体内 完整背根神经节中初级感觉神经元网络中神经元集合体的钙成像
February 10th, 2023
该协议描述了背根神经节（DRG）的手术暴露，然后是GCaMP3（基因编码的Ca2+ 指示剂;绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）使用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行Ca2+ 成像，同时对同侧后爪施加各种刺激。
使用这种方法监测的神经元数量允许收集神经元网络数据，这是使用旧方法或其他方法无法实现的。该技术的主要优点是能够同时监测近2， 000个初级感觉神经元，直接响应施加在后爪上的刺激。该程序特别适合研究外周异常性疼痛和疼痛超敏反应的治疗干预措施。
该方法可以适用于研究三叉神经节或膝神经节，或与电压或细胞信号分子的基因编码传感器一起使用，例如环状AMP。进行这种手术需要练习。您最多可以在一只动物的六个背根神经节上练习。
演示该程序将由我自己，由John Shannonhouse和Ruben Gomez先生协助。首先，将鼠标放在加热垫上，将体温保持在 37 摄氏度。通过感受小鼠的盆骨来定位腰椎增大。
然后，在腰椎增大区域上方剃掉鼠标的背部。用剪刀在腰椎增大上方做一个三边矩形切口，用镊子将皮肤折叠起来。使用13毫米弹簧解剖剪刀在脊柱右侧做三到四毫米的切口。
用剪刀将皮肤和肌肉剪回两侧，露出脊柱。然后，用八毫米剪刀剪掉肌肉和结缔组织，清洁右侧L5 DRG的横向过程。尽量使用棉花或凝胶泡沫吸收血液，尽量减少出血。
使用弗里德曼-皮尔逊镊子或强力细钳切开右侧 L5 横向过程，注意不要接触 DRG。接下来，将鼠标和加热垫移动到自定义载物台上。使用载物台胶带将动物和加热垫固定到位。
将动物的鼻子放在鼻锥中以进行连续异氟醚麻醉。将右后爪伸出到舞台外的位置固定，以便于施加刺激。将脊柱固定到位，将载物台夹在椎骨或骨盆骨的咀嚼和尾部至L5 DRG的皮肤上。
调整夹具和载物台，使DRG的表面尽可能水平。然后，将载物台放在显微镜下方，使物镜在降低时直接高于DRG八毫米。插入直肠温度计。
将电源线连接到加热垫和直肠温度计。将鼻锥连接到异氟醚气体管路。使用带有10x 0.4 DIC物镜的正置共聚焦显微镜和相关软件进行成像。
使用绿色 FITC 滤光片设置，激发波长为 495 纳米，发射波长为 519 纳米，检测波长在 500 至 580 纳米之间。在显微镜下，找到DRG的表面。调整载物台上的夹具，使DRG表面尽可能水平，并在焦平面中可视化最大表面积。
在整个过程中监测动物，以维持异氟醚麻醉而不会过量服用。要加载显微镜快速扫描协议，请使用体素大小 2.496 x 2.496 x 16 微米、512 x 512 像素、10 光学切片 Z 堆栈、一个 32 微米的 Airy 单元、1% 激光功率为 488 纳米和 5 毫瓦、像素时间 1.52 微秒、行时间 0.91 毫秒、帧时间 465 毫秒、LSM 扫描速度为 8、 双向扫描，PMT探测器增益650伏，数字增益1。通过单击"采集"选项卡下的"开始实验"，对DRG进行简短的八周期扫描。
通过在一段时间内以每帧扫描一次扫描进行正交投影来创建影片。手动检查图像清晰度和成像伪影，例如穿过 DRG 的亮度波。调整夹紧位置和光学切片厚度，然后重复此步骤，直到获得清晰、高质量的电影。
然后，使用体素大小 1.248 x 1.248 x 14 微米、1024 x 1024 像素、六个光学切片 Z 堆栈、1.2 艾里单位或 39 微米、5% 激光功率为 488 纳米和 25 毫瓦、像素时间 2.06 微秒、行时间 4.95 毫秒、帧时间 5.06 秒、LSM 扫描速度为 6、 双向扫描，PMT 探测器增益为 650 伏，数字增益为 1。单击"采集"选项卡下的"开始实验"按钮，制作 DRG 的高分辨率图像。加载显微镜快速扫描方案，并在DRG中记录80个周期的自发活动。
生成正交投影影片，并验证图像是否具有足够的质量进行分析。要施加刺激，请将显微镜设置为执行15至20次扫描。等待扫描一到五完成以生成基线。
在扫描6至10期间应用刺激。每次刺激后至少等待五分钟，然后再应用下一次刺激以防止脱敏。对于机械压力机，用爪子夹住测藻力计的夹子，不要接触爪子。
在扫描 5 结束后立即开始捏住爪子，并在扫描 10 后立即停止。用测藻力计监测压力，并确保其不超过所需力的10 g。对于热刺激，将烧杯水加热到略高于所需温度。
当水处于正确的温度时，将爪子浸入水中，在扫描五后立即施加刺激。扫描 10 后立即拉开烧杯。手术L5 DRG暴露，然后进行共聚焦显微镜检查，允许使用Pirt-GCaMP3小鼠一次对多达1， 800个神经元进行成像。
在没有刺激的情况下，在没有刺激的情况下，在正常生理环境中对刺激做出反应的情况下，在群体水平上观察到自发钙瞬变的集合中观察到初级感觉神经元。强烈的刺激或有害的热量会增加钙的反应。与用 100 g 按压相比，用 300 g 按压增加了产生钙瞬变的神经元数量和曲线下 delta F 乘 F0 面积。
在21摄氏度和45摄氏度的非有害温度范围内，暖热增加了产生钙瞬变的神经元数量和曲线下F0面积的delta F。与57摄氏度的有害热刺激相比，非有害温度激活了较少数量的神经元产生瞬态。此外，较小和中等直径的神经元在所有刺激下自发地产生钙瞬时，但大直径神经元仅在300g压力刺激下产生钙瞬变。
DRG应该是水平的和最佳的光学切片厚度。它应该是这样，您可以检测到最大数量的单元格，并且电影中没有波纹。该技术已被用于在人群水平上分析躯体感觉和味觉的感觉模式，并研究成对或同步激活的相邻神经元，从而导致慢性和神经性疼痛。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本协议描述了一种外科技术，用于在Pirt-GCaMP3小鼠中暴露背根神经节（DRG），以进行GCaMP3（基因编码的钙指示剂）成像。该研究调查了初级感觉神经元对同侧后爪施加的各种刺激的神经反应，为与疼痛和异痛症相关的钙瞬变提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经影像学
- 疼痛生理学
背景
- 背根神经节容纳了参与疼痛感觉的初级感觉神经元。
- GCaMP3成像允许实时监测神经元中的钙动力学。
- 这种方法可以阐明疼痛超敏反应的潜在机制。
- 较旧的方法不太适合广泛的神经网络分析。
研究目的
- 展示一种全面的方法，用于可视化感觉神经元中的钙瞬变。
- 评估神经元对伤害性刺激的集体反应。
- 适应方法以应用于三叉神经或其他神经节研究。
使用的方法
- 在Pirt-GCaMP3小鼠上进行了腰部L5 DRG的外科暴露。
- 使用直立共聚焦显微镜进行了钙成像。
- 对后爪施加了多种刺激，包括机械和热刺激。
- 使用特定的成像协议捕获自发和刺激引起的钙活动。
主要结果
- 成像技术能够同时实时观察多达1,800个初级感觉神经元。
- 在强烈刺激或热暴露期间，钙反应显著增加。
- 观察到在没有外部刺激的情况下也有钙瞬变，表明存在基线活动水平。
- 建立了一个创建高质量成像的系统过程，提高了数据可靠性。
结论
- 本协议为研究感觉神经元对疼痛刺激的动力学提供了一个强大的框架。
- 研究结果增强了我们对与疼痛超敏反应相关的神经元机制的理解。
- 潜在应用包括评估治疗干预措施，如异痛症等疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput in vivo calcium imaging of dorsal root ganglia (DRG) enables direct, quantitative assessment of neuronal ensemble activity in response to defined sensory stimuli. This approach provides unprecedented resolution for mapping pain and somatosensory pathways, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The ability to monitor thousands of neurons simultaneously accelerates translational research and informs portfolio decisions for pain and sensory disorder programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of sensory neuron network responses to pain and touch stimuli at the populational level.
- Supports functional validation of candidate targets by linking genetic markers to specific neuronal subtypes and activity patterns.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing modality-specific and fiber-type-specific activation profiles.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven target triage in pain and sensory disorder pipelines.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated, reproducible platform for measuring stimulus-evoked calcium transients across large neuronal ensembles.
- Enables standardization of assay conditions for cross-study and cross-compound comparisons.
- Delivers robust, quantitative readouts (e.g., number of responsive neurons, amplitude of transients) suitable for screening candidate modulators.
- Supports scalability and platform reuse for diverse sensory modalities and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant sensory pathways implicated in chronic pain and allodynia.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by linking ensemble activity to behavioral phenotypes.
- Provides translational biomarkers (e.g., fiber-type activation, ensemble synchrony) for candidate evaluation.
- Reduces biological risk by enabling predictive assessment of intervention effects on neuronal networks.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform bridges early discovery, target validation, and preclinical research by providing a unified readout of neuronal network activity in response to defined stimuli.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping stimulus-evoked activity across genetically defined neuron populations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic perturbation assessment.
- Analytics: Enables statistical comparison of neuronal activation patterns, amplitude, and fiber-type specificity across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical models with human sensory biology through ensemble-level readouts.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, adaptable platform for ongoing pain, itch, and sensory disorder research across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sensory pathway research.
- Operational Value: Standardizes data collection and analysis for high-throughput, reproducible studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritization of targets or interventions based on robust network-level data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and cross-program knowledge transfer for pain and sensory disorder assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surgical exposure of DRG and advanced confocal imaging techniques.
- Demands access to upright confocal microscopy and genetically encoded calcium indicators (e.g., Pirt-GCaMP3 mice).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging protocols and stimulus application.
- Adaptable to other ganglia or genetically encoded sensors with protocol optimization.
- Precision and practice are critical to minimize artifacts and ensure high-quality, interpretable data.
