Name: 测试通过微流控混合配制的mRNA-脂质纳米颗粒的 体外 和 体内 效率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 了解利用微流控混合技术配制mRNA脂质纳米颗粒的标准化方案，并在HepG2细胞和C57BL/6小鼠模型中进行体外和体内效率评估。该方法为mRNA递送系统的优化提供了可靠框架。

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M.J.M. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖（DP2 TR002776）、伯纳姆基金会科学交叉领域职业奖（CASI）、美国国家科学基金会职业奖（CBET-2145491）的支持，以及美国国立卫生研究院的额外资助（NCI R01 CA241661、NCI R37 CA244911 和 NIDDK R01 DK123049）。

注意：配制 mRNA-LNP 时，务必保持无 RNase 环境，使用针对 RNase 和 DNA 的表面去污剂擦拭台面和设备。仅使用无 RNase 的枪头和试剂。
所有动物实验均按照宾夕法尼亚大学《实验动物护理与使用指南》以及经宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 处方前准备
<ol>
	<li>用一个洁净的 4 L 烧杯装入 200–300 mL 新鲜的 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）。
	<ol>
		<li>用超纯水将烧杯中的 10x PBS 稀释 10 倍，得到 1x PBS 溶液。确保 1x PBS 的最终体积在 2–3 L 之间。</li>
		<li>将适用于 LNP 配方的适当容量的透析夹（20 kDa 分子量截留值 [MWCO]）放入装满液体的烧杯中进行水合。 
		注意：透析夹在使用前至少需要 2 分钟的水合时间。</li>
		<li>将搅拌子放入烧杯中，并用铝箔覆盖烧杯。</li>
		<li>将覆盖好的烧杯置于磁力搅拌器上。打开搅拌器，调节转速至 300–400 rpm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用超纯水将 100 mM 柠檬酸缓冲液原液（pH 3）稀释 10 倍，制备用于 mRNA 稀释的 10 mM 柠檬酸缓冲液。</li>
	<li>通过将每种脂质溶解于 100% 乙醇中，制备 C12-200 可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和脂质锚定 PEG（脂质-PEG）的储备溶液。各脂质组分的浓度详见 表 1。
	<ol>
		<li>在 37 °C 下加热并混合储备溶液，以确保其完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脂质和核酸混合物的制备
<ol>
	<li>根据所需的摩尔比以及可电离脂质与 mRNA 的质量比（表 1），计算所需离子型脂质、辅助脂质、胆固醇和脂质-PEG 的体积。配制时，有机相的总体积需额外准备 10%，以补偿注射器中的死体积。
	<ol>
		<li>将计算好的各种脂质组分体积加入一个锥形管中。</li>
		<li>用 100% 乙醇将脂质稀释至最终体积 V，该体积占 LNP 最终体积的 25%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据可电离脂质与 mRNA 的质量比以及所需 mRNA-LNP 的总体积，计算配方所需的 mRNA 量（表 1）。
	<ol>
		<li>将编码萤光素酶的 mRNA 在冰上解冻。</li>
		<li>将 mRNA 用 10 mM 柠檬酸缓冲液稀释至最终体积 3V，即有机相体积的三倍。 
		&#8203;注意：每一体积的脂质溶液 V 必须含有足量的可电离脂质，以包载稀释在 3V 体积中的 mRNA，此比例对应于目标的可电离脂质与 mRNA 质量比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. mRNA-LNP 的微流控制剂
<ol>
	<li>使用一种可去除RNase和DNA的表面去污剂喷洒无绒布，彻底擦拭微流控仪器的内部。
	<ol>
		<li>打开一个新的微流控芯片，将其插入时使进样通道朝下并远离操作者。</li>
		<li>确保锥形管支架上装有两个15 mL离心管，并位于最右侧的位置。</li>
		<li>在支架上放置两个无菌的15 mL离心管，管盖取下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用含有溶于10 mM柠檬酸缓冲液中的mRNA溶液填充一个5 mL注射器。
	<ol>
		<li>用含有溶于纯100%乙醇中的脂质溶液填充一个3 mL注射器。</li>
		<li>将微流控装置上的芯片支架向上翻起。</li>
		<li>将不含针头的5 mL mRNA注射器插入芯片的左侧进样口。</li>
		<li>将不含针头的3 mL脂质注射器插入芯片的右侧进样口。</li>
		<li>将芯片支架翻回原位，并关闭微流控仪器的盖子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过仪器背面的开关打开微流控仪器。
	<ol>
		<li>选择 快速运行。</li>
		<li>为已插入的5 mL和3 mL注射器选择正确的注射器类型。</li>
		<li>按照 表2 中所述，输入mRNA-LNP制剂的参数，水相与有机相流速比为3:1。</li>
		<li>按下 下一步 按钮进入下一个界面。</li>
		<li>确认已正确输入参数。</li>
		<li>按下 开始 按钮以制备mRNA-LNP。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. mRNA-LNP 制剂的后续处理与表征
<ol>
	<li>将收集在右侧锥形管中的 mRNA-LNP 加载到先前已水化的透析盒中。 
	注意：加载 mRNA-LNP 时，切勿刺破或损坏透析盒的膜。若膜受损，加载时将导致 mRNA-LNP 损失。
	<ol>
		<li>将含有 mRNA-LNP 的透析盒放回盛有 1× PBS 的烧杯中，透析至少 2 小时。</li>
		<li>透析完成后，将含有 mRNA-LNP 的透析盒转移至无菌生物安全柜中，使用带针头的注射器取出 mRNA-LNP。</li>
		<li>使用 0.22 µm 注射式滤器对 mRNA-LNP 进行无菌过滤，并收集至无菌锥形管中。</li>
		<li>取 65 µL mRNA-LNP 溶液置于 1.5 mL 微量离心管中，用于表征分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在比色皿中，将 10 µL mRNA-LNP 用 990 µL 1× PBS 稀释 100 倍，用于通过动态光散射法测定其流体动力学粒径和多分散指数。</li>
	<li>使用荧光检测法（如 RiboGreen 法）评估 mRNA-LNP 的浓度和包封效率。
	<ol>
		<li>通过将 20× TE 缓冲液用分子生物学用水稀释，配制 1× TE 缓冲液的储备液。</li>
		<li>通过将 Triton X-100 用 1× TE 缓冲液稀释，配制 1% Triton X-100 缓冲液的储备液。</li>
		<li>将荧光试剂储备液用 1× TE 缓冲液按 1:200 比例稀释，配制荧光工作液。</li>
		<li>在黑色侧壁、黑色底板的 96 孔板中，将 mRNA-LNP 用 1× TE 缓冲液和 1% Triton X-100 缓冲液按 1:100 比例稀释，每孔体积为 100 µL。</li>
		<li>根据试剂盒说明书稀释 RNA 标准品，制备低浓度范围标准曲线，并将标准品点样至 96 孔板中。</li>
		<li>向每孔含稀释后 mRNA-LNP 或稀释后标准品的孔中加入 100 µL 稀释后的荧光工作液。</li>
		<li>将 96 孔板放入酶标仪中，振荡 1 分钟，随后静置 4 分钟。</li>
		<li>根据试剂盒说明书，在激发波长/发射波长 480 nm/520 nm 条件下测定各孔的荧光强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用标准曲线将荧光值转换为浓度。
	<ol>
		<li>根据公式 4.4，通过从 1% Triton X-100 缓冲液稀释 LNP 所得值（总 mRNA）中减去 TE 缓冲液稀释 LNP 所得值（未包封 mRNA），再除以 1% Triton X-100 缓冲液稀释 LNP 所得值，计算包封效率。</li>
		<li>通过从 1% Triton X-100 缓冲液稀释 LNP 所得值（总 mRNA）中减去 TE 缓冲液稀释 LNP 所得值（未包封 mRNA），计算用于细胞和动物实验的 mRNA-LNP 浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 6-(对甲苯氨基)-2-萘磺酰氯（TNS）检测法测定 mRNA-LNP 的 pKa。
	<ol>
		<li>将 TNS 溶于超纯水中，配制 0.16 mM 的 TNS 试剂溶液。 
		注意：使用该试剂时，务必将其置于冰上并避光保存，以防降解。</li>
		<li>配制含 150 mM 氯化钠、20 mM 磷酸钠、25 mM 柠檬酸铵和 20 mM 醋酸铵的缓冲溶液，并调节 pH 值至 2 至 12 范围内，以 0.5 为间隔梯度设置。</li>
		<li>在黑色侧壁、黑色底板的 96 孔板中，向每种 pH 值调节后的缓冲溶液中加入 2.5 µL LNP。</li>
		<li>向每孔加入 TNS 试剂，使最终 TNS 浓度为 6 µM。</li>
		<li>将 96 孔板置于避光环境中孵育 5 分钟。</li>
		<li>使用荧光酶标仪在激发波长/发射波长 322 nm/431 nm 条件下测定荧光强度。</li>
		<li>将数据拟合为 S 形曲线，并利用拟合方程计算荧光强度达到最大值 50% 时对应的 pH 值，即为 pKa。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mRNA-LNP 的流体动力学粒径、PDI、包封效率和 pKa 的代表性结果见表 3。</li>
</ol>
5. 体外 HepG2细胞转染
注意：可使用其他多种细胞系（如 HeLa 细胞或 HEK-293T 细胞）评估脂质纳米颗粒（LNP）的转染效率 体外所有细胞在进行LNP转染研究前均应检测支原体呈阴性。
<ol>
	<li>在96孔白色壁透明底板的每个孔中加入100 µL完全培养基（DMEM，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素），接种5,000个HepG2细胞。
	<ol>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的恒温CO2培养箱中过夜，使其贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用完全培养基稀释mRNA-LNP，使总剂量在100 µL体积中加入。
	<ol>
		<li>吸去各孔中的完全培养基。</li>
		<li>向细胞中加入经完全培养基稀释至所需剂量的mRNA-LNP，或仅加入完全培养基（对照组）。</li>
		<li>将含有处理后细胞的96孔板重新放回恒温CO2培养箱中，继续培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过荧光素酶检测评估转染效率。
	<ol>
		<li>根据制造商说明书配制荧光素酶检测试剂和1×细胞裂解缓冲液。</li>
		<li>从培养箱中取出含细胞的96孔板，转移至生物安全柜中。</li>
		<li>吸去96孔板中每个孔的细胞培养基。</li>
		<li>向每孔加入20 µL 1×裂解缓冲液，随后加入100 µL预先配制的荧光素酶检测试剂。</li>
		<li>避光孵育，然后将板放入酶标仪中检测每孔的生物发光信号。 
		&#8203;注：使用先前配制的C12-200 mRNA-LNP处理HepG2细胞的代表性结果见图1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 尾静脉注射后在小鼠体内对 mRNA-LNP 进行 体内 评价
<ol>
	<li>用无菌的1×PBS稀释mRNA-LNP溶液，使100 µL尾静脉注射体积中含有2 µg总mRNA，相当于体重剂量约为0.1 mg/kg（以20 g小鼠计）。</li>
	<li>使用经批准的方法固定每只小鼠，并用浸有70%酒精的棉垫擦拭尾部。
	<ol>
		<li>用一支29 G胰岛素注射器吸取100 µL mRNA-LNP（2 µg）或100 µL 1×PBS。排除注射器中的气泡。</li>
		<li>将针头斜面向上插入小鼠尾侧静脉，缓慢注射 100 µL mRNA-LNP 或 1x PBS。</li>
		<li>移除针头并按压至止血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射后6小时，在无菌1×PBS中配制15 mg/mL的D-荧光素钾盐储备液。
	<ol>
		<li>打开 体内 成像系统（IVIS）并打开成像软件。</li>
		<li>按压 初始化 为数据采集准备仪器。</li>
		<li>勾选发光成像选项，并将曝光时间设为自动。确保根据成像小鼠的数量选择正确的视野范围。</li>
		<li>向经预处理的小鼠腹腔注射 200 µL D-荧光素钠（荧光素剂量为每千克体重 150 mg）。</li>
		<li>将小鼠放入麻醉舱，设置异氟烷浓度为2.5%，氧气流速为2.0 L/min。</li>
		<li>等待10分钟，待荧光素酶信号稳定后，对mRNA-LNP处理的小鼠进行成像。</li>
		<li>确保小鼠已完全麻醉，并调整麻醉管路以给予异氟烷 通过 成像室内的鼻锥</li>
		<li>将小鼠转移至鼻罩，确保其仰卧且腹部暴露。</li>
		<li>关闭培养箱门，然后单击 获取 单击软件中的按钮以获取生物发光图像。 
		注：以下展示了经 mRNA-LNP 或 1X PBS 处理后小鼠全身成像的代表性结果 图2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+lipid+nanoparticles+for+enhanced+intracellular+delivery+of+mRNA+through+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano%22%5BJournal%5D)">Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation.</a> Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).</li>
<li>Bevers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-LNP+vaccines+tuned+for+systemic+immunization+induce+strong+antitumor+immunity+by+engaging+splenic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells.</a> Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).</li>
</ol>

不存在任何利益冲突需要声明。

通过该工作流程，可制备并测试多种mRNA-LNP，以评估其 体外 和 体内 效率。通过更换和组合不同的可电离脂质与辅料，并以不同的摩尔比以及不同的可电离脂质与mRNA质量比进行配制，可制备出具有不同理化特性的mRNA-LNP。22在此，我们以35/16/46.5/2.5（可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：脂质-PEG）的摩尔比配制了C12-200 mRNA-LNP，可电离脂质与mRNA的质量比为10:1。这些LNPs被用于转染效率的检测。 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在C57BL/6小鼠中。C12-200 mRNA-LNP通过商用微流控仪器采用微流控混合法合成。尽管可使用其他配方方法制备LNP，例如移液混合法或T型接头混合法。4微流控混合制备的mRNA-LNP通常尺寸更小、多分散性更低，且包封效率更高4,13,<sup class...

脂质纳米颗粒（LNPs）近年来在非病毒基因治疗领域展现出巨大前景。2018年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个RNA干扰（RNAi）治疗药物Onpattro（由Alnylam公司研发），用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性1,2,3,4这是脂质纳米颗粒和RNA疗法领域的一个重要进步。最近，Moderna以及Pfizer/BioNTech获得了美国食品药品监督管理局（FDA）对其针对SARS-CoV-2的mRNA-LNP疫苗的批准。4,5在每种基于LNP的核酸疗法中，LNP均用于保护其载荷免受核酸酶降解，并促进高效的细胞内递送6,7尽管脂质纳米颗粒（LNPs）已在RNA干扰疗法和疫苗应用中取得成功，mRNA-LNPs 也被探索用于蛋白质替代疗法。8 以及用于共递送 Cas9 mRNA 和向导 RNA，以递送 CRISPR-Cas9 基因编辑系统9然而，并没有一种特定的配方适用于所有应用，脂质纳米颗粒（LNP）配方参数的细微变化都可能显著影响其效力和体内分布 体内8,10,11因此，必须针对每种基于LNP的疗法分别开发和评估个体化的mRNA-LNPs，以确定其最佳制剂配方。
脂质纳米颗粒（LNPs）通常由四种脂质组分构成：一种可电离脂质、一种磷脂、胆固醇以及一种脂质锚定的聚乙二醇（PEG）缀合物（脂质-PEG）11,12,13。LNPs 实现高效的细胞内递送在一定程度上依赖于其中的可电离脂质组分12。该组分在生理 pH 条件下呈中性，但在内体的酸性环境中会带正电荷11。这种离子电荷的变化被认为对内体逃逸起着关键作用12,14,15。除可电离脂质外，磷脂（辅助脂质）组分有助于提高载荷的包封效率并促进内体逃逸，胆固醇可提供稳定性并增强膜融合能力，而脂质-PEG 则可减少 LNP 在循环过程中的聚集和调理作用10,11,14,16。在制备 LNP 时，这些脂质组分被溶于有机相（通常为乙醇）中，并与含有核酸载荷的水相混合。LNP 的制备过程具有高度灵活性，允许不同组分之间进行简便替换，并以不同的摩尔比例组合，从而制备出多种具有不同理化性质的 LNP 制剂&#160;10,17。然而，在探索如此多样的 LNP 类型时，至关重要的是采用标准化的流程对每一种制剂进行评估，以准确测量其在表征参数和性能方面的差异。
本文概述了mRNA-LNP制剂的完整工作流程，及其在细胞和动物中性能评估的方法。

<table><tbody><tr><td>0.1 M 盐酸</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Genesee</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 mL BD 滑动接头注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）（C14-PEG2000）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880150P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725P</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>23G 针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-6C</td><td></td></tr><tr><td>3 mL BD 一次性带鲁尔锁扣接头的注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 透析盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>A52976</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黑色侧壁黑色底板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-135</td><td></td></tr><tr><td>96 孔白色/透明底板，组织培养表面</td><td>Thermo Scientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵，1 千克</td><td>Research Products International</td><td>&amp;nbsp;631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>二碱式柠檬酸铵</td><td>SIgma</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>BD 鲁尔锁扣注射器，无菌，一次性使用，5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>C12-200 可电离脂质</td><td>Cayman Chemical</td><td>36699</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap FLuc mRNA（5moU）</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7202</td><td></td></tr><tr><td>一次性比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955129</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Thermo Scientific</td><td>L2916</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Exel 胰岛素注射器 - 0.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1484132</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hep G2 [HEPG2]</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyPure 分子生物学级水</td><td>Cytiva</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO 酶标仪</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 活体成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>大号 Kimwipes 擦镜纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-11D</td><td></td></tr><tr><td>荧光素酶检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>E4550</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Ignite 羧化盒 - 经典型 - 100 个装</td><td>Precision Nanosystems</td><td>NIN0065</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Ignite 仪器</td><td>Precision Nanosystems</td><td>NIN0001</td><td></td></tr><tr><td>PBS - 磷酸盐缓冲液（10x），pH 7.4，无 RNase</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>QB 柠檬酸盐缓冲液（100 mM 柠檬酸盐），pH 3.0</td><td>Teknova</td><td>Q2442</td><td></td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen RNA 定量检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>报告基因裂解 5x 缓冲液</td><td>Promega</td><td>E3971</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away 表面去污剂</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Sigma</td><td>7601-54-9</td><td></td></tr><tr><td>TNS 试剂（6-(对-甲苯氨基)-2-萘磺酸钠盐）</td><td>Sigma</td><td>T9792</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr></tbody></table>

测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mrna-脂质纳米颗粒的效率

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

脂质纳米颗粒（LNPs）因莫德纳（Moderna）和辉瑞/拜恩泰科（Pfizer/BioNTech）成功开发新型冠状病毒mRNA疫苗而受到广泛关注。这些疫苗证实了mRNA-LNP疗法的有效性，并为未来的临床应用开辟了道路。在mRNA-LNP系统中，LNPs作为递送平台，可保护mRNA载荷免受核酸酶降解，并介导其进入细胞内。LNPs通常由四种组分构成：一种可电离脂质、一种磷脂、胆固醇以及一种脂质锚定的聚乙二醇（PEG）共轭物（脂质-PEG）。本文中，通过微流控混合技术将含有LNP脂质组分的有机相与含有编码萤火虫荧光素酶mRNA的水相混合，制备包封该mRNA的LNPs，随后对这些mRNA-LNPs进行测试 体外 通过基于生物发光的平板检测法评估其在HepG2细胞中的转染效率。此外，对mRNA-LNP进行评估 体内 在C57BL/6小鼠中经静脉注射后 通过 侧尾静脉。使用活体生物发光成像系统进行全身生物发光成像 体内 成像系统。展示了mRNA-LNP的特性、其在HepG2细胞中的转染效率以及C57BL/6小鼠中的总发光通量的代表性结果。

使用微流控仪器制备mRNA-LNPs，其平均流体动力学直径为76.16 nm，多分散指数为0.098。通过TNS测定法测得mRNA-LNPs的pKa为5.7518。采用改进的荧光测定法并结合公式4.4，计算出这些mRNA-LNPs的包封效率为92.3%。用于细胞处理和动物给药的总体RNA浓度为40.24 ng/µL。该数值来源于改进的荧光测定法19，具体是通过将LNPs用1% Triton X-100和1×TE缓冲液稀释至特定浓度后测定荧光值，并据此计算出包封的mRNA含量而获得。
公式 4.4
<img alt="包封效率公式，EE%=(C_TX-C_TE)/C_TX×100，方程。" src="/files/ftp_upload/64810/64810eq01.jpg" style="margin: auto;" data...

此处介绍了一种制备包封编码萤火虫荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）的方案。这些LNPs已用于检测其效能 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在 C57BL/6 小鼠中。

测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率

脂质纳米颗粒（LNPs）因Moderna和...开发的COVID-19 mRNA疫苗取得成功而受到广泛关注

该方案可用于制备包封MRA的均一脂质纳米颗粒。可通过调节配方参数，并对不同脂质纳米颗粒的效力和生物分布进行评估。采用标准化的脂质纳米颗粒制备及体外、体内检测方案，可获得可相互比较的均一脂质纳米颗粒。在配制和评估纳米颗粒效力时，有许多细节需要注意，但应考虑哪些细节呢？制剂的制备不应困难。首先，取一个洁净的4升烧杯，加入200至300毫升新鲜的10X PBS，并用超纯水稀释至1X。确保 PBS 的终体积在 2 至 3 升之间。将适用于脂质纳米颗粒（LNP）制剂的适当容量透析盒放入现场烧杯中。使用超纯水将 100 毫摩尔/升柠檬酸缓冲液储备液稀释十倍，制备用于 mRNA 稀释的 10 毫摩尔/升柠檬酸缓冲液。接下来，将C 12 200可电离脂质、辅助脂质、胆固醇以及脂质锚定的PEG或脂质-PEG分别溶于100%乙醇中，配制其储备溶液。在37摄氏度下加热并混合，确保各储备溶液完全溶解。将计算好的不同脂质组分体积加入一个锥形管中混合。用100%乙醇将脂质稀释至终体积V，该体积占LNP终体积的25%。根据可电离脂质与mRNA的质量比以及mRNA-LNP的总体积，计算配方所需的mRNA用量。接着，将编码萤火虫荧光素酶的mRNA置于冰上解冻。然后用10毫摩尔柠檬酸缓冲液将mRNA稀释至有机相体积的三倍。用可去除RNA和DNA的表面去污剂喷洒一块柔软的擦拭布，并彻底擦拭微流控仪器的内部。接着，打开一个新的微流控芯片，将其插入仪器，使入口通道朝下并朝外。将两个无菌的15毫升锥形管取下管盖后放置于支架上。操作完成后，用5毫升注射器吸取含有mRNA的溶液，该溶液用10毫摩尔柠檬酸缓冲液稀释。然后用3毫升注射器吸取含有脂质的溶液，该溶液用100%乙醇稀释。务必去除注射器中的任何气泡。然后，在不安装针头的情况下，将装有mRNA溶液的5毫升注射器插入卡盒的左侧入口，将装有脂质溶液的3毫升注射器插入卡盒的右侧入口。打开微流控仪器，并选择快速运行模式。插入五毫升和三毫升注射器后，选择正确的注射器类型，设置水相与有机相流速比为3:1的LNP制备参数，然后按下启动按钮以制备mRNA-LNPs。使用注射器将收集在右侧锥形管中的mRNA-LNPs加载至预先水化的透析盒中，注意不要刺穿或触碰透析膜。将含有mRNA-LNPs的透析盒放回盛有PBS的烧杯中，透析至少两小时。透析完成后，将含有mRNA-LNPs的透析盒转移至无菌生物安全柜中，使用带针头的注射器取出mRNA-LNPs。使用0.22微米针头滤器对mRNA-LNP进行无菌过滤，并收集至无菌锥形管中。随后，取65微升mRNA-LNP溶液加入1.5毫升微量离心管中用于表征分析。在96孔白色壁透明底板中，每孔加入100微升完全细胞培养基，接种5,000个HepG2细胞，并在含5%二氧化碳、37摄氏度的恒温培养箱中过夜培养。在用mRNA-LNP处理细胞之前，从孔中移除完全培养基。接着，向细胞中加入100微升用完全细胞培养基稀释至所需剂量的mRNA-LNP，或加入100微升完全培养基，随后进行24小时孵育。孵育结束后，从96孔板中移除细胞培养基，每孔加入20微升裂解缓冲液，随后加入100微升荧光素酶检测试剂。避光保护该孔板，并将孔板放入酶标仪中检测生物发光信号。使用无菌 PBS 稀释 mRNA-LNP 溶液，使尾静脉注射体积为 100 微升时含有 2 微克总 mRNA。用 100 微升 mRNA-LNP 溶液或 100 微升 PBS 填充一支 29 号胰岛素注射器，并排除注射器中的任何气泡。将针头斜面向上插入小鼠的侧尾静脉，缓慢注射100微升mRNA-LNP或PBS。注射后6小时，用无菌PBS配制15毫克/毫升的D-荧光素钾盐储备液。在活体成像系统（IVIS）的成像软件中，点击发光成像（luminescence）选项旁的复选框，然后点击“初始化”以准备仪器进行数据采集。随后，向先前处理过的小鼠腹腔内注射 200 微升 D-荧光素酶底物，等待 10 分钟，使荧光素酶信号稳定，然后对小鼠进行麻醉。将麻醉后的小鼠转移至活体成像系统内的鼻罩中，确保小鼠仰卧且腹部暴露，然后关闭成像室门。在成像软件中，确认选择正确的视野范围，并将曝光时间设为自动，点击软件中的“采集”按钮以获取生物发光图像。使用此处所示的改良荧光测定法及公式，测得 mRNA-LNP 的包封效率为 92.3%。在对 5,000 个 HepG2 细胞使用递增剂量的 mRNA-LNP 处理后，观察到生物发光信号逐渐增强。在本研究中，每孔最低剂量为五纳克时，即可轻松检测到荧光素酶的表达。在用配制的LNPs处理的小鼠上腹部观察到强烈的生物发光信号。在肝脏信号周围绘制了感兴趣区域，以计算总发光通量。总发光通量约为5乘以10的9次方。配制脂质纳米颗粒（LNP）时，始终维持可电离脂质与核酸的重量比。每一份体积的有机相应包含与三份体积水相中mRNA相对应的可电离脂质。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

测试通过微流控混合配制的mRNA-脂质纳米颗粒的 体外 和 体内 效率

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

本文介绍了一种基于定量实时聚合酶链式反应的方法，用于测定脂蛋白颗粒中内源性微小RNA的含量（绝对/相对含量）。此外，还展示了提高微小RNA水平的方法，以及测定细胞对脂蛋白颗粒摄取速率的方法。...

天然脂蛋白颗粒中microRNA的富集及其绝对/相对microRNA含量与细胞间转移速率的测定

本方案介绍了利用交错人字形微混合器微流控装置制备热敏脂质体的优化参数。该方法还可实现阿霉素和吲哚菁绿的共包封，并通过光热触发释放阿霉素，从而实现可控/触发式药物释放。...

含溶血磷脂的温度敏感脂质体的微流控制备

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。...

利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

利用微流控混合装置开发了一种自组装肽-泊洛沙胺纳米颗粒（PP-sNp），用于包封与递送 体外 转录的信使RNA。所述mRNA/PP-sNp可有效转染培养细胞 体外.

高效转染 体外 使用肽-泊洛沙胺纳米颗粒在培养细胞中转录mRNA

本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内...

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

本方案提供了一种针对混合物、连续型和分类研究因素的配方优化方法，可最大限度地减少实验设计构建中的主观选择。在分析阶段，采用了一种高效且易于使用的建模拟合流程。...

利用设计的混合-过程实验与自验证集成模型（SVEM）优化脂质纳米颗粒（LNP）制剂的流程

本文介绍一种磁分离辅助的高速均质化方法，用于大规模制备来源于内体的纳米囊泡，作为一种新型的外泌体模拟物（EMs），其具有与天然细胞外囊泡（EVs）相同的生物学来源，以及相似的结构、形态和蛋白质组成。...

一种磁分离辅助的高速均质化方法用于大规模制备内体来源囊泡

本文演示了一种使用限域撞击射流（CIJ）混合器技术合成脂质纳米颗粒（LNPs）的详细方案，其中包括双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（µMIVM）。CIJ混合器可产生可重复的湍流微混合环境，从而制备出单一分散的LNPs。...

在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒

本方案将瑞利断裂（Rayleigh breakup）作为一种温和的方法，用于非病毒mRNA载体的气溶胶化。通过阿尔伯塔理想化鼻腔入口（Alberta Idealized Nasal Inlet,...

通过瑞利断裂气溶胶经鼻递送mRNA多聚复合物：一种 体外 鼻腔沉积与功能检测方法

了解利用微流控混合技术配制mRNA脂质纳米颗粒的标准化方案，并在HepG2细胞和C57BL/6小鼠模型中进行体外和体内效率评估。该方法为mRNA递送系统的优化提供了可靠框架。

测试体外和在体内微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率

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测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率

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