Name: 根癌农杆菌介导的窄叶车前草遗传转化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 了解利用根癌农杆菌介导的遗传转化技术建立窄叶车前草稳定转基因体系的方法。该方案转化效率达20%，为研究植物维管生物学和胁迫生理学提供了可靠的实验基础。

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本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助（项目号：EDGE IOS-1923557，授予 C.Z. 和 Y.Z.）。

注意：步骤 1.4-1.8、2.3-2.5、3.3-3.6、4.1-4.6、5.1-5.7 和 6.1-6.3 必须在无菌条件下进行，使用洁净工作台以防止污染。
1. 转化用植物材料的繁殖
<ol>
	<li>使用市售的野生型（WT） Plantago lanceolata 种子（参见 材料表根据所需植物数量，将溶液加入50 mL离心管中，至5 mL刻度线处。 
	注意：当仅需少量种子时，可使用2 mL 微离心管，但管内液体体积不应超过0.1 mL，因为种子过多会降低灭菌效率。</li>
	<li>将种子浸入75%乙醇中60秒。</li>
	<li>弃去乙醇，然后将种子浸入20%次氯酸钠溶液（20% NaClO，80%无菌水）中处理40分钟，轻轻倒置离心管，使所有种子均与溶液充分接触。 
	注意：为获得最佳效果，次氯酸钠溶液必须新鲜配制。</li>
	<li>在超净工作台中，弃去次氯酸钠溶液，然后用蒸馏水清洗种子（共五次）。最后一次漂洗后，向种子中加入少量水，这有助于将种子转移至培养板上。</li>
	<li>使用灭菌镊子将种子转移至预先准备好的直径为95 mm、高为100 mm的含固体MS培养基的培养皿中（表1）。将种子均匀地铺在培养皿表面，每粒种子之间间隔约1厘米，以防止萌发后的幼苗过于拥挤（图1A) .</li>
	<li>用两层石蜡膜密封培养板以防止污染，然后在冷白色生长灯下孵育（参见 材料表室温（22 °C，50 µmol m⁻²）-2s-1，12小时光照/12小时黑暗）。种子通常在5-6天内萌发。</li>
	<li>当幼苗发芽并生长到足够大，可以移栽时（图1B），通常在萌发后2至3天，使用无菌镊子将幼苗转移至含有50-100 mL MS培养基的无菌培养盒中（表1理想情况下，每个盒子中仅种植五株幼苗，以获得最优质的根系。</li>
	<li>用手术胶带密封盒子，然后将植物置于冷白色生长灯下培养（参见 材料表），条件同步骤1.6所述。植物应在约3-4周后准备就绪用于转化，此时主根长度约达2 cm，侧根呈白色。 
	注意：培养基制备配方和维生素储备液详见于 表1 和 表 2.</li>
</ol>
2. 质粒构建与E. Coli转化
注意：具体的质粒构建步骤取决于目标基因。本实验中，使用限制性内切酶 HindIII 和 SalII，通过标准克隆方法20，将 1.5 kb 的 AtPP2 启动子插入含有 GUS 的双元质粒 pBI101 中（见材料表）。AtPP2（韧皮部蛋白 2）是一种特异性在韧皮部表达的基因21。
<ol>
	<li>从拟南芥（Arabidopsis）中使用引物对 5'-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3'（正向）和 5'-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGTATTTATTTTTG-3'（反向）克隆启动子。图2展示了含有AtPP2:GUS插入片段的双元质粒载体示意图。</li>
	<li>质粒构建完成后，采用热激法将质粒转化至DH5α E. coli（见材料表）感受态细胞中22，随后在37 °C、150 rpm振荡条件下培养1.5小时。</li>
	<li>取每种转化菌液150 µL，接种于含适当选择性抗生素的LB琼脂培养基平板（表1）上（本实验方案所用菌株为50 mg/L卡那霉素；见材料表），然后在37 °C培养16–24小时。 
	注：本研究中使用的细菌菌株为A. tumefaciens GV3101。</li>
	<li>接下来，采用菌落PCR筛选阳性重组子23。 
	注：在本实验方案中，使用以下引物扩增目标基因：5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3'（正向）和5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3'（反向）。
	<ol>
		<li>在PCR仪（见材料表）中进行反应，循环条件为：95 °C预变性3分钟，随后进行35个循环（每个循环包括：95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸2分钟），最后在72 °C延伸10分钟。</li>
		<li>将阳性菌落接种于6 mL LB液体培养基（表1）中，加入适当抗生素（50 mg/L卡那霉素），在37 °C、200–250 rpm条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过夜培养后，按照标准操作程序从细菌中提取质粒24。</li>
</ol>
3. 用质粒转化根癌农杆菌（A. tumefaciens）
<ol>
	<li>质粒提取后，利用电穿孔法将修饰后的质粒转化至目标感受态细胞株中。本实验中使用农杆菌（A. tumefaciens）菌株 GV3101&#160;。请遵循标准化的电穿孔技术操作方法25。</li>
	<li>电穿孔后，将感受态细胞重悬于 1 mL LB 液体培养基中，于 28 °C、100 rpm 条件下振荡培养 2–4 小时。</li>
	<li>在室温（22 °C）下，使用台式微量离心机（参见材料表）以 6,800 ×g 离心 3 分钟收集细胞，随后取 50–100 µL 菌液涂布于含有适当筛选剂的 LB 琼脂平板（本实验方案所用质粒的筛选剂为 50 mg/L 卡那霉素）。</li>
	<li>细胞在 28 °C 培养 2 天后，通过菌落 PCR 鉴定含有目的基因的阳性菌落。本实验方案中，请使用步骤 2.4 中提及的引物及反应条件。</li>
	<li>随后，挑取阳性菌落划线接种至含 LB 琼脂培养基及筛选剂的保藏平板。该平板可在 4 °C 保存长达 1 个月。</li>
	<li>或者，为实现长期保存，可挑取阳性菌落接种于含适当筛选剂的小体积 LB 液体培养基中，于 28 °C、200 rpm 振荡过夜培养，随后制备甘油菌种（按 50% w/v 甘油与菌液按 1:1 体积比混合），于 -80 °C 可保存长达 10 年。</li>
</ol>
4. A. tumefaciens 的制备
<ol>
	<li>将含有目标质粒的农杆菌（A. tumefaciens）划线接种至已准备好的95 mm × 100 mm固体LB平板上，平板中需添加适当的选择剂。本实验中使用菌株GV3101，其携带质粒插入片段AtPP2:GUS，并添加50 mg/L卡那霉素用于筛选。</li>
	<li>用封口膜密封平板，于28 °C培养最多48小时，或直至细菌生长至可挑取的大小。</li>
	<li>在转化前两天，用移液器枪头挑取一个细菌菌落，接种至含有6 mL液体LB培养基（添加适当选择剂）的15 mL圆底离心管中。在28 °C台式摇床中以200 rpm振荡培养过夜，直至OD600达到0.6–0.7。 
	注意：平板及6 mL菌液接种物可在4 °C保存最多1个月。</li>
	<li>当细菌OD600达到合适值时，用移液器将农杆菌（A. tumefaciens）转移至含有100 mL液体LB培养基（添加选择剂）的无菌三角瓶中。通常每100 mL LB培养基加入200 µL菌液即可用于扩增培养。在28 °C、200 rpm条件下振荡培养过夜，直至OD600达到0.6–0.7。</li>
	<li>将菌液转移至50 mL无菌离心管中，在台式离心机中于室温（22 °C）以2,200 xg离心10分钟，收集菌体。</li>
	<li>用移液器弃去上清液。用移液器将菌体沉淀重悬于5 mL室温（22 °C）的液体悬浮液（SS）（表1）中，然后加入SS至总体积达50 mL，反复倒置数次混匀。此时细菌已准备好用于转化。 
	注意：液体悬浮液（SS）必须新鲜配制，且在转化前一周内使用。 
	&#8203;警告：所有接触过农杆菌（A. tumefaciens）的材料均须丢弃至生物危害废物桶中。残留的细菌培养液可用浓度为20%或更高的次氯酸钠（漂白剂）进行灭菌处理。</li>
</ol>
5. 转化 车前属 根
<ol>
	<li>当植物达到理想的转化阶段（幼苗生长至3周龄）时（图1C），使用无菌镊子和剪刀将根部与植株其余部分分离（图3A）。丢弃叶片和茎组织。</li>
	<li>切割后立即使用无菌镊子将根段转移至含有无菌水的无菌盒子中。此步骤可使根部在收集全部组织期间保持湿润。</li>
	<li>当所有根部切割完成后，将 A. tumefaciens/SS 悬液倒入无菌的一次性 150 mm × 15 mm 培养皿中。将根段转移至 A. tumefaciens 菌液中，浸染至少 20 分钟（图3B）。</li>
	<li>在共培养期间，使用带有锋利刀片的无菌解剖刀将根切成 1 cm 长的片段，并将主根与侧根分开。在根表面做浅而细的切口，以利于细菌侵染植物组织。 
	注意：若处理大量植株，应分批将根段转移至菌液中，以确保所有根段在侵染过程中均被完全浸没。</li>
	<li>共培养结束后，用无菌镊子将根段转移至无菌纸巾上，以去除多余的细菌。避免干燥超过 60 秒，否则可能导致根组织脱水受损。理想情况下，可同时干燥 10–15 根根段（图3C）。</li>
	<li>将干燥后的根段转移至预先准备好的含固体共培养基（表1）的 95 mm × 15 mm 培养皿中，每皿约放置 10–20 根，具体数量根据根的大小而定（图3D）。</li>
	<li>用两层透明塑料膜密封培养皿，再用铝箔包裹。于室温（22 °C）下避光共培养 3 天。此步骤为细菌侵染根组织提供时间，且不施加抗生素筛选压力（图3E）。</li>
</ol>
6. 筛选与完整植株再生
<ol>
	<li>在共培养基中孵育后，将根段转移至已准备好的95 mm × 15 mm含固体茎诱导培养基（SIM）（表1）的培养皿中，培养基中加入Timentin（500 mg/L；参见材料表）及适当的抗生素进行筛选。本实验方案中使用卡那霉素（100 mg/L）。 
	注意：根段底部必须与培养基完全接触。若根段未接触培养基表面，则说明过长，需剪短以防止组织逃逸筛选。</li>
	<li>用两层透明塑料膜密封培养皿，然后在生长灯下培养1个月（适宜条件见步骤1.6），或直至芽开始萌出。 
	注意：通常在培养2周后可观察到芽的初始形成，1个月后芽通常已清晰可见。</li>
	<li>当幼苗长至1.5–2.0 cm长时（图1D），将其转移至已准备好的无菌盒中，盒内含固体根诱导培养基（表1）。</li>
	<li>在生长灯下继续培养数周（培养条件见步骤1.6），直至根形成。通常在1周后即可首次观察到根的出现。 
	&#8203;注意：建议在移栽至土壤前让根系生长数周，因为根系较大的植株在土壤中的存活率更高。</li>
</ol>
7. 土壤转移
<ol>
	<li>当根系生长到足够大可以移栽时（通常在生长约1个月后，见图1E），将植株移栽至装有预先润湿的通用型土壤（BM7）的3.5英寸方形盆中。本实验方案使用BM7树皮混合基质（见材料表）。
	<ol>
		<li>用清水轻轻冲洗根部，去除附着的培养基。 
		注意：植株可在温室中继续培养至成熟，光照强度为800至1400 µmol photons m-2 s-2，使用600 W高压钠灯（见材料表）；也可在生长箱中于室温（22 °C）条件下，使用冷白光以50 µmol m-2s-1光照强度、12小时光照周期进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用塑料育苗盖覆盖植株，再套上透明塑料袋。此步骤可使植株在适应土壤环境期间保持高湿度。</li>
	<li>约3–5天后，先移去塑料袋，再逐渐揭开盖子，使植株逐步适应外部环境。 
	注意：根据季节及植株移栽后的环境条件不同，植株适应所需时间可能有所变化。建议每天观察植株生长状况，并根据需要向盆中添加水分。</li>
	<li>定期浇水，并根据需要施加肥料。植株也可移栽至更大的花盆中以继续生长（见图1F）。</li>
</ol>
8. β-葡萄糖醛酸酶（GUS）组织化学染色
<ol>
	<li>根据已发表的实验方案配制β-葡萄糖醛酸酶（GUS）染色液15.</li>
	<li>当茎尖初生组织长约0.5–1 cm时，取一片幼嫩且完全展开的叶片，切下其微小的叶尖部分（&#60;长度约5 mm即可，立即转移至1.5 mL或2 mL离心管中的0.5–1 mL GUS染色液中。溶液应完全覆盖植物组织。</li>
	<li>将打开的试管放入真空干燥器中，在20–25 kPa下抽真空5–10分钟。抽真空过程中，溶液中应可见少量气泡。此步骤可使溶液渗入植物细胞内。</li>
	<li>让空气重新进入真空干燥器。关闭试管，于37 °C孵育过夜（12 h），或直至出现蓝色。 
	注意：本研究中，GUS 活性定位于韧皮部，因此在成功转化的植株中，蓝色染色应仅在韧皮部组织中可见。不含转基因的植株不会出现染色现象。图4).</li>
	<li>为更清晰地观察染色结果，将植株转移至100%乙醇中以去除叶绿素。为提高叶绿素去除效率，于60 °C孵育试管10分钟。 
	注意：根据待染色叶片的大小，可能需要更换多次乙醇才能完全去除叶绿素。</li>
</ol>

<ol><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. Brachypodium distachyon. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBragg%2C+JN+%22Agrobacterium+Protocols%22">Agrobacterium Protocols</a>. , Springer. New York, NY. 17-33 (2015).</li>
<li>Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+guide+to+plant+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Field guide to plant model systems.</a> Cell. 167 (2), 325-339 (2016).</li>
<li>Müller, B., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+organisms-a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Model organisms-a historical perspective.</a> Journal of Proteomics. 73 (11), 2054-2063 (2010).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fruit-specific+promoters+drive+AtMYB12+expression+to+improve+phenylpropanoid+accumulation+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato.</a> Molecules. 27 (1), 317(2022).</li>
<li>Niedbała, G., Niazian, M., Sabbatini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+agrobacterium-mediated+gene+transformation+of+tobacco+%28Nicotiana+tabacum%29-a+model+plant+for+gene+transformation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 695110(2021).</li>
<li>Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumari%2C+D+%22Genome+Editing+Platforms+in+Rice+%28Oryza+sativa+L.%29%3A+Basic+methodology+and+troubleshooting%22">Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting</a>. , (2022).</li>
<li>Zhang, B. Agrobacterium-mediated transformation of cotton. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+B+%22Transgenic+Cotton%22">Transgenic Cotton</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 31-45 (2013).</li>
<li>Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+and+reliable+plant+regeneration+and+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+in+soybean+%28Glycine+max+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crop+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L).</a> Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).</li>
<li>Bakhsh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+efficient%2C+reproducible+and+stable+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+of+five+potato+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars.</a> Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).</li>
<li>Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+oilseed+rape+%28Brassica+napus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus).</a> Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).</li>
<li>Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 876671(2022).</li>
<li>Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+phenotypic+and+genotypic+variations+of+Plantago+ciliata+in+Ha%27il+region%2C+Saudi+Arabia%5BTitle%5D)+AND+%22Entomology+and+Applied+Science+Letters%22%5BJournal%5D)">Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia.</a> Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).</li>
<li>Coleman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plantago+Lanceolata%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Plantago Lanceolata.</a> Botanical Bulletin. 1 (11), 45(1876).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+transcriptomic+profiling+of+Plantago+major+provides+insights+for+the+involvement+of+vasculature+in+phosphate+deficiency+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses.</a> Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).</li>
<li>Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plantago+spp.+as+models+for+studying+the+ecology+and+evolution+of+species+interactions+across+environmental+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients.</a> The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).</li>
<li>Pommerrenig, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+plantain.+A+collection+of+expressed+sequence+tags+from+vascular+tissue+and+a+simple+and+efficient+transformation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method.</a> Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).</li>
<li>Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arms+races+with+mitochondrial+genome+soft+sweeps+in+a+gynodioecious+plant%2C+Plantago+lanceolata%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata.</a> Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).</li>
<li>Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+male+sterility+contributes+to+hybrid+incompatibility+between+subspecies+of+Arabidopsis+lyrata%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).</li>
<li>Bloch, K. D., Grossmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+of+DNA+with+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Digestion of DNA with restriction endonucleases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).</li>
<li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+expression%2C+purification%2C+physicochemical+properties+and+antifungal+activity+analysis+of+phloem+protein+PP2-A1+from+cucumber%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).</li>
<li>Deshmukh, S. 22, Kulkarni, R., Bose, K. Transformation and protein expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeshmukh%2C+S22+%22Textbook+on+Cloning%2C+Expression+and+Purification+of+Recombinant+Proteins%22">Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins</a>. , Springer. Singapore. 83-114 (2022).</li>
<li>Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergkessel%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 529, Academic Press. 299-309 (2013).</li>
<li>Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATP-binding+cassette+%28ABC%29+transporter+gene+family+of+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum.</a> BMC Genomics. 14, 6(2013).</li>
<li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+fluorescent+proteins+into+Nosema+bombycis+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation.</a> Parasites & Vectors. 15 (1), 141(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).</li>
<li>Manimaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+early+and+young+callus+tissues+of+indica+rice+BPT+5204+enhances+regeneration+and+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Rice+Science%22%5BJournal%5D)">Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency.</a> Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).</li>
<li>Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Artemisia+annua+L.+using+young+inflorescence%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology-Plant%22%5BJournal%5D)">Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).</li>
<li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+planta+hairy+root+transformation%3A+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044(2022).</li>
<li>Geng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+root+transformation+system+for+CRISPR%2FCas9-based+analyses+of+shoot-root+communication+in+cucurbit+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops.</a> Horticulture Research. 9, (2022).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation+using+cotyledons%2C+hypocotyls+and+roots+of+%27Duli%27%28Pyrus+betulifolia+Bunge%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge).</a> Scientia Horticulturae. 296, 110906(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前缺乏针对车前属（Plantago）植物的遗传转化方案，这限制了这些植物作为模式生物的应用，尤其是在研究人员希望探究基因功能的情况下。P. lanceolata 被选为建立遗传转化方案的对象，因为它是该属中研究最为广泛的植物16。所开发的这一转化方案有望成为推动维管生物学、生态学、植物-昆虫互作以及非生物胁迫生理学等相关研究进一步发展的工具。
本方案明确阐述了获得转基因植物的操作步骤。除P. lanceolata能够在组织培养环境中良好生长外，多个因素共同促成了我们转化方法的成功。首先，观察到使用高质量且无菌的植物根组织进行转化至关重要。取自3至4周龄植株、呈绿色或浅白色的根具有最高的转化效率。从存在任何程度细菌或真菌污染的培养盒中获取的根通常会导致再生芽的培养物被污染，而呈褐色的老化根则无法实现成功转化。在本方法中，根组织是转化效率最高的组织类型，因为叶片和叶柄组织均未能成功诱导出芽。
另一个重要观察结果是，收集用于转化的根组织的最佳方法是将 freshly cut 的根材料置于无菌水中。此步骤能有效保持根组织的水分，同时继续收集其余组织，因为根在从生长容器中取出后容易迅速失水。此步骤还有助于提高转化成功率，因为它允许更多根同时在细菌中孵育。
可通过将根组织在共培养培养基中孵育的时间缩短至2天来修改本实验方案。观察发现，2至3天的孵育时间足以实现感染并诱导芽的初始形成。然而，不建议延长孵育时间，因为培养基中缺乏抗生素抑制剂时常会导致农杆菌（A. tumefaciens）过度生长，进而杀死新生的组织。
本研究的一个局限性是缺乏关于其他方法或其他物种性能的可用数据 A. tumefaciens 在 P. lanceolata 用于比较的转化。据我们所知，本实验方案具有新颖性。在初步试验中，观察到较高的转化效率 A. tumefaciens GV3101&#160;我们专注于利用该菌株优化技术，而非尝试其他菌株。我们的转化效率达到20%，在植物转化中相对较高——许多常规方法将任何高于此值的情况视为 &#62;1% 才能成功26,27,28。然而，使用另一种菌株的 农杆菌（A. tumefaciens）， 例如 A. rhizogenes， 因其在多种物种的根部转化中被广泛应用而闻名29,30,31，可能会进一步提高成功率。需要进一步实验来评估使用其他菌株以提高转化效率的影响。 P. lanceolata 
P. lanceolata 的成功转化可能使许多研究领域受益。P. lanceolata 具有较高的转化效率，并且在组织培养基中生长迅速，因此成为基因功能研究的可行候选物种15。

利用模式物种研究植物生物学多个方面的概念，随着模式物种的广泛使用而兴起 拟南芥1. 拟南芥 最初选择它是因为它与许多其他开花植物具有共同特征，并且具备多种适合在实验室环境中研究的特性，例如植株矮小、世代周期短。以它为研究对象发表的大量科研论文，以及其较小的基因组尺寸和易于进行遗传转化的特点2，使其能够持续作为一种广泛使用的实验生物。然而 拟南芥 对于具有不同特征或独特性状的物种而言，其作为模型的适用性可能受限3。这促使了新模型系统的发展，例如玉米（Zea mays), 单子叶植物发育遗传学研究中的重要模式植物4，以及番茄（Solanum lycopersicum，是进化研究、果实发育和生产的重要模式植物，也是蔬菜作物的代表性物种5一种遗传转化方法是植物物种成为模式生物的前提条件2。一个 Agrobacterium tumefaciens介导的转化是植物生物学中一种可靠的技术；已被用于转化一些模式物种和主要农作物，包括烟草（Nicotiana tabacum)6，水稻（Oryza sativa)7，棉花（陆地棉)8，大豆（Glycine max)9，马铃薯（Solanum tuberosum)10，以及油菜（Brassica napus)11. 植物&#160;物种在响应方面的成功程度存在高度变异性 A. tumefaciens 感染与转化方案通常需要针对每个物种 individually tailored6,12.
属 车前属 包含共计256种植物物种，广泛分布于全球13该属物种常具有独特的特征，使其成为研究遗传学、生态学、应激生理学、次生代谢产物、药物化学、植物-微生物互作、植物发育及进化等领域的理想模式物种。 Plantago lanceolata 又称窄叶车前或肋状车前，自19世纪以来一直备受关注th 世纪，当时首次用于描述雄性不育现象14与其他同属植物一样，它已被用于多个研究领域的研究。最近，由于其维管组织易于采集，该植物被提议作为维管生物学研究的模式材料。15. P. lanceolata 是该属中最常被研究的物种 车前属；2021年的一篇文章报道指出，存在 &#62;当时包含或涉及该物种的出版物有1,400篇16，根据2022年12月9日进行的PubMed检索，自2022年初以来已额外发表了102篇文章th 2022年。该属中研究程度仅次于它的植物， P. major 在相同日期使用相同标准搜索时，该主题仅有414篇文章。
尽管人们对P. lanceolata具有研究兴趣，但针对该物种的研究，尤其是基因功能表征方面的研究，常常受限于缺乏可用的遗传操作工具包。&#160;Pommerrienig 等人曾尝试利用花序浸蘸法（floral dip technique）建立P. major 的转化体系17。然而，由于P. lanceolata 具有雄性不育的特性18,19，该方法无法应用于该物种。&#160;据我们所知，目前尚无针对P. lanceolata的转化方案。
本研究介绍了一种简单的实验方案 根癌农杆菌-介导的转化 P. lanceolata通过靶向根组织，可在转化后3个月内获得完全生长的转基因植株。

<table><tbody><tr><td>14 mL 圆底管A4A2:A34</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>150268</td><td></td></tr><tr><td>1-萘乙酸</td><td>Gold Biotechnology</td><td>N-780</td><td></td></tr><tr><td>3M 微孔手术纸胶带</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>19-027761</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Research Products International Corp.</td><td>163227LC</td><td></td></tr><tr><td>600 瓦高压钠灯</td><td>Plantmax</td><td>PX-LU600</td><td></td></tr><tr><td>6-苄氨基嘌呤（6-BAP）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>B-110</td><td></td></tr><tr><td>铝箔&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>双元质粒 pBI101</td><td>Clontech，美国&amp;nbsp;</td><td>632522</td><td></td></tr><tr><td>Cool White Grow Light Sylvania LLC</td><td>家得宝</td><td>315952205</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DH5a 大肠杆菌&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen，美国&amp;nbsp;</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌培养皿，150 × 16 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌培养皿，95 × 15 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>Leica Biosystems</td><td>38DI12044</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 200 证明</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>叶酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2519-5</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Leica Biosystems</td><td>38DI18031</td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International Corp.</td><td>G35020-1000</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>241261</td><td></td></tr><tr><td>孵育型台式轨道摇床</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SHKE420HP</td><td></td></tr><tr><td>吲哚-3-乙酸（IAA）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I-110</td><td></td></tr><tr><td>吲哚-3-丁酸（IBA）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I-180</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素单硫酸盐</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120</td><td></td></tr><tr><td>大容量离心机&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>品红盒子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50255176</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头 1000 &amp;micro;L</td><td>康宁</td><td>4140</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头 200 &amp;micro;L</td><td>康宁</td><td>4138</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头 10 &amp;micro;L</td><td>康宁</td><td>4135</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 0.5-10 &amp;micro;L</td><td>康宁</td><td>4071</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 100-1000 &amp;micro;L</td><td>康宁</td><td>4075</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 20-200 &amp;micro;L</td><td>康宁</td><td>4074</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 2-20 &amp;micro;L</td><td>康宁</td><td>4072</td><td></td></tr><tr><td>穆拉希格 &amp;amp; Skooge 基本培养基（含维生素）</td><td>PhytoTech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>穆拉希吉 &amp;& Skooge 基础盐混合物</td><td>PhytoTech</td><td>M524</td><td></td></tr><tr><td>myo-肌醇</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I-25</td><td></td></tr><tr><td>烟酸</td><td>Sigma</td><td>N0761-100g</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm（石蜡膜）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Research Products International Corp.</td><td>P44000</td><td></td></tr><tr><td>盐酸吡哆醇</td><td>Sigma</td><td>P6280-10g</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片刀柄</td><td>Leica Biosystems</td><td>38DI36419</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802181</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，晶体（NaCl）</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S24000</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>沃尔玛</td><td>23263068401</td><td></td></tr><tr><td>土壤-树皮混合物</td><td>伯杰，美国</td><td>BM7</td><td></td></tr><tr><td>方形花盆（3.5 英寸见方）</td><td>Greenhouse Megastore</td><td>CN-TRK-1835</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S24060</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>盐酸硫胺素</td><td>Sigma</td><td>T4625-5G</td><td></td></tr><tr><td>替门汀 噻卡西林/克拉维酸（15/1）（Timentin）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>T-104</td><td></td></tr><tr><td>反式玉米素核苷（ZR）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>Z-100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>野生型 &lt;em&gt;Plantago lanceolata &lt;/em&gt;种子</td><td>美国俄勒冈州 Outsidepride 种子来源</td><td>F1296</td><td>Outsidepride.com</td></tr><tr><td>酵母提取物颗粒</td><td>Research Products International Corp.</td><td>Y20025-1000&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium tumefaciens介导的窄叶车前草遗传转化

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

属中的物种 车前属 具有一些独特的性状，使其被广泛用作多个研究领域的模式植物。然而，由于缺乏遗传操作体系，难以深入研究基因功能，限制了该属植物作为模式系统的多功能性。本文介绍了一种转化方案 Plantago lanceolata 最常被研究的 车前属 物种. 使用 Agrobacterium tumefaciens介导的转化，无菌培养的3周龄根 P. lanceolata 植株经细菌感染后，在2-3天内孵育，随后转移至含适当抗生素筛选的芽诱导培养基。通常在1个月后可观察到芽从培养基中长出，芽转移至根诱导培养基后1-4周内开始生根。之后将植株驯化至土壤环境中，并通过β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因检测验证外源基因的存在。当前方法的转化效率约为20%，每10个转化的根组织可获得2株转基因植株。建立窄叶车前的遗传转化体系将有助于推动该植物作为新型模式物种在多个研究领域的应用。

一种获得转基因生物的简单方案 P. lanceolata 使用植物 根癌农杆菌-介导的转化。报告基因 GUS （编码 β-葡萄糖醛酸酶）被转化，由韧皮部表达的启动子驱动 AtPP2，转入3周龄 P. lanceolata 根部穿过 A. tumefaciens 菌株 GV3101 (图2）。选择韧皮部特异性启动子是因为我们的主要研究兴趣是建立一个用于植物维管组织，特别是韧皮组织功能基因组学的研究系统。在预实验中，该方法在根、叶和叶柄组织上进行了测试。尽管所有类型的组织均能诱导出愈伤组织，但只有根组织能够产生不定芽原基图5A) 在SIM中培养1个月后；叶片和叶柄变褐并死亡（图5B）。由此得出结论，根组织是该转化方法中最佳的组织类型。将根置于用悬浮液（SS）重悬的制备好的细菌中进行孵育（表1）至少 20 分钟，然后在黑暗条件下于室温的固体 SS 平板上孵育长达 3 天（图 3E然后将根转移到芽诱导培养基（SIM）中，并按照方案中所述条件（步骤1.6）置于生长灯下培养。 图1 和 图3 展示每个实验步骤的代表性图像以供参考。
图6展示了从转化组织中萌发的茎尖初始结构的发育过程，从根部首次被放置在SIM培养基上的第一天（图6A），到茎段准备进行生根的阶段（图6D）。一周后，根组织形成愈伤组织（图6B），并可观察到茎尖初始结构的出现（图6B1）。在第2周和第3周期间，茎段持续萌出（图6C），经过4周培养后，茎段已准备好转移到生根诱导培养基中（图6D）。
使用β-葡萄糖醛酸酶（GUS）组织化学染色法对潜在的转基因植株进行鉴定，取茎长约为0.5 cm时的叶片片段进行检测。阳性转基因植株在韧皮部定位于组织中显示出预期的染色模式，如图4所示。将GUS染色呈阳性的芽转移到生根诱导培养基中，4周后形成健壮的根系（图1E）。生根后的植株随后被移栽至土壤中。图4展示了窄叶车前草转化AtPP2启动子和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因后的染色结果，并与野生型以及仅转化AtPP2启动子的窄叶车前草进行了比较。所有萌发的芽均被确认为转基因植株。转化效率平均为20%，每转化10个根约产生2个芽。确认的转基因植株被移至较大的花盆中，培养4–8周直至达到成株阶段（图1F）。
<img alt="植物转化时间线；种子灭菌至表型检测；示意图；科学流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：Plantago lanceolata 转化的时间线。 本方案各阶段的代表性图像。（A）未萌发的种子接种在MS培养基平板上。（B）种子在1周后萌发，准备转移至Magenta盒中。（C）植物在MS培养盒中生长3周后的状态。根呈绿色且健康，处于转化的理想阶段。（D）在芽诱导培养基中培养4周后，芽已准备好转移至生根培养基中。在此阶段，如适用，可进行β-葡萄糖醛酸酶（GUS）组织化学染色。（E）植物在根诱导培养基中培养4周后已形成根系。（F）转基因植株在土壤中生长4周后达到完整植株大小。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="pBI101 质粒图谱：特征包括 GUS 基因、ori、KanR、EcoRI 位点；基因克隆。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：含有插入的韧皮部特异性启动子 AtPP2 的双元载体质粒 pBI101 与 β-葡萄糖醛酸酶（GUS）示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="植物根系处理：切割、细菌共培养、干燥、CIM转移、铝箔包裹示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：转化步骤。 转化各步骤的代表性图像。(A) 转化过程中将根与茎分离。(B) 将根浸泡于细菌/SS悬浮液中。(C) 用纸巾干燥根部以去除多余细菌。(D) 将根接种于共培养培养基上。(E) 用铝箔包裹SS培养板。植物在转移至生芽培养基前需共培养2-3天。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="叶脉结构分析，显微镜图像显示三个用于维管组织研究的染色样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：GUS染色。 车前草叶片片段的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）染色结果。（A）野生型。（B）转化了携带AtPP2启动子（空载体）质粒的车前草。（C）转化了携带AtPP2启动子和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因质粒的车前草。每片叶子均采用GUS组织化学染色方案进行染色，随后使用显微成像系统拍摄图像。（B）和（C）图像中未显示染色模式，原因是缺乏GUS基因。右侧图像显示叶脉中清晰的蓝色染色模式，证实该植株为转基因植株。标尺为1 mm，每片叶段长度约为1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植物生长分析；培养皿实验；根系发育；卡那霉素抗性检测" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5不同组织类型转化效率的比较 &gt;在成苗培养基中培养1个月。 (A) 生长超过一个月后的根组织。根部已出现扩大的愈伤组织，并有芽原基萌出。未转化的愈伤组织因抗生素筛选作用已开始死亡。B) 生长超过1个月后的叶片和叶柄组织。组织出现一定程度的愈伤组织增殖，但很快因抗生素作用而死亡。两种组织均未产生芽体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="植物生长进程，持续4周；培养皿，植物再生实验，显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64777/64777fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：转化组织上愈伤组织和芽的形成。 将组织接种于成芽培养基后不同培养时间的代表性图像。(A) 根组织刚接种到成芽培养基时的状态。(B) 根组织在成芽培养基上培养1周后的状态，可见愈伤组织开始扩展；(B1) 最早的芽原基开始出现。(C) 根组织在成芽培养基上培养3周后的状态，更多芽原基已出现。(C1) 由B1芽原基发育而来的芽。(D) 根组织培养4周后的状态，未转化的组织开始变黑/褐并死亡，而出现的芽持续生长。在此阶段，芽可转移至生根培养基中培养。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：培养基制备配方。 转化培养基的制备方法描述。所添加维生素的量根据标明的母液浓度进行计算。参见 表2 用于维生素储备液的配制。对于所有培养基，将试剂加入900 mL双蒸水中2O，调节pH至指定水平，然后加水至终体积1,000 mL。* = 灭菌后加入。** = 用1 M KOH调节pH。*** = 用1 M NaOH调节pH。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%201_Media%20Preparation%20Recipes.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
表2：维生素储备液 车前属 培养基 所有维生素在储存前必须经过滤除菌并准确标记。如需溶解粉末，先用1 N NaOH溶解，再用双蒸水定容至所需体积。2O. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64777/64777_Table%202_Vitamin%20Stocks%20for%20Plantago%20Mediums.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>

由于窄叶车前草作为一种模式物种在多个研究领域具有广泛的应用，因此需要建立一套适用于窄叶车前草的遗传转化工具包Plantago lanceolata). 此处利用 根癌农杆菌介导的转化，本文介绍了一种可获得稳定转基因品系的方案，转化效率达20%。

Agrobacterium tumefaciens介导的窄叶车前草遗传转化

车前属（Plantago）植物具有多种独特性状，使其被广泛用作多个研究领域的模式植物。然而，目前缺乏……

车前属植物可作为植物维管生物学和胁迫生理学研究的模式植物。建立转化体系可对这些植物进行深入研究，以探索基因与其相关表型之间的关系。该技术的主要优势在于利用食物作为外植体，高效地对窄叶车前进行遗传转化。首先，根据所需植株数量，将市售的野生型车前草（Plantago lanceolata）种子放入50毫升离心管中，至5毫升刻度线处。用75%乙醇浸泡种子60秒。弃去乙醇后，加入新配制的20%次氯酸钠溶液浸泡种子40分钟，并轻轻倒置离心管以混匀。在超净工作台中，弃去次氯酸钠溶液，然后用蒸馏水将种子清洗五次。最后一次漂洗后，在种子中加入少量水，这有助于将种子转移至培养板上。使用无菌镊子将种子均匀分散地转移到预先准备好的含固体MS培养基的培养皿表面，每粒种子之间间隔约1厘米，以防止萌发后的幼苗过于拥挤。用两层石蜡膜密封培养板，以防止污染，并在室温下置于冷白色生长灯中培养。待幼苗萌发并生长至足够大时（通常在萌发后两到三天），使用无菌镊子将幼苗转移至含有50至100毫升MS培养基的无菌盒子中。用外科胶带密封盒子，并将植物置于冷白色生长灯下继续生长约三到四周。将含有目标质粒的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）划线接种至已准备好的含适当选择剂的固体LB平板上。用石蜡密封平板后，在28摄氏度下培养最多48小时，或直至细菌生长至足够大的单菌落用于挑取。培养结束后，在转化前两天，用移液器吸头挑取一个细菌菌落，接种于含有6毫升含适当选择剂的液体LB培养基的15毫升圆底离心管中。在28摄氏度的摇床中以200 RPM转速振荡过夜，直至OD 600达到0.6至0.7。当细菌达到所需OD值后，将200微升菌液转移至含有100毫升含筛选剂LB培养基的无菌烧瓶中。在28摄氏度、200 RPM条件下振荡过夜。然后将细菌培养物转移至50毫升无菌离心管中，在室温下以2,200×g离心10分钟，收集细菌。弃去上清液，用5毫升室温新鲜配制的悬浮液（SS）通过移液将菌体沉淀重悬。随后加入更多SS至50毫升刻度线，反复倒置数次以混匀。当植物生长至约三周左右的理想转化阶段时，使用无菌镊子和剪刀将根部从植株上分离，并弃去叶片和茎组织。切割后应立即用镊子将根段无菌转移至含有无菌水的盒子中，以保持其湿润状态。接下来，将悬浮于SS培养基中的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌液倒入无菌的一次性150 × 15 毫米培养皿中。将切好的根转移至细菌培养物中，孵育至少20分钟。孵育期间，使用带有锋利刀片的无菌解剖刀将根切成1厘米长的片段，分离主根与侧根。然后在根表面制作浅而细的切口，以利于细菌侵染植物。孵育后，将根段转移至无菌纸巾上，以去除多余的细菌。然后将干燥的根段转移至已准备好的培养皿中，每个培养皿中放置约10至20根根段，具体数量根据根段大小而定，培养皿中含固体共培养基。用两层透明塑料膜密封培养皿，再用铝箔包裹，于室温下孵育三天。培养三天后，在共培养培养基中，将根段转移至已准备好的含有固体茎诱导培养基（SIM）的培养皿中，培养基需添加500毫克/升的特美汀和适当的抗生素进行筛选。将用透明塑料膜密封的培养皿置于生长灯下培养一个月，或直至芽开始萌出。当植株长至1.5至2.0厘米长时，将其转移至已准备好的无菌盒中，使用固体生根诱导培养基。将植物置于生长灯下培养数周，直至形成根系。通常一周后，当根系发育到足够大时，可在生长约一个月后将植物取出，用清水轻轻冲洗根部，以去除附着在根部的任何培养基。然后将植物移栽至含有预湿润通用型土壤 BM7 的 3.5 英寸方形盆中，用塑料育苗罩覆盖植物，再套上透明塑料袋，以确保植物处于湿润环境中。该方法在根、叶片和幼嫩的老组织上进行了测试。在初步实验中，尽管所有类型的组织均能诱导出愈伤组织，但只有根组织在SIM培养基中培养一个月后产生了芽原基，而叶片和花托则变褐并死亡。从第一天起就开始观察转化组织中芽原基出现的发育过程。当芽体准备生根时，将其放置于SIM培养基上。一周后，根组织形成愈伤组织，并可观察到芽原基的初始形成。在第二周和第三周，芽体继续萌发，四周后，芽体即可转移至生根诱导培养基中。通过组织化学法β-葡萄糖醛酸酶（GUS）染色检测来鉴定转基因植株，取茎长约0.5厘米时的叶片片段进行实验。用空载体转化的野生型植株无染色现象。由于不含GUS基因，而含有β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因的转化植株在叶脉中显示出清晰的蓝色染色，证实其为转基因植株。在操作过程中应始终保持根部湿润，防止干燥；为避免脱水，每次转移根部时数量应控制在约10株左右。

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