人卵泡中的基因表达分析

该协议描述了一种从周围基质细胞中分离卵巢卵泡以评估这些生殖细胞的基因表达分析的有效方法。这种技术使用受控的酶和机械分离，允许在保持其完整性的同时检索卵泡。按照该协议，研究人员可以评估这些细胞的特定基因表达。

该技术可用于进一步了解与影响卵巢功能的疾病或暴露于有毒物质后相关的卵泡中基因表达的缺陷。通过向第一个孔中加入 5 毫升冷冻保护剂溶液和向接下来的四个孔中加入 5 毫升 Leibovitz 15 培养基并降低冷冻保护剂浓度，开始制备六孔板。按照安全规则从液氮中取出含有卵巢皮质碎片的小瓶。

在室温或室温下 30 秒后，将小瓶浸泡在双蒸水中两分钟。在垂直罩内，轻轻搅拌并打开卵巢皮质碎片小瓶，然后将内容物转移到放置在冰上的六孔板的第一个孔中。然后，将第一孔中的卵巢皮质碎片依次转移到含有五毫升Leibovitz 15培养基中降低浓度冷冻保护剂的六孔板的每个孔中。

在每种培养基中轻轻搅拌组织五分钟。对于卵泡分离，将解冻的卵巢组织转移到装有 10 毫升解剖培养基、每毫升 30 微克青霉素 G 和每毫升 50 微克链霉素的 2 毫米网格培养皿中。如有必要，用手术刀调整组织大小。

堆积三块组织切片机，并将卵巢碎片放在两个块之间。用刀片将碎片切成两半，滑过块以获得两个0.5毫米厚的碎片。使用组织切碎器切割组织以获得较小的碎片。

如有必要，用手术刀手动切割剩余的碎片，直到组织被粉碎。一旦组织被粉碎，将破碎的组织转移到装有7毫升消化培养基的网格培养皿中，然后将培养皿放入5%二氧化碳和37摄氏度的培养箱中。每10分钟从培养箱中取出培养皿。

用一毫升移液管上下移液消化培养基来冲洗组织。在消化培养基中孵育45分钟后，将培养皿置于放大倍数范围为5至6.3倍的体视显微镜下，并使用微毛细管移液管取出卵泡。选择感兴趣的卵泡，并通过用口腔移液管吸吮它们来分离它们。

如果卵泡仍然卡在一块皮层中，用两个 27 号注射器机械地隔离它们，方法是用注射器的尖端撕下皮层并从基质中释放卵泡。使用微毛细管，将分离的卵泡转移到含有15微升校准培养基的四孔板中，该培养基被500微升油培养物覆盖。转移1至10个卵泡后，用两滴15微升PBS冲洗两次，覆盖有500微升油培养物，每次冲洗5秒钟。

使用口腔移液器，在空管中用最少的PBS收集20个卵泡，并将管保持在冰上。在消化培养基中孵育90分钟后，通过加入冷阻断溶液停止酶促反应。在化学罩下，将分离的卵泡悬浮在 RNA 提取试剂盒随附的 100 微升裂解液中。

以每分钟2500 RPM的速度涡旋分离的卵泡以破坏其结构，然后将50微升100%乙醇加入管中。并高速短暂涡旋管子。涡旋后，将管的总体积转移到包括柱和收集管的微滤芯组件中。

并将组件在16下离心10秒钟，在4摄氏度下离心363g。在离心管10秒钟之前，用试剂盒随附的180微升洗涤溶液1洗涤柱。向色谱柱中洗涤两次180微升洗涤溶液2，3后，通过最后一次离心管来干燥过滤器，并在滤芯下方放置一个新的收集管。

要进行核酸洗脱，首先向过滤器组件中加入八微升75摄氏度洗脱液。一分钟后，将组件离心 30 秒。用七微升洗脱液重复此步骤。

完成后，向管中加入两个国际单位 DNase 和 DNase 缓冲液，并在 37 摄氏度下孵育管 20 分钟。在室温下用1×10 DNase灭活试剂阻断酶活性两分钟。接下来，将试管在 16， 363g 下在 4 摄氏度下离心 1.5 分钟，并将含有 RNA 的悬浮液转移到新管中。

使用分光光度计评估样品中RNA的含量。使用一微升洗脱液作为空白溶液和从分离卵泡中提取的一微升RNA溶液。检查 RNA 纯度的 260/280 比率是否在 2.0 左右。

并将样品储存在零下80摄氏度或直接逆录以进行RT-qPCR。 使用该协议，处理来自同一患者的两个4x2x1毫米的均质卵巢碎片以分离卵泡。RNA定量显示，从小于75微米的卵泡中提取每微升总RNA4.8纳克，纯度比为1.89。

从小于200微米的卵泡中，以1.74的纯度比提取每微升总RNA10.5纳克。一号和二号试管中的RNA完整性数（RIN）值分别为7.1和7.9，分别验证了我们样品中RNA的质量。在实时荧光定量PCR系统上运行标准循环后，HPRT获得的循环阈值或CT分别为30.87和29.56，试剂盒配体为33.5和31.77，GDF9为30.71和30.57。

组织的酶消化是一个关键点。实验者必须通过在必要时停止它来持续评估并确保反应过程中的卵泡完整性。除了基因表达分析外，分离的卵泡还用于开发实验系统，以保持癌症患者的生育能力，如卵泡体外培养或人工卵巢。

分离技术需要一个学习曲线来检索大量完整的卵泡。建议研究人员确保组织在消化前充分破碎。