H9c2 心肌细胞中电压依赖性钾电流的记录 通过 全细胞膜片钳技术

本方案成功记录了乌头碱对H9C2细胞IKv的影响，为从离子通道角度研究药物心脏毒性的机制提供了新的研究阶段。全细胞膜片钳技术是离子通道研究的金标准，具有高灵敏度、高精度和高特异性。

全细胞膜片钳技术可用于研究多系统疾病（如心血管系统和神经系统）中邻近门控特定离子通道的药理或毒性机制。首先，当H9C2培养皿细胞融合度达到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞30秒。随后，将2×10⁵个细胞/毫升接种于35毫米培养皿中，培养皿底部铺有玻璃盖片，使用正常培养基或含药培养基，在37°C、5%CO₂及70%～80%相对湿度条件下培养24小时。

打开微量移液器拉制仪并预热30分钟。然后将带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管放置在微量移液器拉制仪上。选择程序，然后点击控制面板上的“Enter”键。

单击右上角的斜率程序以确定玻璃毛细管的加热值。根据斜率测试确定的数值编写电极拉制程序，然后单击拉制以开始制备移液管。打开数字模拟转换器、信号放大器、显微操作器、显微镜和相机。

依次打开成像应用程序、信号放大器软件和数据采集软件。在数据采集软件中，单击“采集”并选择“编辑协议”。在波形界面中编辑程序。

输入 epoch A、epoch B 和 epoch C 的第一层级值、层级差值、第一持续时间以及持续时间差值。然后点击模式速率界面，设置试验层级数据。接下来，点击编辑协议，选择刺激按钮，并在 PM 漏电流减除对话框中设置漏电流减除程序。为建立数据存储路径，请点击文件，然后在数据采集软件中选择设置数据文件名。

然后，在数据采集软件中选择“acquire”并点击“open protocol”，打开已建立的lKv实验方案。最后，点击“tools”选项，选择“membrane test”以开始运行该方案。将细胞外液加入全细胞膜片钳装置的细胞浴中，并将载有H9C2细胞的盖玻片细胞面朝上置于浴槽内。

用细胞外液填充移液管体积的30%，并将移液管安装到膜片钳装置集成的记录电极夹持器上。用记录电极夹持器拧紧移液管，然后通过显微操作器将移液管放入浴液中。

点击信号放大器软件中的移液管偏移界面，将 lKv 电流基线维持在零皮安。使用连接至记录电极 holder 的 1.0 毫升注射器，通过塑料管手动施加适当的正压。通过三维调节显微操作器，轻微移动移液管，使其接触细胞。

当移液管接触细胞膜后，若膜测试方波下降至原来的三分之一到一半，即去除正压，并手动施加适当的负压。然后点击数据采集软件中的封接界面以形成吉欧封接（gigaseal）。在细胞封接过程中，使用信号放大器软件中的快速电容补偿和慢速电容补偿功能，以补偿快速和慢速电容。

施加短暂的负压脉冲以破裂细胞膜上的膜片。通过点击信号放大器软件中的全细胞按钮，执行全细胞膜电容补偿。最后，点击数据记录按钮以保存并记录数据。

使用数据分析软件打开已保存的 lKv 数据。保存当前的电压关系。点击“分析”以选择统计功能。

选择游标1和2作为数据分析范围，点击峰幅值和均值按钮，然后点击确定，在结果页面中查看数据。最后，将lKv均值数据列复制到函数绘图软件中进行进一步分析。保存具有代表性的lKv电流轨迹。

单击“编辑”以选择需要转移的轨迹，然后在目标区域中选择完整的轨迹。接着，在轨迹选择中单击“选择”，并在信号中选择 IN 0。最后，单击“确定”以在结果页面中查看数据，并将全部数据复制到函数绘图软件中绘制电流轨迹。

保存 lKv 协议。单击“编辑”以选择创建刺激波形信号，然后选择“确定”。接着重复该步骤以绘制电流轨迹，但不再选择信号。

在保持电位为负60毫伏的条件下，通过持续150毫秒、从负40毫伏到正60毫伏的去极化脉冲刺激来激活瞬时外向钾电流（lKv）。大鼠H9C2心肌细胞的lKv在约负20毫伏时首次出现，随后随着进一步去极化，电流幅度逐渐增大。与对照组相比，经1.5毫摩尔4-AP处理5分钟后，lKv的幅度明显降低。

此外，在24小时交流处理后，膜电位在10至60毫伏范围内，lKv显著降低，且呈剂量依赖性。记录离子通道后的单个细胞可用于进一步的单细胞组学分析，例如单细胞基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学。