Name: 腹膜内移植在小鼠中产生急性髓系白血病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 了解如何通过腹膜内注射在小鼠中建立急性髓系白血病模型。该方法比传统静脉注射更便捷经济，适用于肿瘤学和血液学研究，为AML机制研究提供可靠的动物实验平台。

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作者感谢宾夕法尼亚州立大学兽医与生物医学科学系的赫克研究所流式细胞术核心设施以及动物诊断实验室组织病理学核心设施提供的及时技术支持。本研究得到了美国癌症研究所（KSP）、宾夕法尼亚州立大学农业科学学院、宾夕法尼亚州立大学癌症研究所、美国农业部-国家粮食与农业研究所项目4771（编号00000005）对K.S.P.和R.F.P.的资助。

所有实验均事先获得宾夕法尼亚州立大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 缓冲液与试剂的配制
<ol>
	<li>制备添加氨苄青霉素（AP）的 LB 琼脂平板（无菌 10 cm 平板）。具体操作如下：将 10 g LB 肉汤与琼脂溶解于 400 mL 蒸馏水中，搅拌，并将体积补足至 500 mL。通过高压灭菌对溶液进行灭菌，待溶液冷却后，向其中加入 0.5 mL 氨苄青霉素（母液浓度：150 mg/mL），摇动混匀。立即在酒精灯旁，将 18 mL 溶液倒入无菌 10 cm 平板中，于室温下凝固，并将平板倒置储存。 4 &#176;C 待后续使用。</li>
	<li>制备LB培养基：将10克不含琼脂的LB粉末溶于500毫升蒸馏水中。通过高压灭菌对溶液进行消毒，待溶液冷却后，向其中加入0.5毫升氨苄青霉素（母液浓度：150毫克/毫升），振荡混匀。</li>
	<li>制备流式缓冲液：将5 mL青霉素/链霉素和10 mL热灭活胎牛血清（hiFBS）加入485 mL 1x Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中。 
	注意：为通过加热灭活胎牛血清，请将解冻后的胎牛血清瓶置于 56 &#176;C 水浴。确保瓶子不会翻倒或浸入水浴中。温度对于完全降解至关重要；为确保这一点，请等待温度稳定在56°C。 &#730;将瓶子放入水浴后，保持37°C。每隔10分钟轻轻旋动瓶子，共三次。切勿让血清孵育超过30分钟。</li>
	<li>制备维持培养基时，向440 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中加入50 mL hiFBS、5 mL L-谷氨酰胺和5 mL青霉素/链霉素。制备转染培养基时，向445 mL DMEM培养基中加入50 mL hiFBS和5 mL L-谷氨酰胺。</li>
	<li>制备红细胞裂解液：取4.145 g NH4Cl，0.504 g NaHCO3将 16.81 毫克乙二胺四乙酸（EDTA）加入 500 毫升蒸馏水中。制备不完全 Iscove's modified Dulbecco's medium（IMDM）培养基：加入 75 毫升 hiFBS、5 克牛血清白蛋白（BSA）、0.5 毫升 10 毫克/毫升胰岛素、2.5 毫升 4 毫克/毫升全铁转铁蛋白。 3.5 &#181;L 的 &#946;-巯基乙醇、5 mL L-谷氨酰胺和 0.5 mL 环丙沙星加入 416.5 mL IMDM 培养基中。</li>
	<li>制备 10 mL 2x IMDM 培养基，其中细胞因子浓度为 1x IMDM 培养基中的两倍，具体方法为添加 10 &#181;L 50 ng/&#181;L mr-SCF, 20 &#181;L 25 ng/&#181;L 小鼠重组Flt3配体， 20 &#181;L 10 ng/&#181;L mr-IL-6, 20 &#181;L 10 ng/&#181;L 小鼠重组白细胞介素-3, 10 &#181;L 10 mg/mL 胰岛素， 50 &#181;L 将 4 mg/mL 全铁转铁蛋白加入 9.87 mL 不完全 IMDM 培养基中。 
	注意：请确保在使用前对流动缓冲液、红细胞裂解液、维持培养基、转染培养基以及不完全IMDM培养基进行过滤除菌处理。</li>
</ol>
2. 质粒转化
<ol>
	<li>解冻 20 &#181;L 的 &#945;- 在冰上选择感受态细胞。添加 1 &#181;L (~2 ng) 的 MSCV-MLL-AF9-EF1&#945;-luc2-P2A-EGFP-LC3 质粒22 将混合物加入已解冻的感受态细胞中，轻弹管壁混匀。将反应体系置于冰上孵育30分钟。</li>
	<li>将混合物置于 42°C 水浴中热激 40 秒。 42 &#176;C 加热块。立即将试管转移至冰上静置 2 分钟。</li>
	<li>向试管中加入 1 mL LB 培养基（不含氨苄青霉素），振荡混匀。 37 &#176;C 并在 200 rpm 转速下振荡 1 小时。</li>
	<li>在室温下以 500 x g 离心该管。 g 离心 4 分钟，弃去 0.9 mL 上清液。将沉淀重悬于剩余的 0.1 mL LB 培养基中。</li>
	<li>将转化后的感受态细胞涂布于预热的（37 &#176;C) AP LB 琼脂平板。将平板倒置，于 37 &#176;C 持续 12-16 小时。</li>
	<li>挑取单个菌落，将转化细胞在10 mL AP LB培养基中于37°C条件下过夜扩增。 &#730;C 与 200 rpm。</li>
	<li>将5 mL扩增的转化感受态细胞加入锥形瓶中的500 mL AP LB培养基，于37°C、200 rpm条件下振荡培养过夜。 37 &#176;C 并以 200 rpm 的转速进行。</li>
	<li>使用质粒提取试剂盒，按照制造商说明书提取质粒，并重悬于0.5 mL经高压灭菌的超纯水中。使用分光光度计对质粒进行定量。</li>
</ol>
3. 嗜亲性凤凰细胞 (pECO) 的转染
<ol>
	<li>培养 2 x 106 pECO细胞/板，于10厘米培养皿中，在维持培养基内，于5% CO₂加湿培养箱中培养。2 培养箱中 37 &#176;C确保 pECO 细胞在传代前处于指数生长期并保持活跃分裂状态。</li>
	<li>当细胞达到80%汇合度时，用5 mL DPBS清洗培养板两次，向培养板中加入1 mL胰蛋白酶，并在湿润的5% CO₂培养箱中孵育。2 37°C 培养箱 &#730;在无菌的 15 mL 管中用 5 mL 维持培养基收集细胞，以 200 × g 离心 5 分钟。 4 &#176;C 和 400 倍 g 3 分钟。将细胞沉淀重悬于 5 mL 维持培养基中。</li>
	<li>混合 10 &#181;L 细胞悬液的 10 &#181;L 台盼蓝溶液 10 &#181;L 将细胞滴加至血细胞计数板上进行计数。 
	细胞总数/毫升 = (计数的细胞总数 × 稀释系数 × 10)4 细胞/毫升 / 计数的方格数 
	接种 2 x 106 将细胞以每皿 2.5 × 10^5 个的密度接种于 6 cm 培养皿中，使用 5 mL 维持培养基进行转染，并在含 5% CO₂ 的加湿培养箱中培养细胞。2 培养箱中 37 &#176;C.</li>
	<li>当细胞培养18小时后达到50%-60%汇合度时，将维持培养基更换为5 mL转染培养基。</li>
	<li>转染前，请将转染试剂置于室温下至少30分钟。</li>
	<li>添加 5.5 &#181;g MSCV-MLL-AF9-EF1&#945;-luc2-P2A-EGFP-LC3 质粒22 取0.5 mL无添加剂的DMEM培养基，置于无菌1.5 mL离心管中。轻弹管壁混匀，静置10分钟。</li>
	<li>添加 14.6 &#181;L (3倍质粒量；v/w)的转染试剂加入管中，每10分钟轻弹管壁三次。</li>
	<li>将混合物均匀滴加至所有含有 pECO 细胞的培养皿中，培养基为转染专用。将培养皿轻柔地前后移动 10 次，再左右移动 10 次。将培养皿置于湿润的 5% CO₂ 培养箱中孵育。2 培养箱中 37 &#176;C 48 小时。</li>
	<li>通过荧光显微镜和流式细胞术检测绿色荧光蛋白（GFP）的转染效率，具体方法如下：22首先，根据 FSC-A/FSC-H 和 FSC-A 与 SSC-A 对细胞进行设门，以获取单细胞。随后，对 GFP+ 通过与非转染细胞进行比较，在FL1图中对细胞群体进行设门。</li>
	<li>收集上清液并通过滤膜过滤。 0.45 &#181;m 注射器滤器过滤至无菌的50 mL管中。将上清液立即用于转导，或在液氮中速冻后于-80°C保存。80 &#176;C 以备后续使用。 
	注意：&#160;pECO细胞需充分混匀并均匀铺于培养皿中。铺板时，通过将培养皿前后移动10次、左右移动10次，使细胞充分分散。铺板细胞数量可能因计数差异而有所变化。为确定培养18小时后能达到50%-60%汇合度的最佳铺板细胞数，采用系列稀释法进行铺板实验具有参考价值。</li>
</ol>
4. 慢病毒转导
<ol>
	<li>在 CO2 室中对 8-10 周龄的 CD45.1 雌性 C57BL6/J 小鼠实施安乐死（每只受体小鼠对应两到三只供体小鼠）。</li>
	<li>用 70% 乙醇对小鼠全身进行消毒。将小鼠置于泡沫板上铺有灭菌手术垫的区域，并通过小鼠爪垫固定其腿部。</li>
	<li>用尖头无菌剪刀沿中线切开腹腔上方的皮肤，并向后腿方向扩大皮下空间。</li>
	<li>将切口从腹中线向下延伸至脚踝。用尖头无菌剪刀的刀片扩大后腿下方的皮下空间。</li>
	<li>用尖头无菌剪刀切断跟腱。用带齿镊子夹住肌腱，并切断连接至股骨的另一端，以移除腓肠肌。</li>
	<li>用尖头无菌剪刀切断连接至膝盖的股四头肌腱。用带齿镊子夹住肌腱，并切断连接至股骨的肌头，以移除腓肠肌。</li>
	<li>用尖头无菌剪刀切断附着于胫骨末端、围绕股骨的其他肌肉。</li>
	<li>用尖头无菌剪刀切断踝关节，确保胫骨保持完整。用带齿镊子夹住股骨远端，并用尖头无菌剪刀切断髋关节，确保股骨头保持完整。</li>
	<li>将胫骨和股骨转移至无菌 15 mL 管中的流式缓冲液中。</li>
	<li>用手折断膝关节以分离胫骨和股骨。用手移除髌骨、软骨和股骨髁，暴露胫骨平台和股骨远端。用无菌纱布去除肌肉，然后将骨骼浸泡在流式缓冲液中。</li>
	<li>切断股骨颈，使用装有 23 G 针头的 10 mL 注射器，从股骨两端用流式缓冲液冲洗出骨髓细胞。</li>
	<li>切断胫骨踝，使用装有 23 G 针头的 10 mL 注射器，从胫骨两端用流式缓冲液冲洗出骨髓细胞。</li>
	<li>使用装有 18 G 针头的 10 mL 注射器，通过反复吹打使细胞分散。将单细胞悬液在 4 °C、400 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 5 mL 红细胞裂解液中，裂解红细胞 3 分钟。</li>
	<li>加入 5 mL 流式缓冲液以终止裂解，将细胞悬液在 4 °C、400 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>将 70 µm 细胞筛网置于无菌 50 mL 管上。用 5 mL 流式缓冲液重悬细胞沉淀，混匀后通过细胞筛网以收集细胞。</li>
	<li>在圆底聚丙烯管中用流式缓冲液将细胞浓度调整至 1 × 108/mL。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用小鼠造血细胞分选试剂盒分选 Lin- 细胞。</li>
	<li>预留三管细胞（每管 1 × 104 个细胞，置于 100 µL 缓冲液中），分别作为未染色对照以及 APC 标记的抗小鼠 CD117 (c-Kit) 和 PE-Cy7 标记的抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) 的单抗体染色对照。每个单抗体染色对照使用 1 µL 抗体（来自 0.2 mg/mL 储存液）。</li>
	<li>将剩余细胞置于一管中，加入两种抗体（每种抗体各 4 µL，来自 0.2 mg/mL 储存液），总体积为 400 µL，进行染色。将各管置于冰上避光孵育 0.5-1 小时。</li>
	<li>染色后，加入 1 mL 流式缓冲液洗涤细胞，并在 4 °C、400 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>将未染色对照和单抗体染色对照的细胞重悬于 100 µL 流式缓冲液中。将双抗体染色的细胞重悬于 1 mL 流式缓冲液中以备分选。</li>
	<li>使用细胞分选仪，将造血干细胞 (HSC) 分选为 LSK 群体，方法如文献23,24所述。</li>
	<li>在染色期间，按如下方法用 RetroNectin 包被无菌 6 cm 培养皿：用 PBS 制备 100 µg/mL 的 RetroNectin 储存液，向 6 cm 培养皿中加入 0.9 mL PBS 和 0.1 mL RetroNectin。在无菌超净工作台中于室温下包被培养皿 2 小时。然后，移除 RetroNectin，用 0.5 mL 过滤的 2% BSA（溶于 PBS）封闭培养皿 30 分钟。用 5 mL PBS 洗涤培养皿两次，该培养皿即可用于转导。</li>
	<li>将分选的 HSC 或未分选的 Lin- 细胞在 4 °C、400 × g 条件下离心 3 分钟，重悬于 3 mL 含 2 倍细胞因子的 IMDM 培养基和 3 mL 病毒上清液（来自步骤 3.10 制备）中，然后转移至 RetroNectin 包被的培养皿中。将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 6 或 24 小时。 
	注：在本研究中，根据实验设计，Lin- 细胞进行了分选或未分选处理。</li>
</ol>
5. 连续移植（图 1）
注意：主要受体小鼠为8-10周龄雄性C57BL6/J小鼠（CD45.2）。它们被提供饮水 自由采食 含有抗生素以防止机会性消化道感染，从移植前3天持续至移植后7天。主要受体小鼠在移植前3小时接受亚致死剂量照射（4.75 Gy）。25异氟烷未应用于经腹腔注射的小鼠。
<ol>
	<li>转导6或24小时后，于室温下以400 × g离心3分钟收集细胞。如有需要，可使用胰蛋白酶收集贴附于培养皿底部的细胞。弃去上清液，用预热的PBS重悬细胞。PBS的体积根据受体数量确定（即，经眼眶后注射和腹腔注射的受体分别按0.1 mL/只小鼠和0.5 mL/只小鼠计算）。</li>
	<li>将接受亚致死剂量照射的受体小鼠置于异氟烷麻醉舱中（氧气流速设为1.0 L/min，异氟烷挥发罐浓度设为5%）。涂抹湿润的眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥。当小鼠心率降至每分钟60次时，即可进行后续操作。</li>
	<li>使用27 G1/2针头，经眼眶后（0.1 mL/只小鼠）7或腹腔内（0.5 mL/只小鼠）26将细胞注射入初次受体小鼠体内。持续观察小鼠直至其恢复足够意识以维持胸骨卧位。移植后每日监测小鼠健康状况。</li>
	<li>1个月后，每周通过眼眶后采血收集血液，如下所述使用血细胞分析仪评估全血细胞计数（CBC）以监测白细胞增多症。
	<ol>
		<li>使用异氟烷麻醉小鼠（氧气流速设为1.0 L/min，异氟烷挥发罐浓度设为5%）后，将其侧卧放置。当小鼠心率降至每分钟60次时，即可进行后续操作。</li>
		<li>用拇指和食指使眼球突出。用无菌血细胞比容毛细管经内眦刺入静脉窦丛。</li>
		<li>收集20-25 µL血液至EDTA抗凝采血管中，闭合眼睑以止血。向眼睛滴加一滴硫酸庆大霉素眼用溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在终点，当白细胞（WBCs）达到4 × 104 个细胞/µL时，在CO2室中对小鼠实施安乐死，并按步骤4所述，用流式缓冲液冲洗股骨和胫骨以分离骨髓细胞，随后进行红细胞裂解。</li>
	<li>在终点，按如下所述收获脾细胞。
	<ol>
		<li>在CO2室中对小鼠实施安乐死。将小鼠置于泡沫板上的无菌手术垫上，通过小鼠爪垫固定腿部。用70%乙醇消毒小鼠全身。</li>
		<li>用尖端锋利的无菌剪刀沿中线切开皮肤和肌肉，暴露腹腔。用尖端锋利的无菌剪刀分离脾脏，并将其置于无菌15 mL管中的流式缓冲液内。</li>
		<li>在6 cm培养皿中，用3 mL流式缓冲液将脾脏通过70 µm无菌细胞筛研磨。将培养皿中的细胞转移至无菌15 mL管中，于4 °C、400 × g离心3分钟获得单细胞悬液。</li>
		<li>弃去上清液，用5 mL红细胞裂解液重悬细胞以裂解红细胞3分钟。加入5 mL流式缓冲液终止裂解，于4 °C、400 × g离心细胞悬液3分钟。</li>
		<li>将70 µm细胞筛置于无菌50 mL管上。用5 mL流式缓冲液重悬细胞沉淀，混匀后通过细胞筛以收集细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过用FITC标记的抗小鼠CD45.1抗体染色脾细胞和骨髓细胞，并在流式细胞仪上检测，以鉴定初次（1˚）急性髓系白血病细胞。首先在FSC-A/FSC-H和FSC-A/SSC-A图上设门获取单细胞。通过与未染色细胞比较，在FL1图上设门获取CD45.1+细胞群。</li>
	<li>对于二次（2˚）移植，将来自1˚经眼眶后受体的CD45.1阳性急性髓系白血病脾细胞用PBS（0.1 mL/只小鼠）重悬，并注射入CD45.2雄性C57BL6/J小鼠的眶后静脉丛。同时，将来自1˚腹腔受体的急性髓系白血病脾细胞用PBS（0.5 mL/只小鼠）重悬，并腹腔注射入8-12周龄表达红色荧光蛋白（RFP）的Ai14TdTomato雄性小鼠27。</li>
	<li>对于三次（3˚）移植，将分离自2˚腹腔受体骨髓或腹腔的急性髓系白血病细胞分别重悬，并腹腔注射入Ai14TdTomato（RFP+）或CD45.2小鼠。将分离自2˚经眼眶后受体腹腔的急性髓系白血病细胞重悬，并通过眶后注射移植入Ai14TdTomato（RFP+）小鼠。 
	注：对于2˚移植，我们通过监测外周血CBC来确认2˚受体中的疾病进展。为进一步确认急性髓系白血病的建立，我们通过心脏穿刺收集了全外周血以及骨髓、脾脏和肝脏。此外，我们进行了腹腔灌洗以收集腹腔细胞。如上所述，从骨髓、脾脏和腹腔灌洗液中获得单细胞悬液。裂解红细胞后，使用流式细胞仪分析这些部位的细胞。急性髓系白血病细胞被识别为RFP阴性（RFP-）细胞。对于3˚移植，我们在终点采集了血液、骨髓、脾脏、肝脏和腹腔细胞；将RFP-或CD45.1+细胞鉴定为急性髓系白血病细胞并通过流式细胞术检测。2˚和3˚受体小鼠未接受照射或抗生素饮水。</li>
</ol>
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64834/64834fig01.jpg" /> 
图 1：骨髓造血干细胞中 MLL-AF9 病毒转导及连续移植示意图（1˚、2˚ 和 3˚）。 若条件允许，可使用细胞分选仪分选 Sca-1 与 c-Kit 双阳性群体（如虚线框所示，此步骤为可选）。本图使用 BioRender (https://biorender.com/) 创建。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64834/64834fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的更大版本。</a>
6. 腹腔灌洗
<ol>
	<li>向腹腔内注射5 mL不完全IMDM培养基两次，将收集的细胞置于15 mL无菌管中。在室温下以400×g离心细胞悬液。 g 3 分钟。移植 AML 细胞（4 x 105 每只小鼠腹腔中获取2×10^6个细胞。&#730; 受试者 通过 腹腔注射于3&#730; CD45.2 受体小鼠（n = 3）。</li>
</ol>
7. 组织学分析 28
<ol>
	<li>安乐死小鼠后，分离其脾脏、肝脏和股骨。将组织置于 5 mL 10% (v/v) 缓冲福尔马林中固定。同时采集健康对照小鼠的脾脏和肝脏样本以供比较。</li>
	<li>将固定组织包埋于石蜡中并切片。使用苏木精和伊红 (H&E) 染料对切片进行染色。</li>
	<li>使用安装有兼容软件的显微镜，在 20 倍放大倍数下获取图像，用于组织学分析。</li>
</ol>
8. 执行半定量 PCR (qPCR)
<ol>
	<li>根据制造商说明书，使用 RNA 试剂制备 RNA。</li>
	<li>使用 0.5-1.0 µg RNA，根据制造商说明书，使用 cDNA 逆转录试剂盒合成 cDNA。</li>
	<li>使用 cDNA，采用 qPCR 试剂盒进行 qPCR，并在 qPCR 系统中运行样本。使用以下预先验证的 TaqMan 探针：KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 和 18S 核糖体 RNA (Hs99999901_s1)。</li>
	<li>将 KMT2A 和 18S 扩增产物上样至 2% 琼脂糖凝胶以观察表达情况。在安装有兼容软件程序的成像仪中采集图像。</li>
</ol>
9. 数据处理
<ol>
	<li>使用统计分析软件分析结果，并以平均值 ± 标准误的形式呈现。使用商业插图工具生成图表。</li>
</ol>

<ol><li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li>
<li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li>
<li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li>
<li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia%3A+learning+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hemasphere%22%5BJournal%5D)">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152(2019).</li>
<li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li>
<li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice%3A+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuckow%2C+MA+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. , CRC Press Inc. (2001).</li>
<li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Biochemistry%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li>
<li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+part+I%3A+anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
<li>Leong, S. -K., Ling, E. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous%2C+subcutaneous+or+intraperitoneal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li>
<li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+therapies+supplement%3A+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048(2012).</li>
<li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li>
<li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360(2012).</li>
<li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7, 27(2016).</li>
<li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death & Disease. 7 (9), 2361(2016).</li>
<li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li>
<li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells%3A+resting+stem+cells+or+mystery+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li>
<li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dose+Response%22%5BJournal%5D)">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572(2020).</li>
<li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li>
<li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+neural+development+to+cognition%3A+unexpected+roles+for+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328(2022).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9%3A+gene+dosage+and+critical+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li>
<li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

上述研究提供了有力证据，表明Lin细胞的移植- 细胞在生成1方面与LSK细胞相当&#730; 小鼠急性髓系白血病。此外，当前数据还表明，与静脉注射（或眶后注射）相比，腹腔注射是建立小鼠急性髓系白血病的一种高效且便捷的方法。
除了 LSK 细胞外，已有研究报道其他细胞群体，如粒细胞-单核细胞前体细胞（GMP）、共同淋巴样前体细胞（CLP）和共同髓系前体细胞（CMP），也可作为供体细胞用于构建不同潜伏期的 1˚ MLL-AF9 诱导型 AML 模型31,32，但目前尚缺乏定量比较以确定最优选择。在本研究中，来自相同供体小鼠的 Lin- 与 LSK 细胞在生成 1˚ MLL-AF9 诱导型 AML 方面无明显差异，原因在于转导后的髓系前体细胞（Sca-1-）亦能够启动 AML33。考虑到基于流式细胞术分选 LSK 群体所需的成本和时间，这些研究支持将 Lin<...

急性髓系白血病（AML）是一种病因多样的血液系统恶性肿瘤，预后较差1。建立AML动物模型为深入理解其复杂的异质性和发病机制奠定了基础，有助于发现新的治疗方法2。在小鼠中，白血病的发生通常通过移植表达融合癌蛋白的供体细胞来实现，其中包括混合谱系白血病（MLL）基因相关的融合蛋白，可有效诱导AML，从而模拟人类疾病3。在MLL基因相关AML的移植模型中，已有多种供体细胞来源的报道4，但对导致疾病起源的具体细胞类型仍知之甚少。
已开发出多种小鼠移植途径；与直接将突变供体细胞注入骨髓的股骨内注射不同5，利用静脉窦丛、尾静脉和颈外静脉的静脉注射已被广泛用于构建小鼠急性髓系白血病（AML）模型6,7,8,9。对于经眶后（r.o.）注射而言，存在多种固有缺陷，例如注射体积受限、技术要求高、重复操作或纠错机会少，以及可能造成眼部损伤等问题，长期以来缺乏有效替代方案，成为主要障碍7。尾静脉注射除局部损伤外也可能遇到类似困难；为便于操作，通常需要对小鼠进行预热以扩张其尾静脉10。此外，在无额外光源的情况下难以准确定位尾静脉，尤其是在C57BL/6品系小鼠中更为困难。颈外静脉注射则要求研究人员经过充分培训，以准确定位血管并减少可能的并发症。此外，静脉窦注射和颈外静脉注射均需在麻醉状态下进行，进一步增加了操作复杂性。因此，探索新的移植途径以促进AML小鼠模型的建立具有重要意义。
腹腔（i.p.）注射常用于给予药物、染料和麻醉剂11,12,13,14,15；也已被用于引入造血细胞以实现异位造血16，以及在多种小鼠模型中移植骨髓来源的间充质干细胞17,18,19,20,21。然而，该方法极少被用于在小鼠中建立造血系统恶性肿瘤，尤其是用于研究急性髓系白血病（AML）的疾病进展。
本研究描述了腹腔注射在构建急性髓系白血病（AML）小鼠模型中的可行性，并比较了谱系阴性（Lin-）细胞与Lin-Sca-1+c-Kit+（LSK）细胞群体作为供体细胞的移植效率。这些发现为构建AML及相关髓系白血病的实验模型提供了一种简单且高效的方法。该方法有望加深我们对疾病机制的理解，并为实验性治疗方案的测试提供相对简便的模型。

<table><tbody><tr><td>a-选择感受态细胞&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-85027</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵 (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A-9434</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A0797</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)，第五组分&amp;mdash;低内毒素级</td><td>Gemini bio-products</td><td>Cat# 700-102P</td><td></td></tr><tr><td>盐酸环丙沙星</td><td>GoldBio.com</td><td>Cat# C-861-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，不含谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning</td><td>Cat# 21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA，二钠盐 (EDTA-2Na)，二水合物，分子生物学级</td><td>Calbiochem</td><td>Cat# 324503</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优质精选</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cat# S11550</td><td></td></tr><tr><td>全转铁蛋白，牛源</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# T1283</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素溶液</td><td>Sigma</td><td>Cat# I-9278</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's 改良 Dulbecco 培养基 (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 12440-053</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM (100&amp;times;) 溶液</td><td>HyClone, Gelifesciences</td><td>Cat# SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤，Lennox 型</td><td>NEOGEN</td><td>Cat #: 7290A</td><td></td></tr><tr><td>含琼脂的 LB 肉汤 (Miller 型)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# L-3147</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗小鼠 CD45.1 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-124-211</td><td></td></tr><tr><td>小鼠白细胞介素-3 (IL-3)</td><td>Gemini bio-products</td><td>Cat# 300-324P</td><td></td></tr><tr><td>小鼠白细胞介素-6 (IL-6)</td><td>Gemini bio-products</td><td>Cat# 300-327P</td><td></td></tr><tr><td>小鼠干细胞因子 (SCF)</td><td>Gemini bio-products</td><td>Cat# 300-348P</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩</td><td>Corning</td><td>Cat# 30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Phenix-Eco (pECO) 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾 (KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)，颗粒状</td><td>JT. Baker</td><td>Cat# 2940-01</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD117 (c-kit) (APC)</td><td>BioLegend&amp;nbsp;</td><td>Cat # 105812</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 558162</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 Flt3 配体</td><td>Pepro Tech, INC.</td><td>Cat# 250-31L</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin 重组人纤维连接蛋白片段</td><td>TaKaRa</td><td>Cat# T100A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;IT-293 试剂</td><td>MirusBio</td><td>Cat# MIR 2705</td><td></td></tr><tr><td>TRI 试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# T9424</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Gibco</td><td>Cat # 15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇 (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# M3148</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;商用检测试剂盒&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep 小鼠造血祖细胞分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>StemCell technologies</td><td>Cat# 19856A</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>Cat# 4368813</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td><td>Quanta Bio</td><td>Cat# 95051-500</td><td></td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒 (25)</td><td>Qiagen</td><td>Cat#:12163</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ai14&lt;sup&gt;TdTomato&lt;/sup&gt; &lt;/em&gt;小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Strain # 007914</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1 C57BL6/J 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Strain # 002014</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2 C57BL6/J 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Strain # 000664</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;仪器与软件&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator&amp;nbsp;</td><td>版本 25.2.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD accuri C6 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.0</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneSys 软件程序&amp;nbsp;</td><td>版本 1.5.7.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 版本 6&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemavet 950FS&amp;nbsp;</td><td>Drew Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7300 实时 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syngene G:BOX Chemi XR5 化学发光与荧光成像系统</td><td>G:Box Chemi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

腹腔内移植法建立小鼠急性髓系白血病模型

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

急性髓系白血病（AML）及其由持续存在的白血病干细胞（LSCs）所导致的复发，目前仍缺乏有效的新型治疗方法。为测试基于成功移植这些细胞的疗法，需建立一种实验性AML啮齿类动物模型。 通过 受体小鼠的眶后注射存在诸多挑战。本研究旨在建立一种简便、可靠且可重复的方法，通过腹腔注射途径构建稳定的急性髓系白血病（AML）小鼠模型。在本实验方案中，骨髓细胞被表达人源MLL-AF9融合癌蛋白的逆转录病毒转导。Lin阴性（Lin⁻）细胞的转导效率-）和 Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) 群体作为供体LSCs在原发性AML发展中的作用进行了测试，并采用腹腔注射作为生成AML的新方法。通过连续移植实验比较了腹腔注射与眶后注射两种方法。两者均属于Lin- 和 LSK&#160;经人MLL-AF9病毒转导的细胞在受体小鼠的骨髓和脾脏中植入良好，导致完全成熟的急性髓系白血病（AML）。通过腹腔注射供体细胞可在连续移植后使受体小鼠成功建立AML模型，流式细胞术、qPCR及组织学分析均检测到AML细胞在受体小鼠外周血、骨髓、脾脏和肝脏中的浸润。因此，腹腔注射是一种利用供体白血病细胞连续移植诱导AML的高效方法。

比较小鼠急性髓系白血病细胞通过眼后和腹腔途径移植的效率 
既往已有报道，在受体小鼠中通过眼后途径移植MLL-AF9转导的LSK细胞可成功建立1˚急性髓系白血病（AML），并通过连续移植实验证实了1˚ AML细胞具有可移植性30。本研究首次评估了使用骨髓Lin-细胞进行移植的可能性。异常白细胞增多（图2A）以及骨髓和脾脏中白血病细胞（CD45.1+）浸润增加（图2B）的结果支持使用骨髓Lin-细胞诱导生成1˚ AML的可行性。为比较疾病诱导时间，每只受体小鼠对应两只供体小鼠被实施安乐死，以分离LSK或Lin-细胞。结果显示，在移植了LSK细胞或Lin-细胞的1˚受体小鼠中，疾病潜伏期无显著差异（图2C）。
在...

本实验采用腹腔注射白血病细胞的方法，在小鼠体内建立并扩增急性髓系白血病（AML）。该新方法在AML细胞的连续移植中具有良好的效果，可为在小鼠尾静脉注射操作中遇到困难或结果不一致的研究者提供一种替代方案。

急性髓系白血病（AML）及其由持续存在的白血病干细胞所导致的复发，目前仍缺乏有效的新型治疗方法。

该方案具有重要意义，因为从相同供体小鼠分离的lin阴性细胞和SK细胞在诱导MLL-AF9急性髓系白血病（AML）方面无明显差异。此外，通过腹腔注射白血病细胞可成功建立AML小鼠模型。与传统移植方法相比，该技术更为便捷且成本较低。首先，用70%乙醇对8至10周龄的CD45.1雌性C57BL/6J小鼠进行消毒。将小鼠置于泡沫板上的无菌手术垫上，并通过小鼠脚掌垫固定四肢。沿腹腔中线剪开皮肤，并使用尖头无菌剪刀向后肢方向扩大皮下间隙。从腹部正中线向下延伸切口至脚踝处，用尖头剪刀扩大后肢下方的皮下间隙。用尖头剪刀切断跟腱。用有齿镊子夹住跟腱，剪断其在股骨端的附着点，以取下腓肠肌。用尖头剪刀剪断附着在膝关节上的股四头肌腱。握住肌腱，剪断附着在股骨上的肌肉头部，以去除腓肠肌。在附着于胫骨的一端，剪断股骨周围其他肌肉。接下来，使用尖头剪刀剪开踝关节，注意保持胫骨完整。握住股骨远端，用尖头剪刀剪开髋关节，注意保持股骨头完整。将胫骨和股骨转移至含有流动缓冲液的15毫升离心管中。用手折断膝关节，分离胫骨和股骨。去除髌骨、软骨及股骨髁以暴露胫骨平台和股骨远端。使用无菌纱布去除肌肉，并将骨骼浸泡在流动缓冲液中。用带有23号针头的10毫升注射器从股骨两端剪断股骨颈并用流式缓冲液冲洗骨髓细胞。接着，剪断胫骨踝突，用流式缓冲液从胫骨两端冲洗骨髓细胞。使用带有18号针头的10毫升注射器反复吹打，使细胞分散。将单细胞悬液在 4 摄氏度、400 ×g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，加入 5 毫升红细胞（即 RBC）裂解缓冲液，裂解红细胞 3 分钟。加入 5 毫升流式缓冲液以终止裂解反应。然后离心细胞悬液，并将沉淀重悬于5 mL流式缓冲液中。将70微米细胞滤网置于50 mL离心管上，将悬液通过滤网以收集细胞。用流式缓冲液调整细胞浓度，使聚丙烯圆底管中细胞浓度为每毫升1×10⁸个。根据制造商说明书，使用小鼠造血细胞分离试剂盒筛选阴性谱系细胞。操作完成后，离心已分选的造血干细胞和未分选的阴性谱系细胞，并将其重悬于3 mL含2倍浓度细胞因子的IMDM培养基以及3 mL病毒上清液中，置于经逆转录病毒增强剂包被的培养皿内。将培养皿放入37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育6小时或24小时。转导后，通过离心收集细胞。如有需要，使用胰蛋白酶收集贴附在培养皿底部的细胞。弃去上清液，并将沉淀重悬于预热的 PBS 中。使用27号半针将细胞通过眼后静脉或腹腔注射至初级受体小鼠体内。每天观察小鼠状况。一个月后，每周通过眼后静脉采血，利用Hemavet血液分析仪检测全血细胞计数，以监测白细胞增多情况。用拇指和食指将眼球向前推，然后通过内眦用无菌血细胞比容毛细管穿刺静脉窦丛。采集20至25微升血液至EDTA采血管中，并闭合眼睑以止血。向眼部滴加一滴硫酸庆大霉素眼用溶液。当白细胞数量达到每微升4×10⁴个细胞时，用流式缓冲液冲洗股骨和胫骨以分离骨髓细胞，随后按前述方法进行红细胞裂解。接下来，为获取脾细胞，将小鼠置于泡沫板上的无菌手术垫上，并通过小鼠脚掌垫固定四肢。用70%乙醇对小鼠进行消毒。使用无菌尖头剪刀沿中线剪开皮肤和肌肉，暴露腹腔。分离脾脏并将其放入含有流式缓冲液的15毫升离心管中。将脾脏用70微米细胞筛在6厘米培养皿中研磨，加入3毫升流式缓冲液。将细胞从培养皿转移至15毫升离心管中，离心单细胞悬液，弃去上清液，然后将沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中，裂解3分钟。加入5毫升流式缓冲液以终止裂解反应，离心细胞悬液。将沉淀重悬于5毫升流式缓冲液中，混匀后通过70微米细胞滤网，收集细胞至50毫升离心管中。通过使用FITC标记的抗小鼠CD45.1抗体对脾细胞和骨髓细胞进行染色，并在流式细胞仪上检测，从而鉴定原发性急性髓系白血病（AML）细胞。首先在FSC-A与FSC-H以及FSC-A与SSC-A图中设门以获取单细胞群体，然后通过与未染色细胞对照比较，在FL1图中圈选CD45.1阳性细胞群。进行二次移植时，将来自初次经眶后注射受体的CD45.1 AML脾细胞在PBS中重悬，并经眶后注射至CD45.2雄性小鼠体内。骨髓和脾脏中异常白细胞增多以及白血病细胞浸润增加的现象，支持了利用骨髓谱系阴性细胞生成原代AML的可行性。在移植了LSK细胞或谱系阴性细胞的初次受体中，未观察到显著差异。通过混合谱系白血病或MLL-AF9转导的谱系阴性细胞，AML细胞在初级受体小鼠的腹腔内扩散。这些结果还证实了通过腹腔注射MLL-AF9转导的骨髓谱系阴性细胞，可在受体小鼠的骨髓和脾脏中产生白细胞增多以及AML细胞的存在，从而成功建立初级急性髓系白血病（AML）模型。然而，尽管供体细胞数量相等，通过腹腔注射进行初级移植诱导AML发生所需时间仍长于经眶后注射途径。次级受体在移植后不到一个月内出现白细胞增多以及显著的肝脾肿大。在外周血、骨髓、脾脏以及腹腔中均检测到急性髓系白血病（AML）细胞。通过腹腔注射8×10⁵个AML细胞所实现的移植效果与经眶后注射8×10⁵个AML细胞相当。第三批受体小鼠急性表现出急性髓系白血病（AML）症状，包括白细胞增多症和肝脾肿大，血液、骨髓及脾脏中均检测到白血病细胞；对股骨和脾脏的组织学观察进一步证实了白血病细胞的浸润。与第二批和第三批移植相比，第三批移植的疾病进展明显快于第二批移植。对于本模型而言，无需分选LSK细胞。Lin阴性细胞可用AML病毒转导6小时或24小时，这不会影响模型建立的效率。

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