体内 完整背根神经节中初级感觉神经元网络中神经元集合体的钙成像

该协议描述了背根神经节（DRG）的手术暴露，然后是GCaMP3（基因编码的Ca²⁺ 指示剂;绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）使用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行Ca²⁺ 成像，同时对同侧后爪施加各种刺激。

使用这种方法监测的神经元数量允许收集神经元网络数据，这是使用旧方法或其他方法无法实现的。该技术的主要优点是能够同时监测近2， 000个初级感觉神经元，直接响应施加在后爪上的刺激。该程序特别适合研究外周异常性疼痛和疼痛超敏反应的治疗干预措施。

该方法可以适用于研究三叉神经节或膝神经节，或与电压或细胞信号分子的基因编码传感器一起使用，例如环状AMP。进行这种手术需要练习。您最多可以在一只动物的六个背根神经节上练习。

演示该程序将由我自己，由John Shannonhouse和Ruben Gomez先生协助。首先，将鼠标放在加热垫上，将体温保持在 37 摄氏度。通过感受小鼠的盆骨来定位腰椎增大。

然后，在腰椎增大区域上方剃掉鼠标的背部。用剪刀在腰椎增大上方做一个三边矩形切口，用镊子将皮肤折叠起来。使用13毫米弹簧解剖剪刀在脊柱右侧做三到四毫米的切口。

用剪刀将皮肤和肌肉剪回两侧，露出脊柱。然后，用八毫米剪刀剪掉肌肉和结缔组织，清洁右侧L5 DRG的横向过程。尽量使用棉花或凝胶泡沫吸收血液，尽量减少出血。

使用弗里德曼-皮尔逊镊子或强力细钳切开右侧 L5 横向过程，注意不要接触 DRG。接下来，将鼠标和加热垫移动到自定义载物台上。使用载物台胶带将动物和加热垫固定到位。

将动物的鼻子放在鼻锥中以进行连续异氟醚麻醉。将右后爪伸出到舞台外的位置固定，以便于施加刺激。将脊柱固定到位，将载物台夹在椎骨或骨盆骨的咀嚼和尾部至L5 DRG的皮肤上。

调整夹具和载物台，使DRG的表面尽可能水平。然后，将载物台放在显微镜下方，使物镜在降低时直接高于DRG八毫米。插入直肠温度计。

将电源线连接到加热垫和直肠温度计。将鼻锥连接到异氟醚气体管路。使用带有10x 0.4 DIC物镜的正置共聚焦显微镜和相关软件进行成像。

使用绿色 FITC 滤光片设置，激发波长为 495 纳米，发射波长为 519 纳米，检测波长在 500 至 580 纳米之间。在显微镜下，找到DRG的表面。调整载物台上的夹具，使DRG表面尽可能水平，并在焦平面中可视化最大表面积。

在整个过程中监测动物，以维持异氟醚麻醉而不会过量服用。要加载显微镜快速扫描协议，请使用体素大小 2.496 x 2.496 x 16 微米、512 x 512 像素、10 光学切片 Z 堆栈、一个 32 微米的 Airy 单元、1% 激光功率为 488 纳米和 5 毫瓦、像素时间 1.52 微秒、行时间 0.91 毫秒、帧时间 465 毫秒、LSM 扫描速度为 8、 双向扫描，PMT探测器增益650伏，数字增益1。通过单击"采集"选项卡下的"开始实验"，对DRG进行简短的八周期扫描。

通过在一段时间内以每帧扫描一次扫描进行正交投影来创建影片。手动检查图像清晰度和成像伪影，例如穿过 DRG 的亮度波。调整夹紧位置和光学切片厚度，然后重复此步骤，直到获得清晰、高质量的电影。

然后，使用体素大小 1.248 x 1.248 x 14 微米、1024 x 1024 像素、六个光学切片 Z 堆栈、1.2 艾里单位或 39 微米、5% 激光功率为 488 纳米和 25 毫瓦、像素时间 2.06 微秒、行时间 4.95 毫秒、帧时间 5.06 秒、LSM 扫描速度为 6、 双向扫描，PMT 探测器增益为 650 伏，数字增益为 1。单击"采集"选项卡下的"开始实验"按钮，制作 DRG 的高分辨率图像。加载显微镜快速扫描方案，并在DRG中记录80个周期的自发活动。

生成正交投影影片，并验证图像是否具有足够的质量进行分析。要施加刺激，请将显微镜设置为执行15至20次扫描。等待扫描一到五完成以生成基线。

在扫描6至10期间应用刺激。每次刺激后至少等待五分钟，然后再应用下一次刺激以防止脱敏。对于机械压力机，用爪子夹住测藻力计的夹子，不要接触爪子。

在扫描 5 结束后立即开始捏住爪子，并在扫描 10 后立即停止。用测藻力计监测压力，并确保其不超过所需力的10 g。对于热刺激，将烧杯水加热到略高于所需温度。

当水处于正确的温度时，将爪子浸入水中，在扫描五后立即施加刺激。扫描 10 后立即拉开烧杯。手术L5 DRG暴露，然后进行共聚焦显微镜检查，允许使用Pirt-GCaMP3小鼠一次对多达1， 800个神经元进行成像。

在没有刺激的情况下，在没有刺激的情况下，在正常生理环境中对刺激做出反应的情况下，在群体水平上观察到自发钙瞬变的集合中观察到初级感觉神经元。强烈的刺激或有害的热量会增加钙的反应。与用 100 g 按压相比，用 300 g 按压增加了产生钙瞬变的神经元数量和曲线下 delta F 乘 F0 面积。

在21摄氏度和45摄氏度的非有害温度范围内，暖热增加了产生钙瞬变的神经元数量和曲线下F0面积的delta F。与57摄氏度的有害热刺激相比，非有害温度激活了较少数量的神经元产生瞬态。此外，较小和中等直径的神经元在所有刺激下自发地产生钙瞬时，但大直径神经元仅在300g压力刺激下产生钙瞬变。

DRG应该是水平的和最佳的光学切片厚度。它应该是这样，您可以检测到最大数量的单元格，并且电影中没有波纹。该技术已被用于在人群水平上分析躯体感觉和味觉的感觉模式，并研究成对或同步激活的相邻神经元，从而导致慢性和神经性疼痛。