Name: 监测斑马鱼幼虫的靶向信号反应 - Z-REX 揭示亲电药物和代谢物的精确机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 了解Z-REX技术如何精确分析斑马鱼幼虫中亲电药物与靶蛋白的相互作用机制。该方法通过时空精准控制揭示信号通路变化，为癌症治疗策略提供新见解。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

资助：Novartis FreeNovation、NCCR 和 EPFL。

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

由 REX 技术推动发现的同工型特异性小分子激酶抑制剂已提交专利申请

本方案中描述的Z-REX技术为在活体鱼类中研究亲电分子-靶点配对及信号通路解析提供了一种可靠的策略。通过邻近导向递送，可实现对亲电化合物处理的剂量和空间控制。与传统一次性大剂量给药方法不同，传统方法中使用的超生理浓度亲电分子常导致脱靶效应，而Z-REX系统仅向体系释放微量亲电分子，因而基本无创。我们在斑马鱼胚胎中使用了0.1–6 µM的Ht-PreHNE(alkyne)，结果表明该处理对胚胎发育无不利影响11。
Z-REX 实验通常比 T-REX 更耗时，后者是一种用于在培养细胞中筛选或研究亲电分子感应蛋白的技术。如果实验目的是筛选亲电分子与靶标蛋白的相互作用，我们建议首先在培养细胞中通过 T-REX 进行广泛的筛选，再利用 Z-REX 进行体内验证以及表型/通路分析。与细胞培养相比，Z-REX 实验除了需要具备 T-REX 所要求的生化实验技能外，还需掌握基础的斑马鱼饲养技术。Z-REX 实验的典型周期（从斑马鱼交配到光诱导亲电分子递送）为 2 至 3 天，仅比转染活细胞的典型 T-REX 实验多出不超过 1 天。表型分析的活体成像可在光照后 2 至 10 小时内进行；用于下拉实验的生物素-叠氮化物点击偶联需 3 天；检测转录响应的定量逆转录 PCR（qRT-PCR）需 3 天；免疫荧光染色（IF 染色）需 5 天。这些步骤大致与细胞培养中的对应操作相似，但数据分析时需结合斑马鱼生理学特性及报告基因品系的特点进行解读。
作为一种多变量实验方法12，Z-REX 需要设置多个对照组以排除实验结果中的不确定性（图 1D）。常见的对照组包括：（1）仅使用 DMSO/溶剂处理；（2）使用探针处理，但不进行光照；（3）进行光照，但不使用探针处理；（4）P2A 分裂型构建体，其中 Halo 标签与目标蛋白（POI）分别表达，从而阻断邻近递送效应；以及（5）功能部分缺失的突变体，其亲电分子感应残基发生突变，例如 Akt3 (C119S)6 和 Keap1 (C151S, C273W, C288E)5，这些突变体已在我们先前的研究中使用。
如果下游实验涉及蛋白质印迹分析，则必须在收获前进行去卵黄处理。卵黄蛋白会影响裂解液浓度测定的准确性，并可能非特异性地结合抗体。在进行活体鱼类成像或整体免疫荧光染色时，我们也观察到卵黄囊中存在非特异性荧光信号，这可能是由于卵黄囊内源性自荧光蛋白所致，或源于抗体本身的非特异性结合。如果自荧光信号干扰目标信号，我们建议在定量分析中排除卵黄囊区域，或对不同区域分别进行定量。活体鱼类成像和整体免疫荧光染色实验必须进行去膜处理。卵膜会干扰成像效果，并影响后续的定量或细胞计数。然而，去膜仅适用于发育超过1天的胚胎（1 dpf以上）；处于囊胚期、原肠胚期或体节期的较年轻胚胎过于脆弱，不宜去膜。
本文所述的 Z-REX 技术基于 mRNA 驱动的外源性目的蛋白（POI）表达。与使用或构建转基因鱼系相比，该方法更为快速。mRNA 驱动的表达具有广泛性和瞬时性，在本方案所用的 mRNA 中至少可持续表达 2 天。然而，在其他情况下，表达持续时间可能有所不同。因此，该方法为研究特定亲电分子标记事件的影响提供了一个快速且更全面的观察窗口，并可与多种高通量/高内涵检测方法兼容。在特定组织中稳定表达 Halo-POI 的转基因鱼系也可与 Z-REX 兼容11。当需要提出更精确的科学问题时，此类鱼系尤为适用，例如，当细胞培养数据预测某一特定器官会出现表型，或 mRNA 注射实验的筛选结果提示某一特定器官对亲电分子标记事件敏感时。在我们先前的研究中，已利用 Tg(gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) 鱼证明了通过 Z-REX 实现心脏特异性的抗氧化反应诱导11。此外，也有可能在大于 2 dpf 的转基因鱼中进行 Z-REX 实验。

大量的细胞信号传导事件涉及小分子活性物质（在细胞内源性产生或外源性物质/异源代谢物，如药物）与其靶蛋白之间的反应。在许多情况下，此类共价结合事件即使在亚化学计量水平下也能触发细胞反应，从而导致发育、代谢、凋亡和/或免疫反应等方面的变化1。然而，将特定的结合事件与其表型后果相联系以解析其作用机制（MOA）已被证明具有挑战性。传统的脉冲式给药方法通常需要引入高浓度的活性物质，这往往会导致大量蛋白质被修饰，并对模式生物产生过度毒性2。此类条件远非理想。为解决这些问题，已开发出一种在天然细胞环境中实现精确定位递送亲电试剂的方法，称为T-REX（可靶向反应性亲电试剂与氧化剂）3。在此之后的数年中，研究重点已转向整体生物体实验，从而能够在非转化细胞中特定的细胞环境下研究蛋白质功能。因此，我们已将该技术拓展至多种模型系统，包括斑马鱼（Danio rerio）胚胎模型。本文中，我们介绍Z-REX（斑马鱼可靶向反应性亲电试剂与氧化剂）（图1）。
为了理解Z-REX，本文首先介绍REX技术及其基本原理。这些技术的核心在于通过模拟天然亲电分子的局部生成方式，来模拟内源性生理活性亲电物种（RES）的信号传导过程。 体内 以时空精确的方式进行。目的蛋白（POI）被表达为与Halo标签融合的构建体；Halo标签以1:1的化学计量比锚定一种组织通透性良好且惰性的探针，该探针携带光笼型活性脂质过氧化物（RES）。一种典型的内源性RES是4-羟基壬烯醛（下文简称HNE），其被光笼化于探针Ht-PreHNE中。在多数情况下，我们使用一种带有炔基修饰的HNE版本［即HNE(炔基)］，其生物学性质与HNE基本相同，但可通过点击化学进行标记。该探针同时带有氯代烷基以实现与Halo标签的共价结合，称为Ht-PreHNE(炔基)。Halo-POI融合蛋白与该探针形成的复合物可在紫外光照射下，将释放的RES递送至融合的POI附近。若POI能迅速与释放的RES发生反应，则POI会被RES共价标记，从而使得我们能够鉴定出具有动力学优势的半胱氨酸残基。
Z-REX 采用了上述 REX 技术的优点，并将其广泛应用于活体鱼类中特定信号通路的研究。该方案已针对斑马鱼（D. rerio）进行了优化，因为它们是遗传操作便利的脊椎动物，在发育过程中具有透明性，因此非常适合应用于 REX 等光化学/光遗传学技术。然而，由于该方法的广泛适用性源于脂质来源的亲电试剂（LDE）递送的伪分子内机制，类似的策略也可能在其他遗传操作便利的鱼类物种中有效。事实上，该方法具有高度的生物相容性，鱼类可在至少 48 小时内接受 Z-REX 光笼化亲电试剂 [例如 Ht-PreHNE(alkyne)] 处理，而对发育无任何明显影响。类似方案已在 C. elegans4,5 中成功应用。
本方案首先描述了在受精后1-1.5天（dpf）的斑马鱼胚胎模型中，通过mRNA注射实现外源Halo-POI融合蛋白的瞬时表达。这种方法可在斑马鱼大多数细胞中表达异位蛋白（下文称为“泛在性”表达），而非局限于特定组织或部位；然而，实验数据表明在某些情况下仍可观察到细胞类型特异性的效应。注射后，胚胎在低浓度探针[0.3–5 µM Ht-PreHNE(alkyne)]中孵育，直至受精后30.5小时（hpf）。随后，在用户设定的时间点，通过2-5分钟的光解反应将反应性效应分子（RES）递送至鱼体内的靶蛋白（POI）。光解释放RES后，可在接下来的2-10小时内开展多种下游表型分析：1）报告基因品系的活体成像（图2A）；2）通过蛋白质印迹法评估靶标标记效果（图3）；3）转录组分析（图4）；或4）整体免疫荧光染色（图5）。
以报告基因系的活体成像为例，Z-REX 与 Tg(lyz:TagRFP) 和 Tg(mpeg1:eGFP) 鱼系的活体成像联用，用于检测对特定亲电性传感器靶蛋白（即 Keap1）进行可逆共价修饰（RES）后，中性粒细胞和巨噬细胞水平分别降低的情况，且在鱼类中未观察到对其他细胞的明显影响。然而，我们此前已证明，通过 Z-REX 技术可重现 T-REX 研究中靶蛋白标记及其下游信号通路的激活效果，适用于多种蛋白，包括 Akt36、Keap17 和 Ube2v26。总体而言，利用 Z-REX，科研人员可在多种复杂的氧化还原通路背景下，研究靶蛋白（POI）经由可逆共价修饰（RES）后所产生的生物学效应。该技术有助于在更具生理相关性的整体动物模型中，精确定位共价药物设计的靶点及其功能关键残基，并揭示新型药物的作用机制。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇（BME）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>All Blue 预染蛋白标准品</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>生物素-dPEG11-叠氮</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 染料</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800（IF）</td></tr><tr><td>驴抗兔-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000（IF）</td></tr><tr><td>驴抗大鼠-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000（IF）</td></tr><tr><td>ECL 底物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>ECL-Plus 底物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>端对端旋转仪</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>镊子（钝头）</td><td>自制</td><td></td><td>通过将锐利镊子（Fine Science Tools，Dumont #5，11252-40）钝化自制</td></tr><tr><td>镊子（锐头）</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5，11252-40</td><td></td></tr><tr><td>凝胶上样吸头</td><td>Fisher</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>凝胶/印迹成像仪</td><td>Vilber</td><td>Fusion FX 成像仪</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>玻璃载物台测微尺</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>加热超声波水浴</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>高容量链霉亲和素琼脂糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE 炔探针</td><td>自制</td><td>-</td><td>Parvez, S. 等. T-REX 活细胞中按需氧化还原靶向. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>成像板（10% HBSS 缓冲液，用于活胚胎）</td><td></td><td></td><td>使用培养皿和含 2% 琼脂糖的 10% HBSS 缓冲液制备</td></tr><tr><td>成像板（PBS，用于甲醛固定的胚胎）</td><td></td><td></td><td>使用培养皿和含 2% 琼脂糖的 PBS 制备</td></tr><tr><td>注射板</td><td></td><td></td><td>使用显微注射模具、培养皿和含 2% 琼脂糖的 10% HBSS 缓冲液制备</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>显微注射模具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>微量加样器吸头（Microloader tips）</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>显微注射显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>显微镜光源</td><td>Olympus</td><td>&amp;nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;beta;-肌动蛋白-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000（WB）</td></tr><tr><td>小鼠抗 HaloTag 抗体</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500（IF）</td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>核酸琼脂糖凝胶电泳装置</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT 系统</td><td></td></tr><tr><td>寡聚(dT)20</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制：(dT)20</td><td></td></tr><tr><td>橙色G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&amp;nbsp;</td><td>自连</td><td>-</td><td>可从瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）Yimon AYE 教授课题组获取</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td>自连</td><td>-</td><td>可从瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）Yimon AYE 教授课题组获取</td></tr><tr><td>气动 PicoPump</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质电泳设备及耗材</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳系统</td><td></td></tr><tr><td>兔抗活化 Caspase-3 抗体</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800（IF）</td></tr><tr><td>大鼠抗 HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500（IF 和 WB）</td></tr><tr><td>大鼠抗 RFP 抗体</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800（IF）</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap RNA 去污染溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>摇床振荡器</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>叔丁醇</td><td>Sigma</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeVP 蛋白酶（S219V）</td><td>自制</td><td>-</td><td>Parvez, S. 等. T-REX 活细胞中按需氧化还原靶向. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>斑马鱼国际资源中心（ZIRC）</td><td>uwm11Tg（ZFIN）</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>斑马鱼国际资源中心（ZIRC）</td><td>gl22Tg（ZFIN）</td><td>-</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Analytik Jena</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>大豆（Glycine max）胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>365 nm 紫外灯</td><td>Spectroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>紫外光度计&amp;nbsp;</td><td>Spectroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western 印迹转膜设备及耗材</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot 或 Criterion Blotter&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼饲养与繁殖设备</td><td></td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>氧化锆珠</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

监测斑马鱼幼虫中的靶向信号响应——z-rex揭示亲电性药物与代谢物的精确作用机制

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

活性代谢物及相关亲电性药物是研究中最难处理的小分子之一。传统方法通过向实验样本大量施加特定活性物质，以解析此类分子的作用机制（MOA）。在这种方法中，亲电物的高反应活性会导致蛋白质组发生非选择性的标记，且该过程具有时间和环境依赖性；同时，氧化还原敏感的蛋白质和过程也可能受到间接且通常不可逆的影响。在存在大量潜在靶点和间接次级效应的背景下，将表型变化与特定靶点结合直接关联起来仍是一项复杂任务。斑马鱼靶向活性亲电物与氧化剂系统（Z-REX）是一种可在幼年斑马鱼中按需释放活性亲电物的递送平台，旨在将亲电物精准递送至活体斑马鱼胚胎中特定的目标蛋白（POI），同时保持生物体其他系统的未受干扰状态。该技术的关键特性包括侵入性极低，并可实现剂量、化学类型以及时空上的精确控制。因此，结合一系列独特的对照手段，该技术可避免在动物整体暴露于活性亲电物或具有多效性作用的亲电性药物时常见的脱靶效应和系统性毒性。利用Z-REX，研究人员能够在完整活体动物接近生理条件的情况下，建立研究基础，以阐明特定活性配体与特定POI结合后，个体应激反应和信号输出如何发生改变。

经 Z-REX 处理的转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼 Tg(lyz:TagRFP) 和 Tg(mpeg1:EGFP) 的活体成像。通过 Keap1 的 HNE 化修饰诱导中性粒细胞/巨噬细胞凋亡。（另见 图 2）。通过向来自 Tg(lyz:TagRFP) 或 Tg(mpeg1:EGFP) 的杂合转基因胚胎注射编码 Halo-Keap1 的 mRNA，随后用 Ht-PreHNE(alkyne) 处理，评估 Keap1 亲电标记对中性粒细胞和巨噬细胞水平的影响。按照步骤 6.1 的下游检测方案选项 1 操作，释放 HNE(alkyne) 并实现对 Keap1 的标记。分别通过活体成像观察报告基因品系 Tg(lyz:TagRFP) 和 Tg(mpeg1:eGFP) 来评估中性粒细胞和巨噬细胞的水平。在 Z-REX 处理后（HNE 递送至 Keap1），两类细胞的数量均减少了 30%–40%。相反，在 Z-REX 技术对照组中（无光照且无 Ht-PreHNE(alkyne)、仅光照、或仅 Ht-PreHNE(alkyne)）未观察到中性粒细胞或巨噬细胞的减少（图 1D 和 图 2A–D）。
中性粒细胞/巨噬细胞凋亡的诱导表明，通过 Z-REX 将 HNE 成功递送至 Keap1。有关通路分析及凋亡机制的详细信息已有发表5。为排除 HNE(alkyne) 的脱靶效应，设置了多个对照组。（1）在相同实验条件下，胚胎注射 Halo-P2A-Keap1 mRNA 代替 Halo-TeV-Keap1 mRNA。P2A 连接肽使 Halo 与 Keap1 蛋白独立表达。在此情况下，Halo 释放的 HNE(alkyne) 无法标记 Keap1，因其不再与 Halo 相邻（图 1D）；因此，未触发凋亡信号通路。该组中未观察到巨噬细胞或中性粒细胞水平的变化（图 2A、B）。（2）使用编码 Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E) 的 mRNA 进行相同实验，该 Keap1 突变体对 HNE(alkyne) 不产生响应（图 1D）。该组中亦未观察到巨噬细胞或中性粒细胞水平的变化（图 2G、H）。
生物素叠氮化物点击偶联与生物素下拉实验。靶向标记效果评估。（另见图3）。靶向标记效果评估使用野生型胚胎进行，胚胎中注射了编码Halo-TeV-Keap1-2xHA（Halo-POI融合构建体）或Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA（P2A分体构建体，其中Halo与Keap1未融合；图1D）的mRNA。仅在表达融合蛋白并经Z-REX处理的组别中成功下拉出标记的Keap1蛋白（上图抗HA印迹的第二泳道），而在其他对照组（未注射mRNA、融合构建体未加Z-REX处理、或P2A分体构建体）中均未检测到。结果表明，HNE(alkyne)已成功递送至Keap1，修饰后的Keap1通过点击化学反应与生物素共价连接，随后生物素标记的Keap1被链霉亲和素树脂有效下拉。
转录分析。RNA-seq 与 qRT-PCR。（另见图4）。Z-REX处理后的转录变化通过RNA-seq和qRT-PCR进行评估。在RNA-seq中，多个免疫相关基因在Z-REX处理后表达下调。相反，许多抗氧化反应（AR）相关基因表达上调，这是由于Keap1发生HNE化修饰后激活了Keap1-Nrf2-AR通路所致10（图4A）。在qRT-PCR分析中，检测三个免疫相关基因（lyz、mpeg1.1 和 coro1a）时也获得了类似结果（图4B）。相应基因的上调与下调表明，由Keap1 HNE化介导的信号通路成功被激活。
整体免疫荧光染色实验及共定位分析。（另见图5）。通过整体免疫荧光（IF）染色检测外源表达的Halo-TeV-Keap1-2xHA和Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA（图5A、B）。P2A分裂构建体的HA标签数量是TeV融合构建体的两倍，因此在注射P2A分裂构建体mRNA的组中，抗HA信号强度约为另一组的两倍，表明两种构建体的表达水平相似（图5C）。使用抗Halo抗体检测时，Halo-TeV-Keap1（wt）与Halo-TeV-Keap1（C151S,C273W,C288E）的表达水平也相似（图5D、E）。通过抗RFP与抗活化型Caspase 3共免疫染色，在Z-REX处理的Tg(lyz:TagRFP)胚胎中观察到中性粒细胞与活化型Caspase 3的共定位（图5F）。活化型Caspase 3是细胞凋亡事件的标志物。
<img alt="斑马鱼-REX 示意图；mRNA 微注射、光触发标记、转录组学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：Z-REX 工作流程。（A, B）在 1–4 细胞期的斑马鱼胚胎中注射编码 Halo-POI（例如 Halo-Keap1）的 mRNA（及吗啉寡聚物）。注射后的胚胎用一种探针处理，该探针由 HaloTag 配体和连接炔基官能团的光笼型亲电物组成，如图 B 中的 Ht-PreHNE(alkyne)。去除过量探针后，将胚胎暴露于光照下，以释放目标亲电物［例如 HNE 或其类似物 HNE(alkyne)］。下游分析在设定的/用户自定义的时间点进行。（C）Ht-PreLDE 探针的设计与作用机制，该探针可适用于多种脂质来源的亲电物（LDE）。（D）Z-REX 的阴性/技术对照组。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在Z-REX下对斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞进行活体成像及追踪，ANOVA图示分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：对经 Z-REX 处理的转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼进行活体成像。 Z-REX介导的Keap1 HNE化修饰诱导中性粒细胞/巨噬细胞凋亡。A代表性图像 Tg(lyz:TagRFP) 表达Halo-TeV-Keap1（融合构建体）或Halo-P2A-Keap1（分裂构建体）的斑马鱼胚胎，在阴性对照条件下处理（无处理、仅光照、仅Ht-PreHNE(alkyne)或Z-REX）。胚胎年龄：36 hpf。B中性粒细胞水平的定量分析 A. (C代表性图像 Tg(mpeg1:eGFP) 表达Halo-TeV-Keap1的斑马鱼，经或未经Z-REX处理。胚胎年龄：34 hpf。D巨噬细胞水平的定量分析 C. (E，F) 时间过程测量（E）中性粒细胞和（F) Z-REX 处理后巨噬细胞水平。 (G) 与图中所示实验类似的实验 A 在表达 Halo-TeV-Keap1（WT）或 Halo-TeV-Keap1（C151S, C273W, C288E）（一种不具备HNE感应能力的突变体）的鱼类中。H) 中性粒细胞水平的定量分析 G比例尺： 500 µm所有图表均以均值 ± 标准误（SEM）表示。 p 使用单因素方差分析（蓝色）和双尾学生t检验（黑色）计算数值。该图已根据Poganik等人修改。7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="链霉亲和素下拉、蛋白质相互作用示意图；Keap1-Halo 检测、印迹分析、TEV 切割。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：生物素下拉实验。 表达 Halo-TeV-Keap1-2XHA 或 Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA 的野生型胚胎经 Z-REX 处理或相应的阴性对照条件（本实验中为无探针处理）处理。收集胚胎后进行裂解，并在进行生物素下拉实验前用 TEV 蛋白酶处理。结果通过蛋白质印迹分析。该图改编自 Huang 等. Z-REX：引导反应性亲电体靶向特异性或广泛表达的蛋白质，并记录幼鱼中由亲电体诱导的功能性氧化还原反应。该图改编自 Huang 等.11。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="火山图和条形图显示Z-REX处理后免疫反应相关基因表达的变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4转录分析 (AZ-REX处理与未处理胚胎的RNA-seq结果。具有统计学显著差异表达（SDE）的基因已标出。免疫相关SDE基因以红色标注，抗氧化反应（AR）相关基因以绿色标注，其他SDE基因以蓝色标注。全部 p 数值使用 CuffDiff 计算得出。B-D) 三个与免疫相关的 SDE 基因 A: (B) lyz, (C) mpeg1.1，以及（D) coro1a 进一步通过qRT-PCR进行分析，仅Z-REX处理的胚胎显示出这些转录本的抑制。所有图表均以均值±标准误（SEM）表示。 p 数值通过单因素方差分析（蓝色）和双尾 Student t 检验（黑色）计算得出。该图改编自 Poganik 等人。7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="整体免疫荧光成像；斑马鱼；HaloTag；AlexaFluor；蛋白质表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5全组织免疫荧光染色实验 (A，B) 表达以下任一物质的胚胎代表性图像（A) Halo-TeV-Keap1-2xHA 或 (BHalo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA 经抗 HA 抗体及 AlexaFluor568 标记的二抗免疫染色。将 mRNA 注射鱼类与同龄未注射鱼类进行比较。C) 流感血凝素（HA）抗体信号的定量分析A，B). (D) 表达 Halo-TeV-Keap1（WT）或 Halo-TeV-Keap1（C151S, C273W, C288E）的胚胎经抗 Halo 抗体及 AlexaFluor647 标记的二抗免疫染色后的代表性图像。将 mRNA 注射的斑马鱼与同龄未注射的斑马鱼进行比较。E) 抗Halo信号的定量分析 D. p 采用双尾 Student's t 检验计算值。 (F) Tg(lyz:TagRFP) 经Z-REX处理的胚胎用抗RFP抗体和抗活化Caspase 3抗体进行共免疫染色，并孵育相应的荧光标记二抗。白色方框标示放大区域。白色箭头指示中性粒细胞与活化Caspase 3的共定位。比例尺： 500 µm所有图表均以均值 ± 标准误（SEM）表示。此图改编自 Poganik 等。7。以及 Huang 等人.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充表 1：本研究中使用的缓冲液列表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

斑马鱼靶向反应性亲电体和氧化剂（Z-REX）是一种基于化学生物学的方法，用于研究反应性小分子信号传导。该技术可应用于不同发育阶段的活体斑马鱼。在此，我们将斑马鱼中的标准检测方法与Z-REX相结合，用于信号通路分析。

监测斑马鱼幼虫中的靶向信号响应——Z-REX揭示亲电性药物与代谢物的精确作用机制

活性代谢物及相关亲电性药物是研究中最难处理的小分子之一。研究这类分子的传统方法涉及对……的拆解

因此，利用Z-REX技术，研究人员可以在接近生理条件的斑马鱼幼体中，探究特定反应性配体与特定目标蛋白结合后，个体信号响应如何发生变化。传统方法通常使用大量反应性小分子，易导致脱靶效应和毒性，且无法控制配体与靶标的特异性结合。而Z-REX能够以高时空精度将特定配体-靶标结合事件与特定表型关联起来。我们最近的研究表明，通过Z-REX发现的反应性代谢物HNE及其相关靶点和通路，能够推动开发针对三阴性乳腺癌的精准亚型特异性激酶抑制剂。首先，将胚胎排列在注射板的凹槽中，注射板内需加入新鲜的10%汉克平衡盐溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）。将针尖浸入溶液中，必要时施加注射脉冲以排除针尖内的气泡。注射胚胎时，以单次动作穿透绒毛膜和卵黄囊，并施加一次注射脉冲。注射其余胚胎后，使用冲洗瓶将其冲洗至含有新鲜HBSS培养基的新培养皿中。将未注射的胚胎收集到另一个培养皿中。为进行Z-REX处理分析，首先将注射后的胚胎分配至10厘米培养皿中。在红光照射的暗室中，将培养基更换为 30 毫升含或不含 1 微摩尔 REX 探针的 10% HBSS。将胚胎在黑暗条件下于 28.5 摄氏度孵育。受精后 30 小时，在黑暗条件下更换培养基。重复孵育和更换培养基两次后，将胚胎暴露于预热的紫外灯照射下，每隔30秒轻轻摇动。进行表型分析时，从含有麻醉后胚胎的培养板中移除未受精或已死亡的胚胎。使用尖头镊子去除胚胎的卵膜。将胚胎置于用10% HBSS培养基制备的2%琼脂糖平板上，在体视显微镜下观察。使用ImageJ软件计数每条鱼的中性粒细胞和巨噬细胞数量。选择“自由手选区”工具圈选整条鱼，然后选择“寻找最大值”选项以计数荧光细胞。本研究中，经Z-REX处理的胚胎表现出中性粒细胞和巨噬细胞的减少。该效应在未处理组中不存在。Halo-P2A-Keap1组中未激活凋亡信号通路，导致巨噬细胞和中性粒细胞水平未发生改变。在不响应HNE的Halo-TEV-Keap1突变体中也观察到类似结果。转录组和实时定量PCR分析显示，Z-REX处理后免疫相关基因表达下调，抗氧化基因表达上调。免疫荧光染色结果显示，P2A分裂型构建体的HA标签数量是TeV融合型构建体的两倍，表明两者表达水平相似。野生型和突变型Halo-TeV-Keap1的表达水平也相近。在经 Z-REX 处理的转基因中性粒细胞报告细胞系中，也观察到中性粒细胞与活化型半胱天冬酶 3 的共定位现象。最重要的是确保你的文件设置正确。限制性条件将显著改善你的实验结果。我们采用了Z-REX技术，这一理念已被应用于一种名为Localis-REX的药物筛选平台。迄今为止，尚无其他技术能够实现如此局部特异且可响应的配体或靶点定位。该技术已帮助我们开发出用于治疗乳腺癌的亲电性候选药物。鉴于局部信号传导在癌症、免疫学、衰老等多个领域的重要性日益增加，Z-Rex 作为唯一能够绘制局部反应性配体导向事件的工具，有望为众多领域提供重要支持。

monitoring-on-target-signaling-responses-larval-zebrafish-z-rex

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

监测斑马鱼幼虫的靶向信号反应 - Z-REX 揭示亲电药物和代谢物的精确机制

本文介绍了一种对斑马鱼胚胎中组织特异性荧光进行半自动化成像的实验方案。...

斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

斑马鱼是研究脊椎动物发育过程和人类疾病模型的优良实验生物。本文描述了一种在斑马鱼胚胎中进行全胚胎手动高通量化学筛选的实验方案 原位...

一种接近高通量的斑马鱼胚胎小分子手动筛选方法

我们介绍一种利用显微操作和视网膜电图（ERG）技术对斑马鱼幼鱼进行视网膜电图分析的方法。该方法简便直接，适用于检测斑马鱼幼鱼的视觉功能。 体内.

斑马鱼幼鱼视觉反应的视网膜电图分析

本文介绍了一种利用自动化追踪软件检测幼年斑马鱼和黑头软口鲦鱼运动活动及光运动反应（PMR）的实验方案。将这些行为分析整合到常规毒理学生物测定中，可作为检测化学物质生物活性的诊断工具。本方案以咖啡因为例进行说明，咖啡因是一种模型神经兴奋剂。...

检测幼鱼行为反应谱的实验方案：以神经兴奋剂咖啡因为例

本文介绍了一种斑马鱼癫痫模型的建立与表征方案，该模型源于对DEPDC5基因的瞬时抑制。...

癫痫斑马鱼模型中的行为与生理学分析

斑马鱼胚胎可用于评估化学化合物的毒性。其胚胎体外发育，对化学物质敏感，能够检测出细微的表型变化。该实验仅需少量化合物，可直接加入含有胚胎的培养板中，使检测系统高效且经济。...

利用斑马鱼胚胎快速评估化学化合物的毒性

本文介绍了载药脂质体的合成方法及其向幼年斑马鱼的显微注射，旨在将药物递送至巨噬细胞谱系细胞。...

将载药脂质体注射入幼年斑马鱼巨噬细胞以实现药物靶向

我们描述了一种基于斑马鱼胚胎振动惊吓反应的化学化合物毒性评估筛选系统的工作流程和数据分析方法。该系统记录斑马鱼胚胎在受到振动刺激时的运动反应，可对总体毒性/致死性以及神经肌肉毒性进行综合评估。...

利用斑马鱼振动惊吓反应筛选系统评估化学品的毒性

本方案描述了一种在受精后3至7天的斑马鱼幼鱼中进行药物筛选并随后进行形态学评估的实验流程。...

早期斑马鱼幼鱼中的小分子筛选与毒性检测

RAS病是一类由RAS-MAPK信号通路过度激活引起的多系统遗传综合征。随着大量潜在致病变异不断被发现，亟需对其进行功能验证，然而临床前证据的缺乏限制了治疗策略的开发。本文中，我们描述了一种在Teen-报告基因斑马鱼中通过活体FRET成像检测RAS病相关ERK活化水平及其在胚胎发育过程中药物调控作用的体内实验方案。...

一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

了解Z-REX技术如何精确分析斑马鱼幼虫中亲电药物与靶蛋白的相互作用机制。该方法通过时空精准控制揭示信号通路变化，为癌症治疗策略提供新见解。

监测斑马鱼幼虫中的靶向信号响应——Z-REX揭示亲电性药物与代谢物的精确作用机制

探索更多视频