网络药理学预测与实验验证 栝楼属-Fritillaria thunbergii 肺腺癌作用机制

传统中医药，我们将讨论其多组分作用于多靶点的特性。这是网络生物学研究最基础的核心内容。我们展示了相关技术，可有效降低研究门槛。

网络药理学是一种系统性分析技术，用于构建多因素相互作用网络的分析工具。它能够有效预测中药的单一作用通路。网络药理学的数据来源于数据库，尽管其尚无法准确预测药物与蛋白质之间的相互关系，仍需通过后续实验加以验证。首先，打开HERB数据库，以瓜蒌和浙贝母为关键词，获取这两种药物的化学成分。

下载这两种药物相关组分的列表及其规范SMILES结构。现在通过HERB数据库中具有口服生物利用度和类药性参数的组分，判断所获得的组分是否具有活性。若该组分无口服生物利用度和类药性参数，则将其输入Swiss ADME数据库，以获取各组分的相关信息。

选择具有高胃肠道吸收率且至少具有两个“是”类药物性质值的成分为活性成分。为预测活性成分的作用靶点，打开HERB数据库，搜索并复制活性成分的标准SMILES结构。

然后打开相似性集合分析方法（similarity ensemble approach），将活性成分的标准SMILES结构粘贴到搜索框中。点击“try SEA”以获取每个活性成分的作用靶点名称、P值以及最大TC值。将数据复制到电子表格中，并利用电子表格的筛选功能，根据靶点关键词对活性成分的作用靶点进行筛选。

将所有靶点复制到电子表格中，并去除重复项以获得药物靶点。现在打开 GeneCards 数据库和在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man），以预测疾病相关靶点。使用“肺腺癌”作为关键词，获取肺腺癌的疾病靶点。

下载疾病靶点的电子表格，删除重复的靶点，获得肺腺癌靶点。新建一个电子表格，将肺腺癌相关靶点和药物靶点复制到同一列中，构建药物成分-疾病靶点网络。利用工具栏中的“数据识别重复项”功能，获取肺腺癌相关靶点与瓜蒌贝母忍冬活性成分相关靶点的交集靶点。

打开 Cytoscape 3.8.0。点击菜单栏中的“文件”，然后选择“导入”，接着选择“从文件导入网络”。

要导入电子表格文件，请通过左侧控制面板中的样式栏优化网络节点的大小和颜色。使用“分析网络”功能进行网络拓扑分析。在菜单栏中点击“工具”，然后选择“分析网络”。

在表格面板中，单击标题栏中的“degree”以按度值降序排列各成分。选取前10个成分为主要活性成分和核心靶点，用于构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选核心蛋白。

打开字符串数据库，将瓜蒌贝母威灵仙对抗肺腺癌的潜在靶点的文本格式列表粘贴到“名称”对话框中的列表内。然后在生物体中选择 Homo sapiens。点击搜索并选择继续按钮；当结果显示后，点击设置，在基本设置中勾选“高置信度（0.700）”，在最低必需相互作用评分下勾选网络中的高离散节点，在高级设置中进行相应配置。

然后点击更新按钮。接下来，点击标题栏中的“exports”并下载以 TSV 格式保存的 PPI 关系的简短表格文本。打开 Cytoscape 3.8.0。

单击文件，选择“导入”，然后选择“从文件导入网络”，以导入TSV格式文件进行可视化分析。使用网络分析器功能进行拓扑分析。通过左侧控制面板中的样式栏优化网络节点的大小和颜色。

通过打开 Medscape 平台，将潜在治疗靶点的文本格式列表粘贴到对话框中，然后点击“提交”按钮，进行 KEGG 富集分析。在“输入物种”和“分析物种”中均勾选 Homo sapiens，然后点击“自定义分析”按钮。选择“富集分析”。

仅勾选KEGG通路，然后点击富集分析。当进度条达到100%后，点击分析报告页面的橙色按钮以查看富集结果。点击“all in one zip file”下载富集结果，然后打开“Enrichment_GO”文件夹中的“_FINAL_GO.csv”文件以获取结果。

打开 R 软件，输入命令 install package GG plot two 和 library GG Plot two 以安装 GG plot two R 软件包。按回车键运行 KEGG 可视化程序。为检测细胞活力，将处于对数生长期的 A549 细胞用 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶在 37 摄氏度下消化 1 分钟。

加入1 mL DMEM完全培养基以中和胰蛋白酶，并轻轻吹打促进细胞脱落。随后离心混合液以获得细胞沉淀，并用DMEM完全培养基重悬所得细胞。将细胞悬液加入血细胞计数板，使用自动细胞计数仪进行计数，再用DMEM完全培养基稀释至5 × 10⁴ 个细胞/mL。现在将1克瓜蒌贝母乌蔹莓水提取物溶解于10 mL PBS中，通过0.22 µm滤器过滤除菌。

用 PBS 将混合物稀释至不同浓度。取 100 µL 稀释后的细胞悬液加入 96 孔板的每个孔中。待细胞贴壁后，向各孔中加入 1 µL 不同浓度的瓜蒌贝母天葵子水提取物，以调节每孔的终浓度。

培养 24 小时后弃去原培养基，加入 100 µL DMEM 基础培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 2 小时。孵育结束后，加入 20 µL MTS 溶液，再将细胞孵育 1 小时。

将孵育后的混合物转移至另一块培养板。使用酶标仪在490纳米波长下测定吸光度，并计算细胞活力。将处于对数生长期的A549细胞稀释至每毫升5×10⁵个细胞。

向六孔板中加入2毫升细胞悬液，培养12小时。按照之前的方法制备不同稀释度的瓜蒌贝母天葵子水提液后，向空白对照组加入20微升PBS溶液，向不同浓度组分别加入20微升瓜蒌贝母天葵子水提液的不同稀释液。干预24小时后，弃去上清液，并用PBS清洗细胞3次。

向每个孔中加入 250 µL RIPA 裂解缓冲液，裂解细胞 30 分钟。收集裂解液进行离心，获取上清液。栝楼贝母威灵仙对抗肺腺癌的药物成分-疾病靶点相互作用网络如下所示。

在相互作用网络中，获得的前10个活性成分是瓜蒌贝母威灵仙治疗肺腺癌作用的关键活性成分。该PPI网络包含122个功能蛋白和210个相互作用关系。前10个核心蛋白主要参与新生血管形成、细胞增殖、凋亡以及细胞膜转运过程。

根据KEGG通路富集分析排名前20的通路中，PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、磷脂酶D信号通路和MAPK1信号通路均与肺癌密切相关，其中PI3K-AKT通路排名首位。栝楼贝母忍冬提取物在浓度超过400微克/毫升时可抑制细胞增殖，当浓度达到800微克/毫升时，对A-549细胞的抑制作用接近半数抑制浓度。各实验组经栝楼贝母忍冬提取物干预后，AKT蛋白表达水平未见显著变化。

然而，p-AKT Serine-473 的表达受到抑制，并呈现出剂量依赖性效应。对瓜蒌贝母忍冬的主要成分与PI3K AKT通路关键蛋白进行了分子对接，结果表明木犀草素和山奈酚与AKT1的结合能均小于负七，提示具有较强的结合活性。最重要的是实现了中药活性成分对靶点的作用。

以及网络药理学的核心靶点。