人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本方案采用静态悬浮培养策略，将胰腺前体细胞分化为胰岛样细胞簇，减少了细胞在摇动培养过程中所承受的应激压力，显著提高了分化成功率。该硬件方案对初学者友好，可节省前四个阶段优化所需的时间。具备基本干细胞培养技术的人员均可成功重复本方案，并有较大概率获得具有功能的胰岛样细胞簇。

首先，用预冷的 DMEM/F12 培养基稀释适用于 hESC 的 Matrigel 包被培养孔，并将培养板置于湿润、37°C、含 5% 二氧化碳的培养箱中孵育 30 分钟。吸除 hPSC 培养物中的废弃培养基，并用 DPBS 洗涤一次。在 37°C 条件下，使用细胞解离酶将 hPSC 培养物解离为单细胞，孵育时间为 3 至 5 分钟。

消化后，加入温热的DMEM/F12培养基清洗细胞，并转移至15或50毫升的锥形离心管中。将细胞悬液在300 G条件下离心5分钟，然后将沉淀重悬于含有10 µM Y-27632的干细胞完全培养基中。随后，使用血细胞计数板进行活细胞计数。

计数后，将稀释的基质胶吸出，并立即在基质胶包被的孔板中以每平方厘米1.6至1.8 × 10⁵的密度接种活细胞。将细胞置于湿润培养箱中培养24小时。接着，在第一阶段第一天，配制阶段1A培养基。

将耗尽的培养基更换为第1A阶段培养基，并培养24小时。次日，将孔中的耗尽培养基更换为 freshly prepared 第1B阶段培养基。在第二阶段的第一天，制备第2A阶段培养基，并将孔中的培养基更换为第2A阶段培养基。

加入2B阶段培养基前，先孵育24小时；第三阶段第一天，吸除孔中的废弃培养基，然后加入新鲜配制的3阶段培养基，并在湿润培养箱中孵育。第四阶段第一天，用新鲜配制的4阶段培养基替换废弃培养基，并在湿润培养箱中孵育。第四阶段第五天，每孔加入500 µL抗黏附冲洗液对微孔进行预处理。

将微孔板在1,300 G下离心5分钟，并在显微镜下观察，确保微孔中无气泡残留。接着，吸去孔中的洗涤液，并用1毫升DPBS洗涤一次。然后，向每孔中加入1毫升聚集培养基。

从胰腺前体细胞培养物中移除用过的培养基后，先用 DPBS 清洗培养物一次，然后在 37 摄氏度下使用消化试剂消化 10 至 12 分钟，使其解离为单细胞。用预温的 DMEM/F12 培养基冲洗细胞，并将其转移至离心管中，在 300 ×g 条件下离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于成团培养基中，并进行活细胞计数。

每孔接种 240 万至 360 万个细胞，并向每孔加入聚集培养基，使每孔终体积为 2 毫升。使用 P-1000 移液器吸头轻轻吹打细胞，使其均匀分布。将细胞悬液在 300 ×g 离心 5 分钟，使细胞沉降至微孔中，随后在湿润培养箱中孵育 24 小时，以启动细胞聚集。

聚集后，轻轻吹打聚集体数次，使未聚集的细胞悬浮。待聚集体沉降后，小心移除含有悬浮未聚集细胞的废弃培养基，避免吸走聚集体。将新鲜的第5阶段培养基加入微孔板表面，使聚集体从微孔中脱离，并将其转移至超低吸附六孔板中。

将所有团块收集到超低吸附六孔板后，用第5阶段培养基重悬，调整密度至每100微升含20个团块。然后，使用多通道移液器将50微升第5阶段培养基加入超低吸附ULA平底96孔板的每个孔中。在角落和边缘孔中加入200微升DPBS。

每次分装前轻轻混匀细胞团重悬液。然后，将100微升细胞团重悬液加入超低吸附平底96孔板的每孔中。将培养板置于湿润培养箱内的水平表面上，孵育24小时。

第二天或第五阶段的第二天，使用多通道移液器，从每个孔中轻轻吸出90 µL的用过的培养基，并加入100 µL第五阶段培养基进行更换。在第六阶段的第一天，将每个孔中的90 µL用过的培养基替换为100 µL第六阶段培养基。在第七阶段的第一天，移除用过的培养基，并为每个孔加入100 µL第七阶段培养基。

本研究中，利用微孔板可一次性生成数千个大小和形态均一的胰腺前体细胞簇，平均聚集效率约为74%。重要的是，这些细胞簇在聚集后仍能维持PDX1和NKX6.1的高水平表达。随着时间推移，在活体培养中可观察到内分泌细胞簇内胰岛素表达细胞逐渐被诱导，表现为胰岛素GFP信号随时间逐渐增强。细胞簇的尺寸在第五至第七阶段之间，平均直径从150微米增加至220微米。

细胞组成表征显示，通过混合方案生成的第7阶段人多能干细胞（hPSC）胰岛主要为内分泌细胞，包含四种主要的胰岛细胞类型。该混合方案主要产生单激素胰岛细胞，以及少量双激素细胞。分化形成的β细胞表达NKX6.1、MAFA、NEUROD1、PDX1和GLUT1。

此外，在第七阶段的培养中，可诱导出60%的胰岛素和PDX1双阳性细胞以及50%的C肽和NKX6.1双阳性细胞。体外静态葡萄糖刺激胰岛素分泌实验表明，第七阶段的hPSC胰岛在高葡萄糖刺激和直接去极化条件下能够分泌高水平的胰岛素。hPSC胰岛的总胰岛素含量约为尸体来源胰岛的一半。

基于多孔板的静态培养系统可用于生成干细胞来源的胰岛，支持多种原位检测，并可作为方案开发和小规模筛选研究的合适平台。在96孔板中进行静态培养时，为尽量减少细胞聚集体的融合，在更换培养基时切勿倾斜培养板，应始终将培养板水平放置于平整表面上。