从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

该简便且可重复的方案已成功用于从健康和疾病小鼠模型肝脏，以及人和非人灵长类动物肝脏中分离高质量细胞核。该方法仅需少量冷冻组织材料。此外，密度梯度离心可获得非常纯净的细胞核悬液，且最终的细胞核制备物中保留了肝脏中所有主要的细胞类型。

该细胞核提取方法可用于保存在生物样本库中的生物存档人肝组织样本。开始组织匀浆时，使用预冷的解剖刀从置于干冰上培养皿中的肝组织切下一小块20-30毫克或5 mm³的组织。立即将培养皿转移至冰上，并加入1毫升匀浆缓冲液。

使用冷手术刀将组织尽可能切碎，并用1毫升宽口吸头进行吸取。收集组织悬液并转移至预冷的2毫升玻璃Dounce匀浆器中。用额外的0.5至1毫升匀浆缓冲液冲洗培养皿，同时将所有残留的组织碎片收集起来，整个过程保持在冰上操作。

在冰上缓慢而小心地使用松式研杵 A 进行五次研磨，避免产生气泡。每次研磨时，确保研杵从匀浆器顶部到底部小心移动。随后，在冰上使用紧式研杵 B 缓慢进行 10 至 15 次研磨，避免产生气泡。

操作完成后，将匀浆液通过50微米细胞滤筛过滤，并转移至预冷的1.5毫升离心管中。对于含有较多结缔组织团块的匀浆液，可使用多个滤筛或离心管。在进行密度梯度离心前，用额外的0.5至1毫升匀浆缓冲液冲洗匀浆器和滤筛，以充分收集全部组织匀浆液。

进行密度梯度离心时，将过滤后的匀浆在预冷的固定角转子离心机中，于 4°C 条件下以 1000 ×g 离心 8 分钟。在样品离心的同时，准备一个含有 250 µL 50% 碘克沙醇稀释液的 1.5 mL 离心管和一个含有 500 µL 29% 碘克沙醇稀释液的 2 mL 离心管。将两支离心管置于冰上。

然后使用真空泵从离心悬浮液中吸走上清液，注意不要扰动沉淀。使用1毫升宽口移液器吸头将沉淀重悬于250 µL匀浆缓冲液中。随后，将250 µL细胞核悬浮液转移至预冷的1.5 mL离心管中，该离心管内含有250 µL 50%碘克沙醇，轻轻且充分混匀，以制备25%碘克沙醇细胞核悬浮液。

接下来，将500 µL的25%碘克沙醇细胞核悬液转移至预冷的1 mL离心管中，该离心管内含有500 µL的29%碘克沙醇稀释液。将离心管置于预冷的水平转子离心机中，在12,500 ×g条件下离心20分钟，并将刹车设置为关闭状态。在离心步骤即将完成前，向细胞核储存缓冲液（NSB）中加入RNA抑制剂，随后继续进行单细胞核RNA测序流程。

离心完成后，使用真空泵吸除上清液，注意不要扰动沉淀。用1毫升宽口移液器吸头将沉淀在100至300微升NSB中轻轻重悬，然后将核悬液转移至预冷的洁净1.5毫升离心管中。使用台盼蓝溶液和手动血细胞计数板对细胞核进行计数，并立即用于单核基因组学检测。

进行基于流式细胞术的细胞分选时，将细胞核悬液通过50微米滤网过滤至预冷的5毫升荧光激活细胞分选（FACS）管中。使用配备100微米喷嘴的流式细胞分选仪，将FACS管装载到分选仪上，然后预览样品。设置细胞核分选的设门策略：首先绘制前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）的散点图进行散射设门，接着绘制Hoechst高度（Hoechst-H）对Hoechst面积（Hoechst-A）的散点图，最后绘制Hoechst宽度（Hoechst-W）对Hoechst面积（Hoechst-A）的散点图。

在 Hoechst 面积直方图上可视化细胞核倍性分布。若分选至 96 孔或 384 孔板中，需设置液滴延迟时间，并采用比色法优化板孔位置对齐。将样品冷却温度和板架温度设为 4 摄氏度，同时开启样品旋转，转速为 300 RPM。

以每毫升约 1 × 10⁵ 个细胞核的样品浓度，按照每秒 200 至 500 个事件的流速分选单个细胞核。对从冷冻肝脏中提取的细胞核进行显微镜检查显示，密度梯度离心步骤显著促进了去除不需要的细胞和组织碎片。该方法保留了所有倍性水平，并通过流式细胞分析进行了验证和定量。

通过细胞核提取获得的数据观察到了高质量的指标。统一流形近似与投影展示了所有细胞核中的计数数量以及主要的细胞类型，这些细胞类型仅通过核转录组和相对较浅的测序即可可靠地鉴定。该方法使得研究人员能够探究与外源物质代谢相关的肝脏特异性转录因子及其下游靶基因。

诸如中心区的 Cyp2e1 和门脉周围区的 Cyp2f2 等标志基因的互补表达模式表明，所提取的细胞核保留了关于肝脏分区的关键信息。RNA 基因表达文库的测序深度达到每个细胞核 44,600 条读段，ATAC 文库的测序深度达到每个细胞核 43,500 条读段。利用 Seurat 和 Signac 软件包对 RNA 和 ATAC 两种模态的多组测量数据进行加权最近邻分析，能够识别并注释主要和次要的肝细胞类型，且不受细胞大小或细胞核脆弱性的显著偏差影响。

该方法还检测了肝脏分区的上游转录调控因子和标志基因。在使用Dounce匀浆器上下移动研杵进行匀浆时，应避免产生过多气泡，并严格遵循方案中规定的研磨次数。