基于免疫染色的红细胞蛋白动态改变检测
2023年3月17日
捕获去核红细胞蛋白质活化的动态变化带来了方法学挑战，例如保留急性刺激的动态变化以供以后评估。所提出的方案描述了样品制备和染色技术，这些技术能够保存和分析相关的蛋白质变化和随后的检测。
我们的方法通过在快速发展的机械生物学领域固定临时蛋白质修饰，然后用特异性抗体检测它们，使机械亚细胞研究成为可能。这种方法在技术上很容易应用。结果非常有效且可重复。
此外，与其他技术相比，我们的方法确实可以有效地用于新兴的翻译后红细胞信号传导领域，该领域依赖于临时蛋白质修饰，尤其是红细胞机械信号传导。要进行红细胞蛋白固定，请在室温下以一比二的比例在 4% 多聚甲醛溶液中稀释全血 20 分钟。将血液溶液在室温下以132g离心三分钟，然后小心地除去上清液。
将红细胞沉淀重悬于两体积的0.1摩尔PBS中，并在室温下孵育五分钟。再次，离心样品，并除去上清液，然后将红细胞沉淀重悬于一个0.1摩尔PBS体积中。用耐酒精笔标记样品ID和抗体的显微镜载玻片。
加入10微升制备的红细胞溶液。将第二张载玻片以45度角放在样品上，并将样品均匀地分散在载玻片上。通过将样品悬停在本生燃烧器上并持续移动五到七秒钟来热固定载玻片。
对于免疫组织化学染色，使用油脂铅笔将载玻片的 2/3 区域标记为测试，将 1/3 区域标记为对照。然后通过应用TBS清洗样品区域两次30秒。第二次洗涤后，加入0.1%胰蛋白酶，并使用带盖的专用培养室盖住载玻片。
将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在烧杯中装满自来水，并通过将烧杯中的自来水添加到载玻片上来停止酶反应。倒出溶液，用TBS清洗两个区域三次。
最后一次洗涤后，加入过氧化物酶封闭溶液，并在室温下孵育30分钟。孵育后，倒出溶液并用TBS洗涤两个区域三次。然后加入3%脱脂牛奶溶液并孵育30分钟。
孵育后，倒出溶液，并将一抗溶液加入测试区域。在对照区加入抗体对照溶液。将样品在四摄氏度下孵育过夜。
第二天，倒出抗体溶液，并用TBS清洗两个区域三次。然后加入3%的普通山羊血清溶液以防止非特异性结合并孵育30分钟。孵育后，加入二抗溶液并孵育30分钟。
倒出抗体溶液并用TBS洗涤该区域三次，然后再进行染色。接下来，要进行亲和素偶联辣根过氧化物酶反应，加入稀释的亲和素过氧化物酶溶液并孵育30分钟。将载玻片置于显微镜下，放大倍率为200倍，并将新鲜制备的DAB溶液添加到两个区域。
连续监测红细胞的染色，并在背景开始着色之前用一次性移液管去除DAB溶液来停止染色。要进行样品脱水，请将载玻片放在玻璃架中，每次在增加乙醇浓度中浸入五秒钟，最后浸入二甲苯中。脱水后，将载玻片放在薄纸上，红细胞位于顶部以吸收多余的液体。
在盖玻片上加入两滴或三滴安装剂，并使用盖玻片盖住载玻片。为了进行可视化和成像，请将载玻片放在与相机耦合的透射光显微镜中。打开光源和相机并启动软件。
在明场模式下，通过转动粗焦和精细调焦旋钮来聚焦红细胞。同样，将红细胞聚焦在荧光模式下。要分析 RBC 灰度值，请使用 ImageJ 软件中的椭圆选择工具标记每个 RBC 的边缘。
使用"测量"命令，测量来自测试的 50 个 RBC 和来自控件的 10 个 RBC 的灰度值。对于红细胞蛋白的免疫荧光染色，将样品与二级荧光偶联抗体在室温下孵育30分钟，保护其避光。孵育后，倒出抗体溶液并用TBS洗涤载玻片三次。
最后一次洗涤后，将TBS留在样品上。使样品脱水并用盖玻片准备载玻片以进行显微镜评估，如图所示。打开显微镜和荧光光源，并在明场模式下聚焦红细胞。
在随机选择的载玻片测试区域的至少三个不同区域中捕获明场和荧光图像。将荧光图像的曝光时间设置为一秒并捕获图像。然后切换到明场模式，将曝光时间设置为自动，并拍摄相应的明场图像。
以TIFF格式保存图像。在载玻片控制区域的至少两个不同的随机选择区域中捕获荧光和明场图像。将图像保存为TIFF格式，以保留像素的原始灰度值，防止压缩，并携带采集的元数据。
要测量捕获的 RBC 的灰度值，请打开 ImageJ。使用椭圆选择工具标记每个单元格，并使用"测量"命令进行分析。突出显示三到五个没有红细胞的区域，并确定灰度值以测量背景信号。
要对捕获的图像执行替代数据分析，请通过斐济版本的 ImageJ 创建一个宏命令，用于给定图像的自动选择、背景校正和灰度值分析。在斐济打开 TIFF 格式图像进行分析。然后打开红细胞荧光。
ijm 宏，然后单击运行。使用免疫组织化学和免疫荧光评估针对红细胞一氧化氮合酶（NOS）的抗体信号，该抗体在静止时和响应机械力暴露时在丝氨酸1177残基上磷酸化。当使用免疫组织化学或免疫荧光方法评估时，与相应的未剪切细胞相比，检测到针对丝氨酸1177残基磷酸化的RBC-NOS的抗体信号增加了三倍。
用户需要确保抗体仅应用于测试区域。否则，由于缺少对照，无法分析样品。鉴于抗体种类繁多，使用这种方法可以靶向许多不同的蛋白质和信号传导过程。
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概述
本文介绍了一种捕获去核红细胞中蛋白质活化的动态变化的方法，解决了在分析过程中保持这些变化的挑战。该协议通过有效固定和检测暂时性蛋白质修饰，实现了红细胞力学信号传导的机制调查。
关键研究组成部分
科学领域
- 力学生物学
- 红细胞信号传导
- 蛋白质修饰
背景
- 研究红细胞中的蛋白质活化对理解力学信号传导至关重要。
- 暂时性蛋白质修饰在细胞反应中起着重要作用。
- 现有方法在分析过程中面临保持动态变化的挑战。
- 本研究引入了一种可靠的蛋白质固定和检测协议。
研究目的
- 开发一种用于固定红细胞中暂时性蛋白质修饰的方法。
- 使对刺激的蛋白质活化的可重复分析成为可能。
- 推进翻译后修饰和力学信号传导的研究。
使用的方法
- 用4% 甲醛稀释全血以进行固定。
- 离心以分离细胞成分。
- 特定蛋白质检测的染色技术。
- 应用特定抗体进行分析。
主要结果
- 该方法易于应用，并产生有效、可重复的结果。
- 在捕获红细胞中的暂时性蛋白质修饰方面有效。
- 促进了红细胞力学信号传导这一新兴领域的研究。
- 展示了在保持动态变化方面优于现有技术的优点。
结论
- 所提出的协议显著增强了红细胞中蛋白质动态的研究。
- 它为力学生物学和细胞信号传导的研究开辟了新的途径。
- 未来的研究可以利用这种方法获得对红细胞功能的更深入见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Immunostaining-based detection of dynamic red blood cell (RBC) protein alterations enables mechanistic interrogation of transient protein modifications critical for mechanobiology and post-translational signaling research. This capability supports early-stage target validation and de-risking in discovery pipelines where acute protein activation states inform therapeutic hypotheses. The method's reproducibility and semi-quantitative outputs facilitate robust portfolio triage and cross-program comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detection of acute protein activation states relevant to mechanotransduction and signaling pathways.
- Supports functional target validation by capturing transient post-translational modifications in RBCs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific protein responses to experimental stimuli.
- Provides semi-quantitative data for hypothesis-driven portfolio advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RBC samples for downstream screening of protein activation or inhibition.
- Standardizes antibody-based detection workflows for reproducible and comparable results.
- Enables quantitative image-based readouts suitable for assay development and optimization.
- Supports scalability through protocol adaptability to different antibody targets and detection modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by enabling detection of protein changes in response to physiological or pathological stimuli.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting biomarker identification in RBCs.
- Reduces translational risk by ensuring that observed protein modifications are robust and reproducible across conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This immunostaining protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic studies, assay development, and translational biomarker exploration in RBC systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting specific protein activation events.
- Screening: Delivers reproducible, semi-quantitative outputs for compound or condition evaluation.
- Analytics: Provides image-based gray value measurements and background correction for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by capturing disease- or treatment-relevant protein modifications.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to diverse antibody targets and mechanistic questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies by preserving transient protein states.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and detection for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by providing robust, semi-quantitative data on protein activation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying biological mechanisms and reducing late-stage uncertainty.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody selection, sample preparation, and microscopy-based imaging.
- Needs access to light and fluorescence microscopy, as well as image analysis software such as ImageJ or Fiji.
- Demands rigorous control staining to account for non-specific antibody binding and background signals.
- Adaptable to various RBC protein targets and signaling pathways with appropriate antibody validation.
- Limited to semi-quantitative analysis; absolute quantification may require complementary methods.
