测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率
2023年1月20日
此处介绍了一种制备包封编码萤火虫荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）的方案。这些LNPs已用于检测其效能 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在 C57BL/6 小鼠中。
该方案可用于制备包封MRA的均一脂质纳米颗粒。可通过调节配方参数，并对不同脂质纳米颗粒的效力和生物分布进行评估。采用标准化的脂质纳米颗粒制备及体外、体内检测方案，可获得可相互比较的均一脂质纳米颗粒。
在配制和评估纳米颗粒效力时，有许多细节需要注意，但应考虑哪些细节呢？制剂的制备不应困难。首先，取一个洁净的4升烧杯，加入200至300毫升新鲜的10X PBS，并用超纯水稀释至1X。
确保 PBS 的终体积在 2 至 3 升之间。将适用于脂质纳米颗粒（LNP）制剂的适当容量透析盒放入现场烧杯中。使用超纯水将 100 毫摩尔/升柠檬酸缓冲液储备液稀释十倍，制备用于 mRNA 稀释的 10 毫摩尔/升柠檬酸缓冲液。
接下来，将C 12 200可电离脂质、辅助脂质、胆固醇以及脂质锚定的PEG或脂质-PEG分别溶于100%乙醇中，配制其储备溶液。在37摄氏度下加热并混合，确保各储备溶液完全溶解。将计算好的不同脂质组分体积加入一个锥形管中混合。
用100%乙醇将脂质稀释至终体积V，该体积占LNP终体积的25%。根据可电离脂质与mRNA的质量比以及mRNA-LNP的总体积，计算配方所需的mRNA用量。接着，将编码萤火虫荧光素酶的mRNA置于冰上解冻。
然后用10毫摩尔柠檬酸缓冲液将mRNA稀释至有机相体积的三倍。用可去除RNA和DNA的表面去污剂喷洒一块柔软的擦拭布，并彻底擦拭微流控仪器的内部。接着，打开一个新的微流控芯片，将其插入仪器，使入口通道朝下并朝外。
将两个无菌的15毫升锥形管取下管盖后放置于支架上。操作完成后，用5毫升注射器吸取含有mRNA的溶液，该溶液用10毫摩尔柠檬酸缓冲液稀释。然后用3毫升注射器吸取含有脂质的溶液，该溶液用100%乙醇稀释。
务必去除注射器中的任何气泡。然后，在不安装针头的情况下，将装有mRNA溶液的5毫升注射器插入卡盒的左侧入口，将装有脂质溶液的3毫升注射器插入卡盒的右侧入口。打开微流控仪器，并选择快速运行模式。
插入五毫升和三毫升注射器后，选择正确的注射器类型，设置水相与有机相流速比为3:1的LNP制备参数，然后按下启动按钮以制备mRNA-LNPs。使用注射器将收集在右侧锥形管中的mRNA-LNPs加载至预先水化的透析盒中，注意不要刺穿或触碰透析膜。将含有mRNA-LNPs的透析盒放回盛有PBS的烧杯中，透析至少两小时。透析完成后，将含有mRNA-LNPs的透析盒转移至无菌生物安全柜中，使用带针头的注射器取出mRNA-LNPs。
使用0.22微米针头滤器对mRNA-LNP进行无菌过滤，并收集至无菌锥形管中。随后，取65微升mRNA-LNP溶液加入1.5毫升微量离心管中用于表征分析。在96孔白色壁透明底板中，每孔加入100微升完全细胞培养基，接种5,000个HepG2细胞，并在含5%二氧化碳、37摄氏度的恒温培养箱中过夜培养。
在用mRNA-LNP处理细胞之前，从孔中移除完全培养基。接着，向细胞中加入100微升用完全细胞培养基稀释至所需剂量的mRNA-LNP，或加入100微升完全培养基，随后进行24小时孵育。孵育结束后，从96孔板中移除细胞培养基，每孔加入20微升裂解缓冲液，随后加入100微升荧光素酶检测试剂。
避光保护该孔板，并将孔板放入酶标仪中检测生物发光信号。使用无菌 PBS 稀释 mRNA-LNP 溶液，使尾静脉注射体积为 100 微升时含有 2 微克总 mRNA。用 100 微升 mRNA-LNP 溶液或 100 微升 PBS 填充一支 29 号胰岛素注射器，并排除注射器中的任何气泡。
将针头斜面向上插入小鼠的侧尾静脉，缓慢注射100微升mRNA-LNP或PBS。注射后6小时，用无菌PBS配制15毫克/毫升的D-荧光素钾盐储备液。在活体成像系统（IVIS）的成像软件中，点击发光成像（luminescence）选项旁的复选框，然后点击“初始化”以准备仪器进行数据采集。
随后，向先前处理过的小鼠腹腔内注射 200 微升 D-荧光素酶底物，等待 10 分钟，使荧光素酶信号稳定，然后对小鼠进行麻醉。将麻醉后的小鼠转移至活体成像系统内的鼻罩中，确保小鼠仰卧且腹部暴露，然后关闭成像室门。在成像软件中，确认选择正确的视野范围，并将曝光时间设为自动，点击软件中的“采集”按钮以获取生物发光图像。
使用此处所示的改良荧光测定法及公式，测得 mRNA-LNP 的包封效率为 92.3%。在对 5,000 个 HepG2 细胞使用递增剂量的 mRNA-LNP 处理后，观察到生物发光信号逐渐增强。在本研究中，每孔最低剂量为五纳克时，即可轻松检测到荧光素酶的表达。
在用配制的LNPs处理的小鼠上腹部观察到强烈的生物发光信号。在肝脏信号周围绘制了感兴趣区域，以计算总发光通量。总发光通量约为5乘以10的9次方。
配制脂质纳米颗粒（LNP）时，始终维持可电离脂质与核酸的重量比。每一份体积的有机相应包含与三份体积水相中mRNA相对应的可电离脂质。
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概述
本文介绍了一种制备脂质纳米颗粒（LNPs）的方案，该颗粒包封了编码萤火虫荧光素酶的mRNA。通过体外HepG2细胞和体内C57BL/6小鼠实验评估了这些LNPs的效力。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米颗粒制剂
- mRNA 递送系统
- 体外和体内测试
背景
- 脂质纳米颗粒对mRNA递送至关重要。
- 制剂参数会显著影响纳米颗粒的性能。
- 标准化操作流程有助于提高可重复性和可比性。
- 了解效力和生物分布对于治疗应用至关重要。
研究目的
- 建立一种可靠的LNP制剂方案。
- 评估LNP在不同生物环境中的效力。
- 提供一种比较不同LNP制剂的框架。
使用的方法
- 制备包封mRNA的脂质纳米颗粒。
- 在HepG2细胞中进行体外测试。
- 在C57BL/6小鼠中进行体内测试。
- 评估制剂参数及生物分布。
主要结果
- 成功制备了包封mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）。
- 在体外和体内模型中均显示出有效性。
- 确定了影响性能的关键制剂参数。
- 标准化的实验方案可实现一致的比较。
结论
- 所开发的方案对脂质纳米颗粒（LNP）的制备是有效的。
- 体外和体内测试证实了LNP在mRNA递送中的实用性。
- 未来的研究可在此框架基础上进一步优化。
常见问题
行业重要性概述
标准化的微流控制剂及对mRNA-脂质纳米颗粒（LNPs）的定量检测，可对递送效率和生物分布进行可靠评估，这对于早期核酸治疗药物的开发至关重要。该工作流程有助于在体外和体内模型中对LNP性能进行可预测性评估，为决策提供依据，并支持研发项目的筛选与优先级排序。一致的包封效率和效价评估是mRNA相关疗法研发中可扩展、可重复的R&D流程的基础。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可系统性地研究LNP制剂参数对递送效率的影响。
- 通过在相关细胞系和动物模型中定量分析mRNA转染与表达，支持生物学风险评估。
- 在进行后续优化之前，有助于对LNP-mRNA构建体进行功能验证。
筛选与检测方法开发
- 提供可重复的平台，用于制备和表征脂质纳米颗粒（LNPs），以开展筛选实验。
- 提供定量的生物发光检测信号，用于剂量-反应关系和效价评估。
- 实现脂质纳米颗粒（LNP）制剂的检测标准化及不同批次间的可比性。
转化与临床前研究
- 整合体外和体内数据，以支持递送系统评价中的转化连续性。
- 定量分析生物分布及器官特异性递送，为临床前风险评估提供依据。
- 基于定量性能指标，支持对脂质纳米颗粒（LNP）候选物进行风险调整后的推进决策。
流程与工作流整合
本方案整合了从早期发现到临床前评价的全过程，涵盖了制剂开发、体外活性以及体内生物分布评估。
- Discovery Biology：利用标准化的定量检测方法，支持对脂质纳米颗粒（LNP）组分及递送效率的假设验证。
- Screening：通过生物发光信号输出，实现LNP批次的可重复制备及其效价的高通量筛选。
- Analytics：提供定量的包封效率与发光通量测量，用于比较分析。
- Translational Research：整合体外转染数据与体内分布特征，指导候选LNP-mRNA的筛选与优化。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用、标准化的LNP-mRNA评估工作流程，适用于多个研发项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高LNP递送和表达在不同生物系统中的预测可信度。
- 操作价值：推动纳米颗粒制剂与测试的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过提供可靠的定量数据，支持决策推进或终止项目，降低后期研发风险。
- 项目组合影响：实现对LNP候选物进行基于风险调整的优先级排序，以推进后续开发。
实施注意事项
- 需要具备纳米颗粒制剂和定量生物发光检测方面的专业知识。
- 需要使用微流控混合仪器和活体成像系统。
- 要求各团队在制剂和检测方案上进行严格的标准化。
- 针对不同的mRNA载荷或靶组织可能需要进行方法调整。
- 实际限制因素包括维持稳定的脂质与mRNA比例，以及确保批间可重复性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:50
Pre-Formulation Preparation
1:51
Preparation of the Lipid and Nucleic Acid Mixes
2:33
Microfluidic Formulation of mRNA-LNPs
3:56
Post-Formulation Processing and Characterization of the mRNA-LNPs
4:51
In Vitro Transfection of HepG2 Cells
5:55
In Vivo Evaluation of mRNA-LNPs in Mice Following Tail Vein Injection
7:34
Results: Formulation of mRNA-LNPs and the Assessment of In Vitro and In Vivo Performance
8:24
Conclusion
