研究肠道炎症对上皮的影响 体外 已建立的小鼠结肠类器官

通过我们的研究，旨在探索如何将小鼠结肠类器官从传统的结肠类器官培养体系进行改造，以研究肠道生理学的某些方面及其在炎症疾病状态下的改变。当使用仅反映干细胞生理特性的传统小鼠结肠类器官培养体系时，对炎症性肠病等疾病状态下屏障功能和肠道生理学的研究受到限制。本方案的优势在于，为读者提供了多种技术手段，可用于研究炎症介质如何通过诱导终末分化或构建二维单层培养系统，来影响肠道上皮细胞。

未来，我们的实验室将致力于研究如何改造人类结肠类器官培养系统，以探究肠道生理学和疾病（特别是炎症性肠病）的不同方面。实验前首先准备所有试剂，并将基底膜基质在冰上解冻。然后配制小鼠单层培养基。

将解冻的基底膜用冰冷的小鼠单层培养基按1:20稀释，并置于冰上保存。使用无菌镊子将一个0.4微米透明细胞培养小室放入24孔组织培养板的单个孔中。抓住小室的一个角状突起，将其转移至孔内。

重复操作直至获得足够数量的细胞培养小室用于培养。为在每个细胞培养小室的顶端表面覆盖稀释的基底膜基质，将P200移液器的吸头置于小室中央，加入150 µL基质。随后将培养板转移至37°C、含5% CO₂的无菌培养箱中，孵育至少1小时。

孵育结束时，将24孔板旋转至45度角。用一根手指按住插件齿部的角落以固定插件。将P200移液器吸头轻轻沿插件底部边缘插入，并移除基底膜基质。

用150微升不含钙离子和镁离子的无菌DPBS洗涤每个细胞培养小室，以去除任何过量残留物，并将其置于生物安全柜中干燥至少10分钟。待小室干燥后，在底部加入400微升小鼠单层培养基，在细胞培养小室顶部加入75微升，重复此操作直至所有细胞培养小室均被浸没。将培养板置于生物安全柜或培养箱中，直至后续使用。

然后从培养箱中取出成熟的肠道类器官24孔板，置于生物安全柜中。使用无菌吸头吸除培养基，并用1毫升室温的无钙镁离子的无菌DPBS洗涤每个孔。使用无菌吸头移除DPBS。

将每孔中待传代的基底膜基质小块用500微升酶解离试剂进行消化。为打散基质小块，将24孔板倾斜45度角旋转。将移液器枪头置于小块边缘，通过轻轻吹打每个小块约6至10次，使其从孔底脱离。

将24孔板放回37摄氏度、含5%二氧化碳的无菌培养箱中孵育三到四分钟。孵育后，在生物安全柜中将每一孔的胰蛋白酶上下吹打五至七次。将每孔中解离的结肠类器官转移至无菌的15毫升锥形管中，并用预冷的小鼠洗涤培养基定容至10毫升。

接下来，在水平转子离心机中，将部分消化的 OIDs 以 300g 离心五分钟，温度为 4 摄氏度。在生物安全柜内，使用 10 毫升移液器从沉淀中移除上清液。同时，使用 P200 移液器移除任何残留的培养基。

然后加入75 µL小鼠单层培养基，重悬结肠类器官沉淀。取75 µL结肠类器官悬液，加入每个细胞培养小室的中央。在将悬液加入培养孔之前，轻轻吹打1至2次，以确保接种均匀。

将含有细胞培养小室的24孔板置于旋转平台上，旋转10分钟，以使细胞培养小室内物质均匀分布，随后将该板放入37°C、5%二氧化碳的无菌培养箱中。培养结束后，通过将移液枪头紧贴细胞培养小室内壁，用P200移液器反复吹打培养基3至5次，使未贴壁的结肠类器官片段脱落。注意避免破坏已贴壁的肠上皮细胞。

立即移除培养基和 conoloid 混合物。重复此步骤，直至所有细胞培养小室均被清洁。现在，向每个细胞培养小室的顶端侧加入 150 微升预热的小鼠单层培养基。

向新的24孔板的每孔中加入400微升预热的小鼠单层培养基。使用无菌镊子夹住细胞培养插件的插脚，将其转移至新板中。每隔一天更换一次培养基，直至达到所需的汇合度。

接种在细胞培养小室上的经酶消化处理的结肠类器官最初呈现为由15至150个细胞组成的细胞簇。第3天时，细胞逐渐铺展并缓慢覆盖整个细胞培养小室，通常达到汇合状态。在随后的几天内，单层细胞持续生长，形成可定量测量的连续屏障。