使用基本显微镜和智能手机可视化大麦（大麦）稻瘟病（稻瘟病）的早期感染部位
March 17th, 2023
这是使用最少的试剂和常用实验室设备（包括基本的智能手机）进行大麦叶鞘测定的简单方案。目的是在没有先进显微镜设备的实验室中可视化原始疾病的早期感染过程。
我们的协议是一种简化的方法，允许研究人员可视化野生型和遗传真菌突变体的早期感染步骤，而无需使用昂贵的设备。该技术的主要优点是使用基本的实验室用品来回答复杂的生物学问题，并用于快速筛选真菌突变体以进行进一步分析。这种技术的困难部分是鞘的处理。
鞘是一层薄薄的细胞，很容易被损坏，因此小心处理对于成功的实验至关重要。首先，选择生长到第二个叶期的大麦。并使用无菌剪刀，将大麦植株剪在土壤线上方。
使用镊子和手术刀，小心地切开纵向打开的第一片叶子的鞘。然后用镊子将其从第二片叶子的基部取出。使用手术刀，将第一片叶子的大部分从鞘中切开，只留下 0.5 英寸的叶组织用于安装。
将第一片叶子平放在含有湿纸巾的无菌60毫米培养皿中，以保持板内的湿度。将叶组织粘在培养皿的底部。选择一个9至12天的Magnaporthe oryzae培养板，并向其中加入0.5至2毫升无菌水。
使用无菌接种环，轻轻刮擦菌丝体以释放附着的分生孢子。小心地将分生孢子悬浮液移入装有一小块奶酪布的微量离心管中，以过滤掉分生孢子悬浮液中的任何大块菌丝体。如有必要，用无菌水将孢子浓度稀释至每毫升10至第四个孢子的五倍，因为浓度过高会使单个感染部位成像具有挑战性。
根据鞘的大小，小心地将25至50微升的分生孢子悬浮液移入卷起的叶鞘内。接下来，用双蒸水填充四五个 500 毫升烧杯并加热直至蒸熟。将培养皿的盖子放在其中一个蒸气腾腾的烧杯上，以将水分困在板内。
堆叠受感染的叶鞘板，并用剩余的热烧杯包围它们，因为它为孢子发芽创造了一个潮湿的环境。用纯色橡胶或塑料盒覆盖此设置，使其不受干扰48小时或所需的成像时间点，从而保护该装置免受光照。通过混合新鲜稀释的45%乙酸和0.1%台盼蓝来制备染色剂。
将一毫升染料溶液等分到微量离心管中。使用手术刀，小心地将叶鞘从胶带上切开。使用镊子将鞘放入微量离心管中，并确保其完全浸没在染料溶液中。
让试管在 40 摄氏度的加热块或水浴中静置两个小时，以使染料穿透叶子。接下来，用60%新鲜甘油小心地冲洗叶鞘三次，以去除多余的染料。将护套保持在甘油中，直到准备好安装在载玻片上。
将护套放在干净的载玻片上，加入几滴60%甘油。使用解剖显微镜和两对镊子，小心地展开鞘，使接种的中心朝上。用镊子打开鞘，将盖玻片放在顶部，以防止鞘卷曲并阻塞感染部位。
使用指甲油密封盖玻片，以便长期存放或胶带短期存放。在复合光学显微镜下观察载玻片。通过将手机适配器安装到显微镜上，使用智能手机拍摄基本图像。
对于Android设备，将相机应用程序设置调整为闪光灯关闭，禁用顶部拍摄，禁用亮度和阴影的自动调整，并将照片分辨率设置为完整。安装手机后，拍摄刻度千分尺的图像，以获取数据所需的物镜。将手机的变焦调整为 2.5 倍并保持一致，以保持一致的像素大小。
鞘的中心容纳了最大浓度的孢子和感染性螘。因此，目标是每个护套的 9 到 12 张图像，以获得用于统计分析的有效数字。用台盼蓝染色后，使用智能手机和智能手机显微镜适配器对鞘的感染部位进行成像。
染色过程中的热量和乙酸会温和地软化叶子组织。染色后用60%甘油冲洗不仅可以去除多余的污渍，还可以减少叶片引起的光散射并提高图像质量。与染色方案的偏差可能导致次优结果，如此处所述。
感染4091野生型的大麦产生成功感染的细胞，通过叶鞘组织内存在感染菌丝来鉴定。在突变型J99A感染的情况下，注意到压迫症和穿透钉的成功发展，但没有产生侵袭性菌丝。时机对于基于感染的检测很重要。
适当老化的植物和真菌孢子对于成功至关重要。在这项研究中，我们研究了感染结构的存在与否。其他实验可以回答有关感染结构表型和入侵菌丝表型的问题。
我们的方法并不新鲜，而是更复杂、更昂贵的实验的简化、可访问版本。
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概述
本协议概述了一种简化的大麦叶鞘分析法，以可视化稻瘟病的早期感染过程。它利用最少的试剂和基本实验室设备，使没有先进显微镜的实验室也能使用。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物病理学
- 真菌遗传学
- 感染生物学
背景
- 该分析法聚焦于真菌感染的早期阶段。
- 它允许研究野生型和遗传性真菌突变体。
- 基本实验室用品足以完成这一技术。
- 仔细处理大麦鞘对成功至关重要。
研究目的
- 可视化大麦植物中的早期感染步骤。
- 促进真菌突变体的快速筛选。
- 为资源有限的实验室提供一种可行的方法。
使用的方法
- 选择二叶期的大麦植物。
- 使用无菌剪刀切割大麦植物。
- 仔细处理叶鞘以避免损坏。
- 在没有先进设备的情况下观察感染过程。
主要结果
- 成功可视化了早期感染阶段。
- 展示了该技术在最少资源下的有效性。
- 对真菌突变体的感染过程有了新的认识。
- 有可能进一步分析真菌遗传学。
结论
- 该协议对研究大麦稻瘟病有效。
- 它为先进显微镜提供了一种成本效益的替代方案。
- 鼓励在实验室环境中探索真菌遗传学。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, accessible visualization of early plant-pathogen interactions is critical for de-risking agricultural trait discovery and supporting translational pipeline decisions in crop protection R&D. This simplified barley leaf sheath assay enables high-throughput screening of fungal mutants and infection phenotypes using only basic laboratory infrastructure. The approach supports predictive confidence in target validation and accelerates the triage of candidate resistance traits for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of infection phenotypes in wild type and mutant fungal strains.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a controlled, reproducible system.
- Facilitates rapid hypothesis testing for genetic determinants of pathogenicity and resistance.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, scalable assay for screening fungal mutants and host responses.
- Delivers quantitative, image-based outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Reduces technical barriers for assay adoption and cross-lab reproducibility by using basic equipment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early infection phenotyping with downstream trait validation in disease-relevant crop systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical assessment of resistance mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate genes or chemistries for crop protection pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This assay bridges early discovery and lead identification by providing a rapid, reproducible platform for infection phenotype analysis in barley. It is positioned for integration into trait discovery, genetic screening, and translational validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of host-pathogen interactions and mechanistic de-risking.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection site measurements for mutant and wild type comparisons.
- Analytics: Enables statistical analysis of infection frequency and structure development using image-based data.
- Translational Research: Facilitates alignment of early phenotypes with preclinical trait validation in relevant crop models.
- Enterprise Reuse: Offers a low-cost, scalable assay adaptable across fungal and plant systems for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes infection phenotyping with minimal resource requirements and high reproducibility.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for trait advancement and improves capital efficiency in crop protection R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate resistance traits and genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires basic plant pathology expertise and careful handling of delicate leaf sheath tissues.
- Needs only standard laboratory tools, compound microscope, and smartphone imaging adapter.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging parameters for reproducibility.
- Adaptable to other monocot hosts and fungal pathogens with protocol optimization.
- Imaging and staining quality are sensitive to protocol deviations and sample age.
