Name: 在棕榈酸诱导的 体外 模型中研究鸭嘴豆素D对非酒精性脂肪肝疾病的保护作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 了解鸭嘴桃素D在非酒精性脂肪肝疾病中的保护作用，使用棕榈酸诱导的AML-12细胞体外模型。该方法为中药在肝病治疗中的应用提供了实用的研究工具。

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本工作得到重庆市科学技术委员会（cstc2020jxjl-jbky10002、jbky20200026、cstc2021jscx-dxwtBX0013 和 jbky20210029）以及中国博士后科学基金会（编号：2021MD703919）的资助。

AML-12 细胞（一种正常的小鼠肝细胞系）用于基于细胞的研究。这些细胞购自商业来源（见材料表）。
1. 建立非酒精性脂肪性肝病模型的AML-12细胞预处理 体外
<ol>
	<li>将细胞置于正常细胞培养基中（DMEM 与 Ham's F12 培养基按 1:1 混合，含 0.005 mg/mL 胰岛素、5 ng/mL 硒、0.005 mg/mL 转铁蛋白、40 ng/mL 地塞米松和 10% 胎牛血清 [FBS]，参见材料表），在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。</li>
	<li>以每孔 1 mL 的体积将细胞接种于 12 孔板中，接种密度为 2.8 × 105 个细胞/孔。 
	注意：所有细胞消化和换液操作均在生物安全柜中进行，以避免细胞污染。</li>
	<li>过夜培养（约 10 小时）后，吸除细胞培养基，然后每孔用 1 mL 无血清培养基洗涤细胞两次。</li>
	<li>将 12 孔细胞培养板从左至右分为四个不同的处理组，分别为：(1) 对照组，(2) PD 处理组，(3) PA 处理组，以及 (4) PA + PD 处理组。 
	注意：每个实验处理组设置三个重复，位于同一块 12 孔板上，从上至下排列。</li>
	<li>向对照组和 PD 处理组中加入正常细胞培养基（1 mL/孔），向 PA 处理组和 PA + PD 处理组中加入含 300 µM PA 的正常细胞培养基（1 mL/孔）。</li>
	<li>培养 24 小时后，吸除细胞培养基，然后每孔用 1 mL 无血清培养基洗涤细胞两次。</li>
	<li>向对照组中加入含溶剂（二甲基亚砜，DMSO，0.1% v/v）的正常细胞培养基（1 mL/孔）；向 PD 处理组中加入含 1 µM PD 的正常细胞培养基（1 mL/孔）；向 PA 处理组中加入含 300 µM PA 的正常细胞培养基（1 mL/孔）；向 PA + PD 处理组中加入含 300 µM PA 和 1 µM PD 的正常细胞培养基（1 mL/孔）。</li>
	<li>继续培养 24 小时后，通过 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色（步骤 2）、JC-1 染色（步骤 3）和蛋白质印迹法（Western blotting，步骤 4）检测 PD 对细胞的保护作用。 
	&#8203;注意：所有培养操作均在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中进行。</li>
</ol>
2. 活性氧生成变化的测定
注意：细胞内活性氧（ROS）水平的检测基于DCFH-DA染色法。
<ol>
	<li>在处理期结束时（步骤 1.8），每孔用 1 mL 磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH 7.4）洗涤细胞三次，然后每孔加入 100 µL 10 µM DCFH-DA 进行染色（参见材料表）。将细胞置于避光条件下孵育 30 分钟。 
	注意：若孵育 30 分钟后未观察到明显的绿色荧光，可适当延长探针与细胞的孵育时间（30–60 分钟）；若孵育 30 分钟后绿色荧光信号过强，则可适当缩短孵育时间（15–30 分钟）。</li>
	<li>用 1× PBS（1 mL/孔）洗涤细胞三次，每孔加入 1 mL 1× PBS。</li>
	<li>将 12 孔板置于显微镜载物台上（参见材料表），使用 20 倍物镜观察细胞形态（放大倍数：200 倍）。</li>
	<li>在荧光显微镜下，使用激发波长为 480 nm、发射波长为 530 nm 的绿色荧光通道，为每个孔拍摄三张具有代表性的荧光图像（放大倍数：200 倍）。 
	注意：推荐使用激发波长 480 nm、发射波长 530 nm 的绿色荧光通道检测 DCFH-DA。此外，也可采用荧光显微镜中用于 GFP 和 FITC 的参数设置来检测 DCFH-DA35,36。</li>
	<li>最后，使用图像采集软件处理图像（参见材料表），然后利用 ImageJ 软件计算各组的平均荧光强度或不同组之间的荧光强度比值。 
	&#8203;注意：用于成像的荧光显微镜及 ImageJ 软件的技术细节此前已有描述37,38。</li>
</ol>
3. 线粒体膜电位变化的测定
注意：线粒体膜电位的变化通过 JC-1 染色实验进行监测。
<ol>
	<li>在处理期结束时（步骤 1.8），用 1 mL 的 1× PBS 每孔洗涤细胞三次，然后每孔加入 100 µL 浓度为 5 µg/mL 的 JC-1 工作液（见材料表），在 37 °C 避光孵育 30 分钟。 
	注意：若孵育 30 分钟后未观察到明显的绿色荧光，可适当延长探针与细胞的孵育时间（30–60 分钟）；若孵育 30 分钟后绿色荧光信号过强，则可适当缩短孵育时间（15–30 分钟）。</li>
	<li>用 1× PBS（1 mL/孔）洗涤细胞三次，每孔加入 1 mL 的 1× PBS。</li>
	<li>将 12 孔板置于显微镜载物台上，使用 20 倍物镜观察细胞形态（放大倍数：200 倍）。</li>
	<li>在荧光显微镜下，对每孔采集三张具有代表性的荧光图像（放大倍数：200 倍），分别使用绿色荧光通道（激发波长 485 nm，发射波长 535 nm）和红色荧光通道（激发波长 550 nm，发射波长 600 nm）进行成像。 
	注意：绿色荧光通道（激发波长 485 nm，发射波长 535 nm）用于检测 JC-1 单体，代表线粒体去极化状态39,40,41；红色荧光通道（激发波长 550 nm，发射波长 600 nm）用于检测 JC-1 二聚体，代表线粒体极化状态39,40,41。</li>
	<li>最后，使用图像采集软件处理图像，然后利用 Image J 软件计算各组的平均荧光强度或不同组之间的荧光强度比值。 
	&#8203;注意：用于成像的荧光显微镜及 Image J 软件的技术细节此前已有描述37,38。</li>
</ol>
4. LC3-II/LC3-I 和 p62/SQSTM1 蛋白表达水平的测定
<ol>
	<li>处理后（步骤 1.8），用预冷至 4 °C 的 1x PBS 洗涤细胞三次（1 mL/孔）。</li>
	<li>向 12 孔板中加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（1x）的 RIPA 裂解缓冲液（100 µL/孔）（参见材料表），冰上裂解 5 分钟。</li>
	<li>将细胞裂解液收集至 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 20 分钟。采用 BCA 法按照标准操作程序测定上清液中的蛋白浓度42。</li>
	<li>向细胞裂解液上清中加入 SDS-PAGE 样品上样缓冲液（5x，参见材料表）（体积比 = 1:4）。</li>
	<li>涡旋混匀（高速约 15 秒），然后将混合样品在 100 °C 加热 5 分钟以使蛋白变性。</li>
	<li>将已制备好的 12 孔 12% SDS-PAGE 凝胶放入电泳槽中，然后加入用超纯水稀释的 SDS 上样缓冲液（1x）至液面达到限高位置。 
	注：SDS-PAGE 凝胶根据制造商说明书使用商用试剂盒制备（参见材料表）。</li>
	<li>将蛋白 Marker（5 µL/孔）和样品（20 µg/孔）分别加入 SDS-PAGE 凝胶的不同加样孔中。</li>
	<li>设定恒定电压为 100 V，电泳运行 80 分钟。</li>
	<li>SDS-PAGE 电泳结束后，参照已发表文献43,44，将蛋白电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（0.45 µm，参见材料表）。</li>
	<li>蛋白电转完成后，在室温下于摇床上用 10 mL TBST（1x TBS，0.1% Tween 20）洗涤 PVDF 膜两次（每次 5 分钟）。</li>
	<li>在室温下于摇床上用 5 mL 牛血清白蛋白（BSA，5%）封闭 PVDF 膜 1 小时。</li>
	<li>用 10 mL TBST 在室温下洗涤 PVDF 膜三次（每次 10 分钟）。然后将 PVDF 膜与用封闭缓冲液稀释的特异性一抗在 4 °C 孵育过夜：LC3（小鼠单克隆抗体，1:2,000）、p62/SQSTM1（后文简称 p62，小鼠单克隆抗体，1:2,000）和 β-actin（小鼠单克隆抗体，1:2,000）（参见材料表）。</li>
	<li>在室温下用 10 mL TBST 洗涤 PVDF 膜三次（每次 10 分钟）。然后在避光条件下，于室温下用封闭缓冲液稀释的兔抗小鼠 IgG（HRP）二抗（1:10,000）（参见材料表）孵育 PVDF 膜 2 小时。</li>
	<li>在室温下用 10 mL TBST 洗涤 PVDF 膜三次（每次 10 分钟）。然后将 PVDF 膜置于塑料膜上，加入适量 ECL 显色工作液（200 µL/膜）（参见材料表），孵育 2 分钟。</li>
	<li>孵育后，去除 ECL 显色工作液，将 PVDF 膜放入成像系统进行图像采集。最后使用 Image J 软件分析各条带的灰度值。 
	&#8203;注：Western blot 实验技术细节及用于成像分析的 Image J 软件操作已在先前文献中详细描述45,46。</li>
</ol>
5. 统计学分析
<ol>
	<li>以均值 ± 标准差（SD）表示实验数据。</li>
	<li>使用先前所述的统计软件工具进行显著性分析47.</li>
	<li>使用统计学方法计算两组之间的差异 t-测试。A P- 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性：*P &#60; 0.05, **P &#60; 0.01, ***P &#60; 0.005.</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

研究表明，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种临床病理综合征，其疾病谱从单纯性脂肪肝延伸至非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并可进一步发展为肝硬化和肝癌51高脂饮食和久坐不动的生活方式是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的常见风险因素。目前已有针对NAFLD治疗的非药物疗法和药物疗法的相关研究。51,52,53然而，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制尚未完全阐明。本文所述方法涉及一种 体外 通过棕榈酸（PA）刺激AML-12细胞建立的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型。我们在该模型中研究了PD对NAFLD的保护作用，发现PD可减轻PA诱导的活性氧（ROS）水平升高。此外，PD还能改善PA引起的线粒体膜电位（MMP）去极化。进一步研究表明，PD可显著降低p62蛋白表达水平，并提高LC3-II/LC3-I比值。这些实验结果为将PD作为治疗NAFLD的活性药物成分的应用提供了依据。</...

桔梗 （PG），即干燥的根 桔梗 （Jacq.）A.DC. 在中国传统医学（TCM）中有所应用，主要产于中国东北、华北、华东、华中及西南地区。1PG组分包括三萜皂苷、多糖、黄酮类、多酚、聚乙二醇、挥发油和矿物质2PG 在亚洲有着长期作为食品和草药使用的歷史。传统上，这种草药被用于治疗肺部疾病。现代药理学研究也证实了 PG 对其他疾病的治疗功效。研究表明，PG 对多种药物诱导的肝损伤模型具有治疗作用。膳食补充 PG 或桔梗皂苷提取物可改善高脂饮食诱导的肥胖及其相关代谢性疾病3,4,5. PG来源的多糖可用于治疗小鼠LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤6此外，PG根部来源的皂苷可改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）7此外，桔梗皂苷D（PD）是PG中最重要的一种治疗成分，可增强人肝细胞癌（HepG2）细胞中低密度脂蛋白受体的表达以及低密度脂蛋白的摄取8此外，PD 还可诱导 HepG2 细胞凋亡，并抑制其黏附、迁移和侵袭能力。9,10因此，在本研究中，采用小鼠肝癌AML-12细胞进行实验 体外 模型构建，并进一步研究PD在该模型中的药理作用及其潜在机制。
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）这一术语指的是一组包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝细胞癌在内的肝脏疾病11。尽管NAFLD的发病机制尚未完全阐明，但从经典的&#34;二次打击&#34;理论到目前的&#34;多重打击&#34;理论，胰岛素抵抗均被认为是NAFLD发病机制的核心环节12,13,14。研究表明，肝细胞中的胰岛素抵抗可导致游离脂肪酸增加，进而形成甘油三酯并在肝脏中沉积，使肝脏发生脂肪变性15,16。脂肪的积聚可引起脂毒性、氧化应激诱导的线粒体功能障碍、内质网应激以及炎症性细胞因子的释放，从而导致NAFLD的发生与发展17,18。此外，自噬也在NAFLD的发病机制中发挥作用，因其参与调控细胞胰岛素敏感性、细胞脂质代谢、肝细胞损伤及固有免疫反应19,20,21。
已建立多种动物模型和细胞模型，为探索非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制及潜在治疗靶点提供了基础22,23然而，单一动物模型无法完全模拟非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的全部病理过程24动物个体间的差异导致不同的病理特征。使用肝细胞系或原代肝细胞在 体外 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的研究可确保实验条件的最大一致性。肝脏脂质代谢紊乱可导致NAFLD中肝细胞脂滴积累水平升高。25游离脂肪酸（如油酸和棕榈油）已被用于 体外 模拟高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病模型26,27人肝母细胞瘤细胞系HepG2常用于构建非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型 体外但是，作为一种肿瘤细胞系，HepG2 细胞的代谢与正常生理条件下肝细胞的代谢存在显著差异28因此，使用原代肝细胞或小鼠原代肝细胞来构建 体外 用于药物筛选的NAFLD模型比使用肿瘤细胞系更具优势。在动物模型和细胞模型中，对药物效应与治疗靶点进行协同性考察的比较 体外 肝细胞模型时，使用小鼠肝细胞构建似乎是一种可行的方法 体外 非酒精性脂肪性肝病模型具有更好的应用潜力。
进入肝脏的游离脂肪酸可被氧化以产生能量，或以甘油三酯形式储存。值得注意的是，游离脂肪酸具有一定的脂毒性，可能诱导细胞功能障碍和细胞凋亡12棕榈酸（PA）是人血浆中最丰富的饱和脂肪酸29当非脂肪组织中的细胞长期暴露于高浓度棕榈酸（PA）时，会刺激活性氧（ROS）的产生，导致氧化应激、脂质蓄积，甚至细胞凋亡。30因此，许多研究人员使用棕榈酸（PA）作为诱导剂，刺激肝细胞产生活性氧（ROS），从而构建模型 体外 脂肪肝疾病模型及评估某些活性物质对细胞的保护作用31,32,33,34本研究介绍了一种用于探究PD对棕榈酸（PA）诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型保护作用的实验方案。

<table><tbody><tr><td>5% BSA封闭缓冲液</td><td>Solarbio，北京，中国</td><td>SW3015</td><td></td></tr><tr><td>AML12（alpha mouse liver 12）细胞系</td><td>普罗赛生命科学&amp;安普科技有限公司，中国</td><td>AML12</td><td></td></tr><tr><td>Beyo ECL&amp;nbsp;加</td><td>中国上海碧云天生物技术有限公司</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Esco Micro Pte Ltd，新加坡</td><td>AC2-5S1 A2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>奥林巴斯，日本东京</td><td>1.8</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Esco Micro Pte Ltd，新加坡</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>中国上海碧云天生物技术有限公司</td><td>ST125</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Solarbio，北京，中国</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyclone&amp;nbsp;洛根,&amp;nbsp;中国台湾&amp;nbsp;美国</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone，新西兰陶朗加</td><td>SH30406.05</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad 软件</td><td>GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>8.0</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>ABclonal，中国武汉</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>疏水性PVDF转印膜</td><td>默克，德国达姆施塔特</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素、转铁蛋白、硒溶液，100&amp;times;</td><td>中国上海碧云天生物技术有限公司</td><td>C0341</td><td></td></tr><tr><td>MAP LC3&amp;beta; 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology（上海）有限公司</td><td>SC-376404</td><td></td></tr><tr><td>JC-1线粒体膜电位检测试剂盒</td><td>Solarbio，北京，中国</td><td>M8650</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯倒置显微镜 IX53</td><td>奥林巴斯，日本东京</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>棕榈酸</td><td>德国 Sigma</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩）</td><td>Hyclone&amp;nbsp;洛根,&amp;nbsp;犹他州&amp;nbsp;美国</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰基&amp;nbsp;氟化物</td><td>中国上海碧云天生物技术有限公司</td><td>ST506</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Hyclone&amp;nbsp;洛根,&amp;nbsp;犹他州&amp;nbsp;美国</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>桔梗皂苷D</td><td>成都微斯生物科技有限公司，中国</td><td>CSA：58479-68-8</td><td></td></tr><tr><td>通用蛋白酶抑制剂混合物，100倍浓缩液</td><td>中国上海碧云天生物技术有限公司</td><td>P1005</td><td></td></tr><tr><td>蛋白分子量标准</td><td>Solarbio，北京，中国</td><td>PR1910</td><td></td></tr><tr><td>活性氧检测试剂盒</td><td>Solarbio，北京，中国</td><td>CA1410</td><td></td></tr><tr><td>RIPA&amp;nbsp;裂解&amp;nbsp;缓冲液</td><td>中国上海碧云天生物技术有限公司</td><td>P0013E</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒</td><td>中国上海碧云天生物技术有限公司</td><td>P0012AC</td><td></td></tr><tr><td>5× SDS-PAGE样品上样缓冲液</td><td>中国上海碧云天生物技术有限公司</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 离心机</td><td>德国 Sigma</td><td>3K15</td><td></td></tr><tr><td>SQSTM1/p62 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology（上海）有限公司</td><td>SC-28359</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Tecan Austria GmbH，奥地利</td><td>1510002987</td><td></td></tr><tr><td>WB 转膜缓冲液，10x</td><td>Solarbio，北京，中国</td><td>D1060</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白小鼠单克隆抗体</td><td>ABclonal，中国武汉</td><td>AC004</td><td></td></tr></tbody></table>

探究桔梗皂苷d在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型

Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在全球范围内的发病率正以惊人的速度上升。 Platycodon grandiflorum 被广泛用作治疗多种疾病的传统民族药物，是一种可融入日常饮食的典型功能性食品。研究表明，桔梗皂苷D（PD）是其中主要活性成分之一 桔梗，具有高生物利用度，可显著缓解非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的进展，但其潜在机制尚不明确。本研究旨在探讨原花青素（PD）对非酒精性脂肪性肝病的治疗作用 体外AML-12细胞用300 µM棕榈酸（PA）预处理24小时以建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型 体外随后，细胞经PD处理或不进行PD处理，持续24小时。采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色法检测活性氧（ROS）水平，通过JC-1染色法测定线粒体膜电位。此外，通过蛋白质印迹法分析细胞裂解液中LC3-II/LC3-I和p62/SQSTM1的蛋白表达水平。结果显示，在棕榈酸（PA）处理组中，与对照组相比，PD显著降低了ROS水平和线粒体膜电位。同时，PD在PA处理组中提高了LC3-II/LC3-I水平，并降低了p62/SQSTM1水平。结果表明，PD可改善非酒精性脂肪性肝病（NAFLD） 体外 通过降低氧化应激并促进自噬。这 体外 模型是研究PD在NAFLD中作用的有用工具。

细胞内活性氧水平 
AML-12 细胞用 300 µM 棕榈酸（PA）诱导 24 小时，建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型。随后，细胞经 PD 处理 24 小时。采用 DCFH-DA 荧光探针标记细胞，并在荧光显微镜下观察活性氧（ROS）的生成。细胞内 ROS 的 DCFH-DA 染色结果如 图 1 所示。结果显示，与仅用 300 µM PA 孵育的细胞相比，PD 能显著降低细胞内 ROS 水平（P &lt; 0.01），表明 PD 可减轻细胞氧化应激。
细胞线粒体膜电位 
线粒体是由内源性凋亡通路调控的核心细胞器48,49,50。因此，在经JC-1染色后，通过荧光显微镜观察经PD处理24 h的AML-12细胞的线粒体膜电位（MMP...

该方案研究了 platycodin D 在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型

探究桔梗皂苷D在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在全球范围内的发病率正以惊人的速度上升。桔梗（Platycodon grandiflorum）被广泛用作……

该方法展示了AML-12细胞的应用，可用于构建模型并研究桔梗皂苷D对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的保护作用。过度依赖动物模型会增加治疗药物研发的负担。在NAFLD药物研发的早期阶段使用细胞模型更为实用且具有成本效益。该中医模型可能有助于加深对桔梗皂苷D生物学功能的理解，并有助于研究其他中药在治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的应用。首先，在12孔板中每孔接种1毫升AML-12细胞。然后将12孔板分为四个不同的处理组，并标记为对照组、PD处理组、PA处理组以及PA加PD处理组。向对照组和PD处理组的每个孔中加入1毫升正常细胞培养基。向PA处理组及PA加PD处理组的每个孔中加入1毫升含有300微摩尔棕榈酸的正常细胞培养基。孵育24小时后，移除细胞的培养基，然后用1毫升无血清培养基洗涤细胞两次。接下来，向对照组加入1毫升添加了溶剂的普通细胞培养基，向PD处理组加入1毫升添加了1微摩尔 platycodin D 的普通细胞培养基。向PA处理组加入1毫升添加了300微摩尔棕榈酸的普通细胞培养基，向PA加PD处理组加入1毫升添加了300微摩尔棕榈酸和1微摩尔 platycodin D 的普通细胞培养基。处理细胞24小时后，每孔用1毫升1×PBS洗涤细胞三次。然后每孔加入 100 微升浓度为 10 微摩尔的 DCFH-DA 对细胞进行染色。将细胞在避光条件下孵育 30 分钟。孵育结束后，用 1× PBS 洗涤细胞 3 次，每孔加入 1 毫升 1× PBS。将12孔板置于显微镜载物台上，使用20倍物镜在200倍放大倍数下观察细胞形态。为检测线粒体膜电位，用每孔1毫升的1×PBS缓冲液将先前处理的细胞洗涤三次。随后，每孔加入100微升浓度为5微克/毫升的JC-1工作液，于37摄氏度避光孵育30分钟。然后用1× PBS洗涤细胞三次，每孔加入一毫升1× PBS。将12孔板置于显微镜载物台上，使用20倍物镜在200倍放大倍数下观察细胞形态。裂解处理后的细胞，并将细胞裂解液收集至1.5毫升微量离心管中。在4°C条件下，以12,000 G离心20分钟。然后按1:4的体积比，向细胞裂解物上清液中加入5X SDS-PAGE上样缓冲液。接着，将含有12个加样孔的预制12% SDS-PAGE凝胶放入电泳槽中，并用超纯水稀释1X SDS上样缓冲液至推荐液面高度。SDS-PAGE 电泳后，将蛋白质电转至一张 0.45 微米的 PVDF 膜上。将膜置于 5 毫升用封闭缓冲液稀释的一抗溶液中孵育。使用针对 LC-III、p62 和 beta-actin 的特异性抗体。在4°C下孵育过夜。然后将PVDF膜与兔抗小鼠LGG HRP二抗按1:10,000比例用封闭缓冲液稀释后孵育。将膜在室温下避光孵育两小时。孵育后，将PVDF膜置于塑料膜上，加入适量ECL工作液，孵育2分钟。随后去除ECL工作液，将PVDF膜放入成像系统中进行图像采集。DCFH-DA 染色显示，桔梗皂苷 D 能显著降低 ALM-12 细胞内 ROS 水平，表明该处理可减轻细胞氧化应激。此外，经棕榈酸处理的细胞中代表 JC-1 单体或去极化线粒体的绿色荧光强于未处理细胞，而代表 JC-1 二聚体或极化线粒体的红色荧光则弱于未处理细胞，表明棕榈酸诱导了线粒体膜电位（MMP）去极化。另外，与模型组相比，桔梗皂苷 D 治疗组中 JC-1 单体与二聚体的比值降低，表明其可改善棕榈酸诱导的 MMP 变化。通过蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC-III和p62的蛋白表达水平。经棕榈酸处理后，LC-32与LC-31的比值显著降低，p62的蛋白表达水平升高。另一方面，桔梗皂苷D显著降低了p62的蛋白表达水平，并提高了LC-32与LC-31的比值，表明恢复了棕榈酸诱导的自噬流。 如果阴性对照组细胞的荧光值相对较高，可根据需要调整荧光探针的工作浓度。

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Medicine

医学

在棕榈酸诱导的 体外 模型中研究鸭嘴豆素D对非酒精性脂肪肝疾病的保护作用

从头脂肪生成和β-脂肪酸氧化是肝细胞中的关键代谢途径，这些途径在多种代谢性疾病（包括脂肪肝病）中发生紊乱。本文中，我们演示了小鼠原代肝细胞的分离，并描述了β-脂肪酸氧化和脂肪生成的定量方法。...

小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

此处优化了生成方法 体内 和 体外 描述了肝脂肪变性模型的建立方法，以及对脂肪变性表型和相关生理参数的分析。...

优化分析 体内 和 体外 肝脂肪变性

本研究中，我们描述了一种使用脂肪酸盐油酸钠在分化型HepaRG细胞中诱导肝泡性脂肪变性的详细方案，并介绍了脂质积聚的检测与定量方法，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像、细胞荧光分析、油红O染色以及定量PCR。...

在分化型HepaRG细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

本方案旨在作为研究肝细胞因脂质过度暴露而引发的脂肪变性，以及相关的分子、生化和细胞变化的工具 体外.

一种实验性脂肪变性的模型 体外肝细胞在脂质超载条件培养基中的培养

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用14C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary...

新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

本实验方案描述了一种整合策略，旨在基于网络药理学预测和代谢组学验证，探索余甘子对抗高脂血症的关键靶点和作用机制。...

基于网络药理学预测与代谢组学验证的叶下珠子治疗高脂血症作用机制研究

本实验方案描述了如何使用油红O染色脂滴（LDs），在脂肪酸诱导的脂肪变性肝细胞模型中计算脂滴的大小和数量，并利用BODIPY...

牛肝细胞中脂滴大小与融合的评估

本文描述了使用油酸诱导的HepG2细胞作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病的模型。...

代谢功能障碍相关脂肪性肝病中脂肪沉积的体外建模

我们建立了一种脑切片模型，可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤所涉及的分子机制。 该技术可获得具有活性的成熟脑组织，在部分保留神经元回路、细胞间相互作用及突触后区室的同时，减少了实验所需的动物数量。...

脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

本方法旨在通过颈动脉持续输送药物溶液，以评估新药在小鼠模型中的药代动力学。...

小鼠中紫杉烷类药物药代动力学与药效学分析的颈动脉灌注

了解鸭嘴桃素D在非酒精性脂肪肝疾病中的保护作用，使用棕榈酸诱导的AML-12细胞体外模型。该方法为中药在肝病治疗中的应用提供了实用的研究工具。

探究桔梗皂苷D在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用体外模型

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探究桔梗皂苷D在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型

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