利用二甲基硫酸盐突变谱结合测序技术探究RNA结构 体外 以及在细胞中

DMS-MaP 是一种基于测序的方法，可让我们获取 RNA 结构的快照，并了解其在不同条件下的变化情况。与传统的结构测定方法（如晶体学和电子显微镜技术）相比，DMS-MaP 可在细胞内使用，并能解析 RNA 结构集合体。由于 RNA 结构在多种生物学现象中具有重要意义，我们的方法几乎可为所有生物学研究领域提供机制层面的深入见解。

每个终体积为 100 微升的反应，先将 89 微升复性缓冲液转移至指定的 1.5 毫升离心管中。将离心管置于化学通风橱下的恒温振荡器中，在 37 摄氏度预热。向一个 PCR 管中加入 10 微升无核酸酶水，并将 1 至 10 皮摩尔的 RNA 转移至其中。

将样品置于PCR仪中，在95摄氏度下孵育1分钟，以使RNA变性。随后立即将离心管放置在冰块上，防止RNA错误折叠。接下来，为了使RNA重新折叠，将样品加入指定的含有37摄氏度重折叠缓冲液的离心管中，充分混匀后，在37摄氏度下孵育10至20分钟。

接下来，向含有RNA样品的离心管中加入1 µL浓度为10.5 M的100%二甲基硫酸盐（DMS），并将反应混合物在800至1,400 rpm的振荡条件下孵育5分钟。反应5分钟后，加入60 µL 100% β-巯基乙醇终止反应，充分混匀，涡旋振荡后立即将RNA置于冰上。随后纯化RNA，并用10 µL无核酸酶的水洗脱。

使用分光光度计定量RNA。最后，将修饰后的RNA储存在-80摄氏度。将反应混合物加入PCR管后，将10微升无核酸酶水中至少100纳克的洗脱修饰RNA转移至PCR管中。

将混合物置于热循环仪中，在 57 摄氏度下孵育 30 分钟至 1.5 小时。30 分钟足以生成含有 500 个核苷酸的产物。接着，向其中加入 1 µL 4 M 氢氧化钠，用移液器充分混匀，并在 95 摄氏度下孵育 3 分钟，以降解 RNA 并使 TGIRT 从互补 DNA 上释放。

采用基于层析柱的方法去除引物，纯化互补DNA，并通过PCR进行扩增。在进行文库构建之前，取2 µL PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，以验证PCR扩增是否成功。

然后使用分光光度计对提取的片段进行定量，再对片段进行索引以用于测序。将培养至所需感染阶段的病毒感染细胞转移至具备相应生物安全级别的专用通风橱中。向含有细胞的培养基中加入2.5%体积的DMS，并用封口膜密封容器。

立即将容器在37摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，小心地用移液器吸出含DMS的培养基，并弃入适当的化学废弃物容器中。然后轻轻向细胞中加入10毫升终止缓冲液，刮下细胞，并将其转移至15毫升锥形管中。

将离心管在 3,000 g 条件下离心 3 分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，并用 10 毫升 PBS 将细胞沉淀洗涤两次。每次洗涤后，尽可能彻底地移除残留的 PBS。

将沉淀溶解于适量的RNA提取试剂中，以进行RNA提取。接着，向含有1毫升匀浆细胞的RNA提取试剂中加入200微升氯仿，涡旋振荡15至20秒，直至细胞溶液变为亮粉色。等待分相完成，此时可见粉红色的脂质相沉于底部。

在4°C条件下，以约20,000 g的转速离心15分钟，然后将上层水相转移至新离心管中。纯化RNA，并用足量无核酸酶的水洗脱。随后采用选定的方法进行核糖体RNA去除，再用适量无核酸酶的水洗脱RNA，并使用分光光度计对其进行定量。

纯化的RNA可再次用于RT-PCR。利用上述网络服务器，可方便地分析DMS-MaP数据。将测序读段比对至参考序列，并统计每个碱基位点的突变数。

所得的群体平均文件可用作已知RNA结构预测软件中的约束条件。所得的最小自由能结构可使用VARNA等软件进行可视化。目前，只有DREAM的稳定版本能够解析RNA结构集合。

然而，目前正在进行相关工作，以使该功能对整个科研群体更加易于使用。通过在gBlock片段上连接T7聚合酶启动子进行体外转录，获得目标RNA，在1%琼脂糖凝胶上显示为一条约300个核苷酸的单一条带。对经DMS修饰的RNA进行基因特异性RT-PCR，成功的结果表现为在2%琼脂糖凝胶上出现一条约300个碱基对的单一条带。

如预期所示，带索引的片段位置高出约150个碱基对。在病毒感染后第四天出现细胞病变效应的HCT-8细胞上进行了DMS处理。提取的总RNA在琼脂糖凝胶上显示为两条明亮条带，分别对应40S和60S亚基。

核糖体RNA耗尽后，两条明亮的条带消失，相应泳道中仅留下弥散条带。文库构建后，各样本的片段大小分布各异，均呈现为弥散条带。切取200至500个核苷酸之间的条带，并将接头二聚体分离去除。

新冠病毒基因组的结构模型显示，处于开放构象的碱基比参与碱基配对的碱基具有更高的反应活性。碱基的反应活性图谱表明，尿嘧啶和鸟嘌呤的反应活性值较低，且未被DMS修饰。通过我们的方法，能够以高通量的方式在细胞内预测RNA结构，且不受片段大小限制。

对照指标非常重要，因为它们能够提供有关结构预测准确性的信息。为了进一步验证预测的准确性，应开展更多干扰或改变结构的实验。