绍了在三种不同的人肝细胞癌细胞系中定量评估细胞内活性氧（ROS）的实验方法。...

使用二氢乙啶（DHE）荧光染料高通量筛选评估活性氧（ROS）的生成

学习使用L-012化学发光法实时检测水稻组织中活性氧的产生。该方法标准化且可重复，适用于研究植物免疫反应中的ROS动态变化。

利用化学发光法实时检测水稻免疫反应中的活性氧产生

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