Name: 小鼠自身免疫性糖尿病过继转移模型中移植物存活的生物发光监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解利用生物发光成像技术在小鼠自身免疫性糖尿病模型中监测NIT-1细胞移植物存活的微创方法。该技术成本低、操作简单，有助于研究β细胞替代治疗的保护机制并识别潜在治疗靶点。

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感谢Erica P. Cai博士和Yuki Ishikawa博士开发了本方案中所述的方法（见参考文献11）。S.K.和P.Y.实验室的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）（R01DK120445，P30DK036836）、JDRF、哈佛干细胞研究所和贝茨基金会的资助。T.S.获得了美国国家糖尿病、消化系统与肾脏疾病研究所（NIDDK）博士后奖学金（T32 DK007260-45）的支持，K.B.部分获得了玛丽·K·亚科卡基金会奖学金的支持。

<img alt="NIT-1 luc2 表达、糖尿病 NOD 小鼠分离、脾细胞注射、生物发光成像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：在小鼠糖尿病过继转移模型中移植与成像移植物的工作流程。 表达萤火虫荧光素酶基因（luc2）的 NIT-1 细胞被皮下移植到 NOD-scid 小鼠体内。同时，将从自发性糖尿病 NOD 小鼠中分离的自身反应性脾细胞注射入这些小鼠。通过无创生物发光成像定期对移植物进行成像。图示由 BioRender.com 制作。缩写：NOD = 非肥胖型糖尿病；scid = 严重联合免疫缺陷。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64836/64836fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
所有动物护理和研究方案均经乔斯林糖尿病中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照其规定执行。NOD 和 NOD-scid 小鼠可从商业来源 readily 获得。本研究中所有小鼠均饲养于经哨点监测的设施中。有关本实验方案所用材料、动物、仪器和软件的详细信息，请参见材料表。
1. NIT-1 细胞系的构建与维护
<ol>
	<li>在含有4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2的细胞培养皿中培养与NOD小鼠具有相同遗传背景的NIT-1细胞系和293FT细胞。</li>
	<li>将293FT细胞培养至70%-80%汇合度，用于转染。</li>
	<li>每10 cm培养皿的293FT细胞中，加入10 µg pLenti-luciferase-blast质粒（见补充文件1），该质粒在组成型活性EF1α启动子控制下表达萤火虫荧光素酶转基因（luc2），同时加入包装质粒pMD2.G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev各2 µg，包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G 4 µg，以及60 µg线性聚乙烯亚胺（PEI），溶于1 mL无血清DMEM中。根据待转染细胞数量按比例调整各组分用量。</li>
	<li>将DNA、PEI和DMEM在室温（RT）下静置20分钟，然后加入293FT细胞中。</li>
	<li>转染后48小时收集含有慢病毒颗粒的培养基。</li>
	<li>以每106个细胞加入1 mL含慢病毒颗粒的培养基，对约80%汇合度的NIT-1细胞进行转导，持续48-72小时。</li>
	<li>使用5 µg/mL杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选表达荧光素酶的细胞，持续48小时。</li>
	<li>根据实验需求进一步对表达荧光素酶的细胞进行遗传修饰。同时设置表达荧光素酶的野生型或非靶向对照细胞系作为比较。 
	注：目标基因修饰的示例包括CRISPR敲除、CRISPRa/i、shRNA敲低和过表达。</li>
</ol>
2. 移植用NIT-1细胞的制备
<ol>
	<li>将表达荧光素酶的细胞培养至融合度达到80%–90%。</li>
	<li>移除生长培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS，每10 cm培养皿使用5 mL）洗涤细胞。</li>
	<li>每皿加入1 mL 0.05%的胰蛋白酶-EDTA，作用2分钟。</li>
	<li>加入5 mL生长培养基以中和胰蛋白酶。</li>
	<li>用移液器将细胞从培养皿上吹下，并转移至锥形管中。 
	注意：相同细胞系的多个培养皿中的细胞可合并。</li>
	<li>使用台盼蓝等染料，通过血细胞计数板手动或使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
	<li>在室温下以250 × g 离心5分钟，并用抽吸式移液器移除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于PBS中，调整细胞浓度至5 × 107 个细胞/mL（每只小鼠每细胞系移植107 个细胞，体积为200 µL）。</li>
	<li>将细胞置于冰上保存（最多3小时），直至进行移植。</li>
</ol>
3. 将 NIT-1 细胞移植到 NOD-scid 小鼠体内
<ol>
	<li>使用异氟烷吸入法在麻醉诱导室中对受体小鼠（与分离脾细胞所用小鼠同性别、8–10周龄的NOD-scid小鼠）进行麻醉。以1.5 L/min的流速向室内输送2.5%异氟烷，同时以9 L/min的速率进行排气。 </li>
	<li>用眼膏润滑动物的眼睛，以防止干燥。</li>
	<li>使用带保护罩的电动剃毛器，剃除小鼠背部（背侧）的毛发以暴露皮肤。剃毛后的移植区域大小约为1英寸×2英寸。将剃毛后的小鼠放回击倒室，直至进行移植。</li>
	<li>将小鼠逐只转移至带有异氟烷鼻罩的清洁表面，轻柔引导小鼠头部进入鼻罩。移植过程中，以0.25 L/min的异氟烷流速维持麻醉状态。</li>
	<li>用异丙醇消毒垫擦拭移植区域，以去除松散的毛发并消毒皮肤。</li>
	<li>确保细胞完全重悬后再装入注射器。吸取超过所需体积的液体（&gt;300 µL) 细胞加入带有26 G针头的1 mL无菌注射器中。去除气泡后，将多余的细胞液返回至离心管中，以便 300 µL 细胞悬液仍残留在注射器中。</li>
	<li>用非优势手持一对弯镊，轻轻提起小鼠背部一侧（左侧或右侧）的皮肤，以便更易于进入皮下间隙。</li>
	<li>用惯用手将注射器置于与小鼠身体冠状面和矢状面平行的位置。针尖朝向小鼠头部，将针头刺入后躯附近的皮肤，并轻柔地引导其进入皮下间隙。确保整个针头保持在皮肤下方，避免穿出。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住针头基部周围的皮肤。缓慢释放少量细胞悬液（&lt;50 µL）并确认注射部位皮下形成微小隆起。继续注入细胞悬液直至 200 µL 已递送至皮下空间。</li>
	<li>保持镊子位置不动，并使针头与小鼠身体保持平行，缓慢抽出针头。针头拔出后，用镊子夹住皮肤切口数秒钟，以防止细胞从穿刺伤口漏出。</li>
	<li>若需评估基因修饰效果，应使用不同的注射器在小鼠对侧重复移植操作，使每只小鼠同时接种突变型细胞和对照细胞，一侧接种一种细胞系，另一侧接种另一种细胞系。若仅移植一种细胞系，则仅在一侧注射细胞。</li>
	<li>移植后，将每只小鼠转移至新的笼子中。在向笼内添加其他小鼠之前，需确保每只小鼠已从麻醉中完全恢复。 
	注意：当小鼠恢复正常的活动能力，且无嗜睡或运动障碍迹象时，视为已恢复。</li>
	<li>每天评估小鼠在移植后实验期间的健康状况。如果移植物形成明显隆起，或小鼠出现虚弱、精神萎靡等症状，应检测其血糖水平，并提供10% (w/w) 蔗糖水 随意 向所有低血糖小鼠实施安乐死。遵循所有兽医建议，并根据机构指南对持续身体状况不良的小鼠实施安乐死。本研究中，小鼠通过 CO₂2 吸入麻醉后行颈椎脱位处死。</li>
</ol>
4. 自体反应性脾细胞的分离与纯化
<ol>
	<li>使用尿液（或血液）葡萄糖试纸鉴定 10 至 16 周龄、新发糖尿病（病程少于 10 天）的雄性或雌性 NOD 小鼠。当 NOD 小鼠连续两天尿液/血液葡萄糖水平 ≥250 mg/dL 时，即可判定为糖尿病。 
	注意：每只 NOD-scid 小鼠需要 1000 万个脾细胞；通常一个脾脏可获得 5000 万至 1.5 亿个脾细胞。脾细胞来源于饲养在哨兵鼠监测设施中的无病原体小鼠。</li>
	<li>处死适量数量的糖尿病 NOD 小鼠。 
	注意：本研究中，小鼠通过吸入 CO2 进行安乐死，随后进行颈椎脱位以确保死亡。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，用手术剪在皮肤上做一个长约 2 英寸的垂直切口。从操作者视角打开小鼠右侧，找到鲜红色的脾脏。轻轻将脾脏从粉红色的胰腺上分离，并转移至含有 5 mL 无菌 PBS 的无菌 10 cm 培养皿中。根据需要重复解剖多只小鼠。 
	注意：多个小鼠的脾脏可合并置于同一个培养皿中。后续步骤应在无菌操作台中使用无菌试剂和器械进行。</li>
	<li>用无菌注射器活塞的平头研磨脾脏组织。</li>
	<li>将 40 µm 或 70 µm 细胞筛置于 50 mL 锥形离心管上，加入 5 mL PBS 冲洗以预湿筛网。将脾脏悬液转移至筛网上，并继续轻柔研磨使其通过筛网。用 10 mL PBS 冲洗培养皿，并将冲洗液转移至筛网。持续研磨直至筛网上无红色残留。</li>
	<li>弃去筛网，将离心管在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。用移液器吸除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 5 mL（最多对应三个脾脏）室温预热的 ACK 裂解缓冲液中，在室温下裂解红细胞 4 分钟。若需处理更多脾脏，每增加一个脾脏应额外增加 1–2 mL 裂解液体积。</li>
	<li>每 5 mL 裂解缓冲液加入 5 mL NIT-1 细胞培养基（如上所述）以终止反应。将细胞悬液通过新的细胞筛以去除团块。弃去筛网，于室温下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 20 mL PBS 中，计数细胞。在室温下以 500 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于无菌 PBS 中，调整浓度至 1 × 108 个细胞/mL（注射体积为每只小鼠 0.1 mL），置于 1.5 mL 安全锁反应管中。</li>
	<li>将细胞置于冰上（不超过 1 小时）或在室温保存，并立即进行尾静脉注射。</li>
</ol>
5. 糖尿病小鼠脾细胞的静脉注射 通过 尾侧尾静脉
<ol>
	<li>将成年受体 NOD-scid 小鼠的体温升高（例如.使用加热灯照射约5-10分钟，以扩张静脉（有助于静脉的可视化及静脉注射）。 
	注意：为避免小鼠过热，切勿超过此时间。需始终监测小鼠的健康状况。若小鼠出现疲劳或活动减少，应立即关闭加热灯。</li>
	<li>预热细胞悬液。准备一支无菌注射器（0.3–1.0 mL）并连接无菌针头（27–30 G，0.3 mm/0.5 英寸或更小），或使用带 0.3 mm（0.5 英寸）针头的无菌 0.5 mL 胰岛素注射器。操作过程中始终保持针头无菌；若需在注射间隙放置注射器，应将其置于无菌托盘中。</li>
	<li>每次注射前将脾细胞悬液充分重悬。每只小鼠，抽取 100 µL 将预热并混匀的脾细胞悬液吸入注射器中，确保注射器及细胞悬液中无气泡。 
	注意：在将小鼠放入固定装置之前，务必准备好所有设备和用品（用于消毒的酒精棉片、装有待注射脾细胞的注射器，以及用于隔离已注射小鼠的新笼子）。</li>
	<li>将小鼠放入固定装置中。用非惯用手抓住尾巴，找到两条侧尾静脉之一。必要时可轻轻旋转尾巴。用消毒湿巾（70%异丙醇）擦拭尾巴，以清洁皮肤并增强静脉的可见度。</li>
	<li>用惯用手将针头以较小的锐角插入尾巴的中央区域。针头斜面朝上，沿皮肤推进数毫米。 
	注意：确保针头与静脉平行，并刚好置于皮肤下方。穿刺皮肤/血管壁后，需防备小鼠/尾部突然移动。成功插入针头时，应有“顺滑滑入”静脉的感觉。若需再次尝试，应向尾部近端（靠近身体方向）移动。</li>
	<li>轻轻按压注射器以注入脾细胞悬液。注射时切勿使针头进一步深入或退出。成功的注射过程应顺畅，无阻力感，且注射后立即可见透明/白色血液回流。</li>
	<li>轻轻将针头从静脉中抽出，用消毒棉片对尾部施加轻压，直至出血停止。将小鼠从固定装置中释放，并轻柔地转移至新准备好的笼中。 
	注意：注射2至3只未接受NIT-1细胞移植的对照小鼠，以确认自身反应性脾细胞诱导糖尿病的潜力，糖尿病发生时间约为注射后2-4周。</li>
</ol>
6. 体内 NIT-1 移植物的生物发光成像
注意：每周对移植物成像一至两次。在移植当天，需等待至少2小时后再进行成像，以使移植物充分稳定并确保荧光素酶表达稳定。如果时间有限，可将首次检测安排在第1天进行。推荐的初始成像时间点为注射后第0天或第1天、第5天、第10天、第14天、第18天和第25天。然而，应根据自身免疫进展的情况（通过生物发光信号的减弱来判断）对成像时间表进行相应调整。
<ol>
	<li>配制15 mg/mL的D-荧光素钠溶液于Dulbecco's PBS中。室温下振荡溶解，经无菌滤器过滤0.22 µm). 将1 mL等分试样于−80 °C保存20 °C，根据需要解冻使用。 
	注意：这些分装样品可再次冷冻。</li>
	<li>成像前至少 5 分钟，使用 1 mL 注射器和 26 G 针头，以 150 mg/kg 的剂量向小鼠腹腔注射 D-luciferin 溶液。  
	注意：每只小鼠均须使用新的注射器和针头。 </li>
	<li>根据机构指南，通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。推荐条件为：向麻醉诱导室中通入2.5%异氟烷，气体流速为1.5 L/min，排出流速为9 L/min。</li>
	<li>用眼药膏润滑动物的眼睛，以防止干燥。</li>
	<li>打开与成像仪器配套的软件。创建一个 新用户 和/或 登录。在 控制面板 在右下角选择 初始化 (图2A）。为了 自动保存 成像数据，创建适当的 文件夹 在计算机上，然后选择 采集 | 自动保存至… (图2A）。仪器初始化完成后，设置 曝光时间 到 1 分钟. 
	注意：完整的成像参数如图所示 图2B.</li>
	<li>将小鼠逐只从麻醉室转移至成像仪器。将小鼠腹部朝下放置，四肢自然伸展，并轻柔引导其头部进入鼻罩。维持异氟烷气体流速为0.25 L/min 通过 鼻锥适用于在成像过程中维持麻醉。用双手轻轻按压小鼠背部中央，然后向外侧分开双手，使其身体平稳展开。</li>
	<li>选择 获取 (图2B）。在弹出窗口中记录实验的任何相关细节（图 2C). 
	注意：参见 图3A 用于展示三只8周龄雌性NOD-scid小鼠在不同时间点移植两个移植物后的代表性图像。</li>
</ol>
<img alt="Living Image 软件界面；荧光成像采集控制设置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64836/64836fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于成像生物发光移植物的软件操作界面截图。（A）成像前，选择初始化以准备仪器。可通过选择采集|自动保存至…将图像自动保存至指定文件夹。（B）成像参数概览。将小鼠放置于仪器中后，点击采集。（C）成像过程中弹出的对话框截图。此处可输入时间点、小鼠品系等详细信息。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64836/64836fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
7. 数据分析
<ol>
	<li>成像后可在任意时间量化生物发光信号。打开与成像仪器配套的软件，选择文件 | 打开，然后选择待分析小鼠对应的ClickInfo.txt 文件。</li>
	<li>在工具面板中，选择ROI 工具（图 3B，步骤 1）。从椭圆下拉菜单（图 3B，步骤 1，红色箭头）中选择移植到小鼠体内的移植物数量。</li>
	<li>移动椭圆，使其分别包含每个移植物的生物发光信号，然后选择测量 ROI（图 3B，步骤 2）。</li>
	<li>记录每个移植物的总计数值（图 3B，步骤 3）。</li>
	<li>对于每个移植物，将每一时间点测得的生物发光信号除以首次时间点测得的信号。以相对于初始生物发光信号的残余信号比例或百分比表示移植物存活率。 
	注意：若移植物在移植后发生扩增，则移植物存活率的比例或百分比将分别大于 1 或 100%。所有接受移植的小鼠均应监测是否出现不良健康反应。</li>
</ol>

<ol><li>Katsarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
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<li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+type+1+diabetes+immunopathology+using+eye-transplanted+islets+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice.</a> Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

1型糖尿病是一种目前尚无治愈方法的严重疾病。β细胞替代疗法为该病患者提供了一种有前景的治疗手段，但该策略面临的关键障碍是移植的β细胞可能再次遭受自身免疫系统的攻击。通过对干细胞来源的β细胞进行基因工程改造以降低其免疫可见性或免疫易感性，是解决这一问题的潜在途径之一。本文介绍了一种在小鼠自身免疫性糖尿病的过继转移模型中，非侵入性成像移植β细胞并监测其存活情况的实验方案。
该方法的一个关键优势在于其方案的可适应性。本文应用该方法比较了突变细胞系与非靶向对照（图3），但该方案可适用于多种实验问题。可利用该方法探究多种遗传修饰、药物或其他处理对自身免疫攻击的保护作用。在评估某种药物或其他治疗手段对自身免疫的保护效果时，仅需使用表达荧光素酶且无其他遗传修饰的细胞。尽管本文采用同基因型移植来检测自身免疫保护作用，但该方法也可通过使用非同基因型的细胞系与小鼠品系组合（例如NIT-1细胞与C57BL/6J小鼠）进行调整，以评估同种异体免疫排斥反应。此外，该方案还可修改用于探究免疫细胞向移植物的浸润情况。可增加在不同时间点取出移植物的额外小...

1型糖尿病（T1D）是由自身免疫反应导致胰腺中产生胰岛素的β细胞被破坏所引起的。β细胞质量的丧失导致胰岛素缺乏和高血糖。T1D患者需要每天多次注射外源性胰岛素，并在其一生中反复经历严重的高血糖和低血糖发作。这些发作相关的并发症包括糖尿病视网膜病变、肾功能下降以及神经病变1。
胰岛素注射是1型糖尿病（T1D）的治疗方法，但并非治愈手段。然而，通过补充丢失的β细胞质量，有可能使患者恢复自主产生胰岛素的能力，从而逆转疾病进程。但尸体供体胰岛的供应十分有限2。干细胞来源的胰岛（SC-胰岛）可能为移植提供近乎无限的β细胞来源。多个研究团队已证实，人类胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）可被分化为具有功能的类β细胞3,4,5。初步的临床试验数据令人鼓舞，表明这些细胞在移植后能够维持其功能，并可能使患者摆脱对外源性胰岛素的依赖6。然而，患者仍需长期接受免疫抑制治疗，从而增加了罹患癌症和感染的风险。此外，免疫抑制剂长期使用可能对移植物具有细胞毒性7。为了消除对免疫抑制的需求，可对SC-胰岛进行基因改造，以保护其在移植后免受复发性自身免疫及同种异体免疫的攻击。
干细胞研究在成本和劳动力方面要求极高。小鼠细胞系和动物模型是初步鉴定和实验验证保护移植细胞免受自身免疫攻击策略的有用工具。NOD小鼠会自发产生自身免疫性糖尿病，其特征与人类1型糖尿病（T1D）具有诸多相似之处。8，且NIT-1胰岛素瘤细胞系与该小鼠品系具有相同的遗传背景9糖尿病可通过过继转移方式传递给相关的免疫缺陷型 NOD-scid 小鼠品系 通过 通过注射来自NOD小鼠的糖尿病脾细胞，以在复制的实验小鼠中实现糖尿病发病时间的同步化10该模型可用于相对快速且低成本地鉴定出遗传靶点，以便在单细胞胰岛中进行进一步验证。最近，该方法已被应用于鉴定并验证 RNLS一种被发现可保护人原代胰岛免受自身免疫攻击的靶点 体内 以及源自β细胞应激的iPSC衍生胰岛 体外11本文介绍了一种简单直接的方案，用于移植基因工程改造的NIT-1细胞，并在小鼠自身免疫性糖尿病的过继转移模型中非侵入性地监测其存活情况。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA</td><td>康宁</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>由SV40大T抗原转化的人胚胎肾细胞衍生的快速生长、高转染效率的克隆株</td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>70%异丙醇酒精消毒片</td><td>Amazon/Ever Ready 急救</td><td>B08NWF31DX</td><td></td></tr><tr><td>BD 5毫升注射器，鲁尔锁扣式针头</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头 26G x 5/8（0.45 mm x 16 mm）皮下注射</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL 结核菌素注射器，滑动针头接口</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S HCl</td><td>康宁</td><td>&amp;nbsp;30-100-RB</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网 高级 SureStrain，70 &amp;micro;米，无菌</td><td>南方实验室器具</td><td>C4070</td><td>或使用孔径为40–70 μm的类似无菌滤网</td></tr><tr><td>CellDrop 自动细胞计数仪</td><td>Denovix</td><td>CellDrop BF-PAYG</td><td>或使用类似的细胞计数设备</td></tr><tr><td>Corning 100 mL 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩</td><td>康宁</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>一次性吸液管，聚苯乙烯材质，无菌，容量 = 2 mL</td><td>VWR</td><td>414004-265</td><td>或使用类似的吸液移液器</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐，分子生物学级，粉末状 &gt;99%</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸钠，不含谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>Falcon BD 离心管，50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>优质组织镊，1×2齿，5英寸，德国钢</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-820-074</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖尿检试纸</td><td>加州宠物药房</td><td>u-tsg100</td><td>或使用类似的试纸检测尿液/血液中的葡萄糖</td></tr><tr><td>GlutaMAX&amp;ndash;1 (100倍)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>红外加热灯</td><td>Cole Parmer</td><td>03057-00</td><td>或使用类似的红外灯&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰岛素注射器 0.5 mL，U-100，29 G，0.5 英寸</td><td>Becton Dickinson</td><td>309306</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Piramal Critical Care</td><td>6679401725</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 活体成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>用于无创采集移植细胞生物发光图像的仪器</td></tr><tr><td>活体成像分析软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>128113</td><td>用于采集和量化生物发光信号的软件</td></tr><tr><td>微量离心管密封盖，1.5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>或使用类似的无菌微量离心管</td></tr><tr><td>NIT-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2055</td><td>源自NOD/Lt小鼠的胰岛β细胞系</td></tr><tr><td>NOD.Cg-Prkdcscid/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>001303</td><td>严重联合免疫缺陷自发突变纯合小鼠&amp;nbsp;Prkdcscid，通常称为&amp;nbsp;scid 的特征是缺乏功能性 T 细胞和 B 细胞、淋巴细胞减少、低丙种球蛋白血症以及正常的造血微环境。</td></tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>杰克逊实验室</td><td>001976</td><td>NOD/ShiLtJ品系小鼠（通常称为NOD）是一种多基因的自身免疫性1型糖尿病模型</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010031</td><td>无钙，无镁，无酚红</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-荧光素酶-blast</td><td>自制</td><td>质粒可应要求提供</td><td>参见补充文件1</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺，线性，分子量 25,000，转染级（PEI 25K）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1014320</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>大鼠固定器，布鲁姆式圆形1英寸</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-288-32A</td><td></td></tr><tr><td>尖头剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td>或使用由手术级不锈钢制成的其他剪刀</td></tr><tr><td>经组织培养处理的培养皿</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430167-20EA</td><td>或使用其他经无菌细胞培养处理的培养皿</td></tr><tr><td>精细中头镊/钳</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-157</td><td></td></tr></tbody></table>

生物发光监测小鼠过继转移自身免疫性糖尿病模型中的移植物存活

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

1型糖尿病的特征是胰腺中产生胰岛素的β细胞遭受自身免疫破坏。针对该疾病的一种有前景的治疗方法是移植干细胞来源的β细胞。然而，可能需要通过基因改造来保护移植细胞免受持续性自身免疫的攻击。糖尿病小鼠模型是初步评估保护移植细胞免受自身免疫攻击策略的有用工具。本文描述了一种微创方法，用于在小鼠过继转移性糖尿病模型中进行细胞移植物的移植与成像。本方案中，使用表达萤火虫荧光素酶转基因的鼠源性胰腺β细胞系NIT-1的细胞 luc2 被皮下移植到免疫缺陷的非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷（scid）小鼠体内。同时，这些小鼠通过静脉注射来自自发性糖尿病NOD小鼠的脾细胞，以传递自身免疫反应。移植物被定期成像观察 通过 利用非侵入性生物发光成像技术监测细胞存活情况。将突变细胞的存活情况与移植至同一只小鼠体内的对照细胞进行比较。

方案的总体概述见图1。可比较两种细胞系（例如突变体与非靶向对照）的存活情况，也可在多组小鼠中测量一种细胞系的存活情况，例如药物处理小鼠与溶剂对照处理小鼠之间的比较。图3A显示了三只8周龄雌性NOD-scid小鼠，分别移植了非靶向对照（左）和突变体（右）细胞系。同时，这些小鼠还通过静脉注射自反应性脾细胞以诱导糖尿病。
小鼠在注射后的第0天、第5天、第10天、第14天和第18天进行成像。在三只小鼠中的两只中，对照移植物在第18天时已被破坏，表现为生物发光信号的消失，而突变型移植物则受到保护。在另一只小鼠中，突变型移植物被破坏，而对照移植物则未被破坏，这突显了动物之间的生物学差异。生物发光信号的量化方法如图3B所述。移植物存活率以相对于首次时间点的残余生物发光信号百分比表示（图3C）。此外，计算每只小鼠突变型与对照发光信号的比值，有助于可视化动物间的差异（<s...

本方案描述了一种简单且微创的方法，用于在非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷小鼠体内移植并成像NIT-1细胞，这些小鼠经来自自发性糖尿病NOD小鼠的纯化脾细胞攻击后建立疾病模型。

1型糖尿病的特征是胰腺中产生胰岛素的β细胞受到自身免疫破坏。该疾病的一种有前景的治疗方法……

该方案有助于理解机体抵御自身免疫攻击的机制，并为1型糖尿病中的β细胞替代治疗确定潜在的治疗靶点。该技术的主要优势在于成本相对较低，细胞培养、移植和成像方法操作简便，且小鼠实验技术具有最小的侵入性。此前未进行过尾静脉注射操作的人员可能在将针头插入静脉时遇到困难。在首次注射前，请专家进行示范。开始时，取麻醉后的小鼠，使用带保护罩的电动剃须刀去除其背部毛发，暴露约一英寸乘两英寸的皮肤区域。将脱毛后的小鼠放回麻醉维持舱。移植前，将小鼠逐只从饲养箱转移至配备异氟烷鼻罩的清洁操作台，轻柔地将小鼠头部引导进入鼻罩中。用异丙醇消毒棉片擦拭已剃毛的区域，以去除散落的毛发并消毒皮肤。随后，用一支配有26号针头的1毫升无菌注射器抽取超过300微升的细胞悬液。从注射器中去除气泡，并保留300微升细胞悬液，将多余液体推出。用非优势手持一把弯镊，轻轻提起小鼠背部一侧的皮肤，以便更易于进入皮下空间。然后用优势手将注射器平行于小鼠身体的冠状面和矢状面放置。将针头朝向小鼠头部，插入后肢附近皮肤，引导针头进入皮下间隙，确保整个针头始终位于皮肤下方，避免刺穿皮肤。调整镊子夹住针头基部周围的皮肤。缓慢注入少于50 µL的细胞悬液，并确认注射部位皮下形成一个小的隆起。继续皮下注射最多200微升细胞悬液。然后保持镊子位置不变，并使针头与小鼠身体保持平行，缓慢拔出针头。针头拔出后，用镊子将皮肤闭合数秒钟，以防止细胞从穿刺伤口泄漏。移植后，将每只小鼠转移至新的笼子中，并在向笼中添加其他小鼠之前，让动物从麻醉状态完全恢复。将安乐死的小鼠置于仰卧位，使用手术剪在皮肤上做一个长约两英寸的纵向切口。切开小鼠右侧，找到鲜红色的脾脏。轻轻将脾脏从粉红色的胰腺上分离，并转移至含有5 mL无菌PBS的无菌10 cm培养皿中。用无菌注射器活塞的平头研磨脾脏。将40或70 μm细胞筛置于50 mL锥形管上，并用5 mL PBS预湿。将脾脏悬液转移至滤器中，并轻轻研磨。用 10 毫升 PBS 冲洗培养皿，并将冲洗液转移至滤器中。继续研磨，直至滤器上无红色残留。然后在室温下以500 G的转速离心5分钟，用吸液移液器弃去上清液，再将细胞沉淀重悬于5毫升预热至室温的ACK裂解缓冲液中，在室温下裂解红细胞4分钟。每5毫升裂解缓冲液加入5毫升NIT-1细胞培养基以终止反应，将细胞悬液通过新的滤网转移至50毫升离心管中，以去除细胞团块。在室温下以500 G的转速离心5分钟。接下来，将细胞沉淀重悬于 20 毫升 PBS 中，然后进行细胞计数。计数后，在室温下以 500 ×g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于无菌 PBS 中，置于 1.5 毫升带安全锁的离心管中。立即注射，或在冰上保存细胞，最多不超过一小时。使用加热灯对成年受体NOD SCID小鼠进行5至10分钟的加温，以扩张静脉。每次注射前，重新悬浮脾细胞悬液。每只小鼠，用注射

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科研

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Biology

生物学

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本文描述了一种将荧光素酶标记的人恶性外周神经鞘瘤细胞稳定移植到免疫缺陷小鼠坐骨神经中的方法。同时讨论了利用生物发光成像技术验证肿瘤移植物成功建立的标准，以及将动物随机分入研究组别的依据。...

人源荧光素酶标记的恶性周围神经鞘瘤细胞原位异种移植 体内 候选治疗药物的测试

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在经糖尿病型脾细胞攻击的免疫缺陷小鼠中成像转基因β细胞

来源：Clark, A.J., 等. 胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像。J. Vis. Exp.

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迫切需要更深入地了解胰腺癌的生物学特性，以推动开发更有效的治疗方案来应对胰腺癌。为满足这一需求，我们展示了一种胰腺癌的原位模型，该模型允许通过非侵入性手段监测癌症进展 体内...

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NOG小鼠中多发性骨髓瘤骨髓异种移植的多模态生物发光与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。...

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

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活体纵向成像与定量分析人胰岛移植物及前房眼内微环境宿主细胞的贡献

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