探究桔梗皂苷D在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型

该方法展示了AML-12细胞的应用，可用于构建模型并研究桔梗皂苷D对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的保护作用。过度依赖动物模型会增加治疗药物研发的负担。在NAFLD药物研发的早期阶段使用细胞模型更为实用且具有成本效益。

该中医模型可能有助于加深对桔梗皂苷D生物学功能的理解，并有助于研究其他中药在治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的应用。首先，在12孔板中每孔接种1毫升AML-12细胞。然后将12孔板分为四个不同的处理组，并标记为对照组、PD处理组、PA处理组以及PA加PD处理组。

向对照组和PD处理组的每个孔中加入1毫升正常细胞培养基。向PA处理组及PA加PD处理组的每个孔中加入1毫升含有300微摩尔棕榈酸的正常细胞培养基。孵育24小时后，移除细胞的培养基，然后用1毫升无血清培养基洗涤细胞两次。

接下来，向对照组加入1毫升添加了溶剂的普通细胞培养基，向PD处理组加入1毫升添加了1微摩尔 platycodin D 的普通细胞培养基。向PA处理组加入1毫升添加了300微摩尔棕榈酸的普通细胞培养基，向PA加PD处理组加入1毫升添加了300微摩尔棕榈酸和1微摩尔 platycodin D 的普通细胞培养基。处理细胞24小时后，每孔用1毫升1×PBS洗涤细胞三次。

然后每孔加入 100 微升浓度为 10 微摩尔的 DCFH-DA 对细胞进行染色。将细胞在避光条件下孵育 30 分钟。孵育结束后，用 1× PBS 洗涤细胞 3 次，每孔加入 1 毫升 1× PBS。

将12孔板置于显微镜载物台上，使用20倍物镜在200倍放大倍数下观察细胞形态。为检测线粒体膜电位，用每孔1毫升的1×PBS缓冲液将先前处理的细胞洗涤三次。随后，每孔加入100微升浓度为5微克/毫升的JC-1工作液，于37摄氏度避光孵育30分钟。

然后用1× PBS洗涤细胞三次，每孔加入一毫升1× PBS。将12孔板置于显微镜载物台上，使用20倍物镜在200倍放大倍数下观察细胞形态。裂解处理后的细胞，并将细胞裂解液收集至1.5毫升微量离心管中。

在4°C条件下，以12,000 G离心20分钟。然后按1:4的体积比，向细胞裂解物上清液中加入5X SDS-PAGE上样缓冲液。接着，将含有12个加样孔的预制12% SDS-PAGE凝胶放入电泳槽中，并用超纯水稀释1X SDS上样缓冲液至推荐液面高度。

SDS-PAGE 电泳后，将蛋白质电转至一张 0.45 微米的 PVDF 膜上。将膜置于 5 毫升用封闭缓冲液稀释的一抗溶液中孵育。使用针对 LC-III、p62 和 beta-actin 的特异性抗体。

在4°C下孵育过夜。然后将PVDF膜与兔抗小鼠LGG HRP二抗按1:10,000比例用封闭缓冲液稀释后孵育。将膜在室温下避光孵育两小时。

孵育后，将PVDF膜置于塑料膜上，加入适量ECL工作液，孵育2分钟。随后去除ECL工作液，将PVDF膜放入成像系统中进行图像采集。

DCFH-DA 染色显示，桔梗皂苷 D 能显著降低 ALM-12 细胞内 ROS 水平，表明该处理可减轻细胞氧化应激。此外，经棕榈酸处理的细胞中代表 JC-1 单体或去极化线粒体的绿色荧光强于未处理细胞，而代表 JC-1 二聚体或极化线粒体的红色荧光则弱于未处理细胞，表明棕榈酸诱导了线粒体膜电位（MMP）去极化。另外，与模型组相比，桔梗皂苷 D 治疗组中 JC-1 单体与二聚体的比值降低，表明其可改善棕榈酸诱导的 MMP 变化。

通过蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC-III和p62的蛋白表达水平。经棕榈酸处理后，LC-32与LC-31的比值显著降低，p62的蛋白表达水平升高。另一方面，桔梗皂苷D显著降低了p62的蛋白表达水平，并提高了LC-32与LC-31的比值，表明恢复了棕榈酸诱导的自噬流。

如果阴性对照组细胞的荧光值相对较高，可根据需要调整荧光探针的工作浓度。