Name: 毛滴虫对肺腺癌作用机制的网络药理学预测及实验验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:35:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 探索网络药理学方法预测栝楼-浙贝母治疗肺腺癌的作用机制，并通过实验验证PI3K/AKT信号通路的关键作用。该研究为中药现代化研究提供了系统性分析策略。

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本研究由北京中医药大学创新训练计划（编号：202110026036）资助。

所有网络药理学操作均按照《网络药理学评价方法指南》18进行。所有实验操作均遵循北京中医药大学实验室管理规定。
1. 网络药理学预测
<ol>
	<li>活性成分的筛选
	<ol>
		<li>打开HERB数据库（http://herb.ac.cn）19，并使用 &#34;瓜蒌&#34; （中文名称为 栝楼 Maxim) 和 &#34;浙贝母&#34; （Bulbus 的中文名称） 贝母）作为关键词，获取这两种药物的组分。下载这两种药物相关组分的列表及其标准SMILES结构。</li>
		<li>确定所获得的组分是否为活性组分。
		<ol>
			<li>在HERB数据库中筛选具有口服生物利用度（OB）和类药性（DL）的活性成分（即OB ≥ 30% 且 DL ≥ 0.18 的成分）20,21.</li>
			<li>若该组分无OB和DL值，将其输入Swiss ADME数据库（http://www.swissadme.ch/index.php）22&#160;获取各组分的相关信息。将具有“高”胃肠道吸收率且至少有两个“是”类药性（DL）值的组分纳入活性组分。&#8203;</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活性成分的靶点预测
	<ol>
		<li>打开HERB数据库（http://herb.ac.cn），搜索并复制活性成分的规范SMILES结构。</li>
		<li>打开SEA（相似性整合分析方法，http://sea.bkslab.org）数据库23. 将活性成分的规范SMILES结构粘贴到搜索框中，然后点击 尝试 SEA 以获取目标键、目标名称， P- 每种活性组分的值和最大TC。</li>
		<li>将数据复制到电子表格中，并使用电子表格文件的筛选功能，根据“靶点关键词”（人类）对活性成分的作用靶点进行筛选， P &#60; 0.05 和 MaxTC &#62; 0.5).</li>
		<li>将所有靶点复制到电子表格中，并去除重复项以获得药物靶点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>疾病靶点预测
	<ol>
		<li>打开 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）24&#160;以及在线人类孟德尔遗传数据库&#160;（OMIM，&#160;https://www.omim.org25&#160;并使用 肺腺癌 作为关键词，获取肺腺癌的疾病靶点。</li>
		<li>下载疾病靶点的电子表格。删除重复的靶点以获得LUAD靶点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物-成分-疾病-靶点网络的构建
	<ol>
		<li>将LUAD相关靶点和药物靶点复制到新电子表格的同一列中。使用 数据 - 识别重复项 使用工具栏中的功能获取LUAD相关靶点的交集靶点 栝楼-浙贝母 与活性成分相关的作用靶点</li>
		<li>打开 Cytoscape 3.8.0。点击 文件 在菜单栏中，然后选择 导入 &#62; 从文件导入网络 导入电子表格文件。通过左侧控制面板中的样式栏优化网络节点的大小和颜色。</li>
		<li>使用 分析网络 用于网络拓扑分析的功能。单击 工具 在菜单栏中，然后选择 分析网络. 在 表格 面板，单击 学位 在标题栏中按度值降序排列组分，选取前十个组分及对应靶点作为主要活性组分和核心靶点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质相互作用网络的构建及核心蛋白的筛选
	<ol>
		<li>打开 STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）26. 粘贴潜在靶点的文本格式列表&#160;栝楼-浙贝母 针对LUAD的 姓名列表 对话框。选择 Homo sapiens 在 生物体，然后单击 搜索 &#62; 继续 按钮。</li>
		<li>当结果可用时，点击 设置，和蜱虫 高置信度（0.700） 在 基本设置 &#62; 最低必需相互作用评分蜱虫 在网络中隐藏断开连接的节点 在 高级设置，然后点击 更新 按钮</li>
		<li>点击 导出 在标题栏中，下载以 TSV 格式呈现的 PPI 相互作用关系的简短表格文本。</li>
		<li>打开 Cytoscape 3.8.0。点击 文件 &#62; 导入 &#62; 从文件导入网络 导入TSV格式文件以进行可视化分析。</li>
		<li>使用 网络分析仪 使用该功能进行拓扑分析。通过左侧控制面板中的样式栏优化网络节点的大小和颜色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>KEGG 富集分析
	<ol>
		<li>打开 Metascape（https://metascape.org/）27 平台。将潜在治疗靶点的文本格式列表粘贴到对话框中，然后点击&#160;提交 按钮。勾选 H. sapiens 在两者中 输入为物种 和 物种分析，然后点击 定制分析 按钮。选择 富集，仅勾选 KEGG 通路，然后点击 富集分析进度条达到 100% 后，点击 分析报告页面 富集结果的橙色按钮。</li>
		<li>点击 全部内容打包为一个压缩文件 用于下载富集结果，然后打开 _ FINAL_GO.csv 文件中的 富集_GO 文件夹以获取结果。</li>
		<li>打开 R 软件（https://cran.r-project.org/）。输入 install.package&#34;ggplot2&#34;) 和 library (ggplot2) 在 R 中安装 ggplot2 R 包。按下 进入 运行KEGG可视化程序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验验证
<ol>
	<li>药物制备 
	注意： Fritillaria thunbergii Miq 和 Trichosanthes kirilowii Maxim 购自北京中医药大学附属东直门医院。
	<ol>
		<li>混合 50 g 的 Fritillaria thunbergii Miq 和 50 g 的 Trichosanthes kirilowii 将Maxim混合均匀，加入1 L蒸馏水浸泡20分钟，然后在常压下于100 °C煎煮1小时。</li>
		<li>使用双层无菌医用纱布过滤煎液，得到滤液，再用80 µm滤纸进一步过滤提取物。重复上述操作三次。</li>
		<li>将滤液混合，得到约1.2 L的煎液。将溶液置于旋转蒸发仪的烧瓶中，设置转速为50 rpm，温度为37 °C。在旋转蒸发仪中混合并浓缩煎液6小时，得到黏稠状液体提取物。</li>
		<li>开启真空冷冻干燥机，将温度预冷至−40 °C。将获得的提取物放入物料盘中，置于冷阱内进行冷冻。</li>
		<li>当冷阱温度降至−50 °C且样品已冷冻2小时后，将冷冻样品转移至置于冷阱中的干燥架上。开启真空泵，启动冻干程序。取出冻干粉末，于−20 °C冰箱中保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>配制含89% DMEM基础培养基、10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM完全培养基。</li>
		<li>从液氮中取出A549细胞后，将细胞置于37 °C水浴中孵育，并轻轻搅动，直至冻存管中的培养基完全融化。</li>
		<li>向融化的细胞中加入四倍体积的完全DMEM培养基。将细胞离心（4 °C，679 x g，5 分钟），弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀的细胞用6 mL DMEM完全培养基重悬，接种于T25培养瓶中，并将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞活力检测
	<ol>
		<li>用1 mL 0.25%胰蛋白酶在37°C消化对数生长期的A549细胞1分钟。加入1 mL DMEM完全培养基以中和胰蛋白酶，并轻轻吹打促进细胞脱落。离心收集细胞沉淀（4 °C，192 x g，5 分钟）。用 DMEM 完全培养基重悬所得细胞。</li>
		<li>将细胞悬液加入血细胞计数板，使用自动细胞计数器进行计数。将其稀释至 5 x 104 细胞/mL，使用DMEM完全培养基。</li>
		<li>溶解1 g的 栝楼-浙贝母 用10 mL PBS溶液溶解水提物，并通过0.22 µm滤器过滤除菌。用PBS将其稀释至90 mg/mL、80 mg/mL、70 mg/mL、60 mg/mL、50 mg/mL、40 mg/mL、30 mg/mL、20 mg/mL和10 mg/mL。</li>
		<li>将稀释后的细胞以每孔100 µL接种至96孔板中。待细胞贴壁后，每孔加入1 µL的 栝楼-浙贝母 将不同浓度的水提物调整至各孔浓度分别为 900 µg/mL、800 µg/mL、700 µg/mL、600 µg/mL、500 µg/mL、400 µg/mL、300 µg/mL、200 µg/mL 和 100 µg/mL。</li>
		<li>培养24小时后弃去原始培养基，加入100 µL DMEM基础培养基，在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育2小时2.</li>
		<li>上述处理后，加入20 µL MTS溶液（材料表），在37 °C、5% CO₂条件下将细胞再孵育1小时2.</li>
		<li>将孵育后的混合物转移至另一块板中。使用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度（OD）。根据以下公式计算细胞活力： 
		存活率（%）= 100 ×（处理样品的OD值 − 培养基的OD值）/（对照样品的OD值 − 培养基的OD值）。 
		注意：将接近 IC50 的最低浓度定义为高剂量；细胞增殖开始受到抑制的浓度定义为低剂量浓度，中间值则定义为中剂量浓度，用于后续实验研究。本研究中，低、中、高剂量分别采用 400 µg/mL、600 µg/mL 和 800 µg/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物干预与样本采集 
	注意：通过绘制细胞生长随时间的变化曲线来确定对数生长期。
	<ol>
		<li>将对数生长期的 A549 细胞稀释至 5 x 105 细胞/mL。将2 mL细胞悬液加入6孔板中，培养12 h。</li>
		<li>重复步骤 2.3.3，以获得 80 mg/mL、60 mg/mL 和 40 mg/mL 的 PBS 稀释液 栝楼-浙贝母 水提取物。加入20 µL PBS溶液和20 µL 40 mg/mL的 栝楼-浙贝母 水提取物，60 mg/mL 的 20 µL 栝楼-浙贝母 水提取物，以及 80 mg/mL 的 20 µL 栝楼-浙贝母 分别向空白对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组加入水提取物。干预24小时后弃去上清液，用PBS清洗细胞3次。 
		注意：空白对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组的浓度 栝楼-浙贝母 水提物的浓度分别为 0 µg/mL、400 µg/mL、600 µg/mL 和 800 µg/mL。</li>
		<li>向每孔中加入 250 µL RIPA 裂解缓冲液（含 1% PMSF 和 1% 磷酸酶抑制剂），冰上裂解 30 分钟。收集裂解液，4 °C、6,714 x g 离心 g，10 分钟），收集上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹法
	<ol>
		<li>根据制造商说明书，采用BCA法检测样品的蛋白浓度。使用RIPA缓冲液将各样品的浓度调整至一致。</li>
		<li>将40 µL蛋白样品与10 µL 5x上样缓冲液混合，于100 °C煮沸5分钟。离心（4 °C，6,714 x g，10 分钟）以获得上清液用于后续实验。</li>
		<li>使用120 V垂直电泳通过凝胶电泳分离蛋白质。</li>
		<li>准备电学实验 &#34;三明治&#34; （海绵 - 滤纸 - 凝胶 - PVDF膜 - 滤纸 - 海绵）。将转膜装置浸入冰浴中，于70 V条件下电转60分钟，使蛋白转移至PVDF膜上。</li>
		<li>使用 100 mL TBST 溶液（0.05% [v/v] Tween-20，10 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5）和 5 g 脱脂奶粉配制 5% 脱脂奶粉封闭液。用抗体稀释液将 AKT 和 p-AKT 抗体按 1:1,000 的比例进行预稀释。</li>
		<li>用5%脱脂奶粉溶液振荡封闭PVDF膜1小时。封闭后，弃去封闭液，加入稀释的一抗，4 °C过夜孵育。</li>
		<li>移除一抗后，用TBST溶液洗涤PVDF膜，每次5分钟，共洗五次。</li>
		<li>将二抗用抗体稀释液按1:5,000的比例预先稀释，加入稀释后的二抗溶液，室温孵育1.5小时。孵育结束后移除二抗溶液，用TBST溶液洗涤PVDF膜，每次5分钟，共洗涤5次。</li>
		<li>使用化学发光检测系统检测蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分子对接
<ol>
	<li>打开 UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）28. 在搜索框中输入目标符号，然后点击&#160;搜索 按钮。在 结构 小标题，点击 下载 用于蛋白质靶标的三维结构。</li>
	<li>打开 RCSB PDB 数据库（https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do）29.&#160;在搜索框中输入蛋白质大分子的名称。下载PDB格式的蛋白质大分子结构。</li>
	<li>下载 UCSF Chimera 1.16 软件的安装包（https://vina.scripps.edu/）&#160;以及 AutoDock Vina（https://vina.scripps.edu/）。安装并打开 UCSF Chimera 1.16 软件。单击&#160;文件 &#62; 打开 以显示受体蛋白。</li>
	<li>点击 工具 &#62; 结构编辑 &#62; 泊船准备，和蜱虫 去除溶剂, 添加氢原子，以及 添加电荷 在弹出窗口中去除水分子，添加氢化并平衡电荷。点击 写入 Mol2 文件 将受体蛋白以 mol2 格式保存。对配体执行相同的步骤。</li>
	<li>点击 文件 &#62; 打开 在 UCSF Chimera 1.16 软件中显示 mol2 格式的配体。在 工具 &#62; 表面/结合分析 &#62; AutoDock Vina，设置 受体 将“受体蛋白”标签栏添加至受体蛋白名称旁，将“配体”标签栏添加至配体名称旁。在后方的输入框中输入数值 中心 和 大小 调整新开发的空间，使其能够完全容纳配体和受体。</li>
	<li>点击 好的 通过分子对接虚拟筛选，获得配体与受体结合的最佳位置，并记录该最佳位置的结合能数值。</li>
</ol>
4. 统计分析
<ol>
	<li>打开 SPSS 26.0 统计软件。点击 文件 &#62; 导入数据 以加载数据。</li>
	<li>实验数据以均值 ± 标准差表示。</li>
	<li>采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较多个组别。 
	注意：P &#60; 0.05 被认为在本研究中具有统计学意义。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

通常，一个完整的网络药理学研究包括从数据库中鉴定活性成分、获取与活性成分和疾病相关的靶点、构建药物-成分-疾病-靶点网络，以及预测核心靶点和通路。通过计算机技术初步预测活性成分与核心蛋白（分子对接）之间的关联，并通过实验进行最终验证。
相关数据库的选择是网络药理学中最关键的部分，因为这决定了研究的质量。HERB数据库整合了多个中药数据库的信息，如Syµmap、TCMID、TCMSP和TCM-ID，是目前最全面的中药及成分数据库。因此，本研究采用HERB数据库进行活性成分的筛选19。
本研究中，31 种活性成分和 144 个交集靶点 栝楼-浙贝母 通过相关数据库鉴定了治疗LUAD的药物。通过构建药物-成分-疾病-靶点网络，我们经拓扑学分析筛选出十个关键活性成分。核心靶点 栝楼-浙贝母 通过PPI分析筛选出LUAD治疗中的关键分子。
根据文献报道，在KEGG结果的前20条通路中，PI3K/AK...

肺癌是指起源于肺支气管黏膜的恶性肿瘤，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌1。肺腺癌（LUAD）是最常见的肺癌类型，约占全部肺癌病例的40%2。大多数患者在确诊时已处于晚期或已发生远处转移，因而失去了手术治疗的机会3。目前临床治疗中，同步放化疗是治疗肺腺癌最常用的策略，但由于严重的不良反应，其应用受到限制4。
传统中医（TCM）可有效缓解肺腺癌（LUAD）患者的临床症状，减轻放化疗引起的不良反应，因此已成为研究热点5,6,7在传统中医中，肺癌属于 &#34;肺部蓄积&#34; 和 &#34;肺部石化&#34;气虚以及痰、瘀、毒的相互作用在肺癌的发病机制中具有重要意义。因此，补气化痰、祛瘀解毒是主要的临床治疗原则。8 基于中医理论的肺癌治疗方法9. 栝楼 瓜蒌（Maxim）和 Fritillaria thunbergii 浙贝母（Zhebeimu）是治疗肺癌的常用药对，具有清热化痰的功效10,11,12然而，其作用机制仍不明确，需要进一步开展研究。
网络药理学是一种基于系统生物学和多向药理学理论的综合性方法，旨在揭示多种药物与疾病之间复杂的网络关系13。中药方剂具有多组分、多靶点的特点，因此非常适用于网络药理学的研究14,15。近年来，网络药理学已成为中药复方研究中的有力手段，并逐渐成为研究热点16,17。
然而，据我们所知，目前所有关于网络药理学的研究均以文字形式呈现。通过视频形式展示该技术将显著降低学习门槛，有利于该技术的推广，这也是本文的优势之一。在本研究中，我们以 栝楼-浙贝母 以肺腺癌为例进行网络药理学预测及实验验证。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>A549&amp;nbsp;细胞系</td><td>Procell</td><td>CL-0016</td><td></td></tr><tr><td>AKT 抗体</td><td>CST</td><td>4691S</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量检测试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>PC0020</td><td></td></tr><tr><td>化学发光检测系统</td><td>上海勤翔科学仪器厂</td><td>ChemiScope 6100</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>增强型化学发光（ECL）试剂盒&amp;nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>RM00021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ScienCell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>MTS 检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT 抗体</td><td>CST</td><td>6040S</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>C14-15070-063</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Solarbio</td><td>P0100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂</td><td>碧云天</td><td>P1081</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯（PVDF）膜</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解液</td><td>Solarbio</td><td>R0010</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>上海亚荣生化仪器厂</td><td>RE52CS-1</td><td></td></tr><tr><td>真空冷冻干燥机</td><td>宁波新芝生物科技股份有限公司</td><td>SCIENTZ-10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白抗体</td><td>ABclonal</td><td>AC026</td><td></td></tr></tbody></table>

网络药理学预测与实验验证 栝楼属-fritillaria thunbergii 肺腺癌作用机制

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

我们旨在研究其机制 栝楼-浙贝母 基于网络药理学与实验验证治疗肺腺癌（LUAD）的有效成分及潜在靶点 栝楼属 和 Fritillaria thunbergii 通过高通量实验与参考引导的中药数据库（HERB）以及相似性集合方法（SEA）数据库收集活性成分，并通过GeneCards和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）查询肺腺癌（LUAD）相关靶点。利用Cytoscape软件构建药物-成分-疾病-靶点网络。通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络、基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，筛选核心靶点与关键通路。采用水提物提取方法 栝楼-浙贝母 并使用 A549 细胞进行后续实验验证。通过 HERB 数据库和文献检索，获得 31 种有效化合物和 157 个潜在靶基因 栝楼-浙贝母 进行了筛选，其中144个为调控靶标 栝楼-浙贝母 在肺腺癌治疗中的作用。GO功能富集分析显示，其作用机制 栝楼-浙贝母 针对肺腺癌的主要作用机制为蛋白质磷酸化。KEGG通路富集分析表明，肺腺癌的治疗涉及 栝楼-浙贝母 主要涉及PI3K/AKT信号通路。实验验证表明，一种水提物 栝楼-浙贝母 能够抑制A549细胞的增殖以及AKT的磷酸化。通过网络药理学分析及实验验证，证实PI3K/AKT信号通路在其作用机制中发挥关键作用 栝楼-浙贝母 在治疗肺腺癌方面。

共计 31 栝楼-浙贝母相关的活性成分被鉴定出，包括21个 栝楼属 和 10 Fritillaria thunbergii 组分以及144个相应靶点。从GeneCards数据库和OMIM数据库中分别提取出9,049个和67个与肺腺癌（LUAD）相关的基因。删除重复基因后，共确定9,057个与LUAD相关的基因。LUAD相关基因与 栝楼-浙贝母 活性成分相关靶点分析以获取潜在治疗靶点。药物-成分-疾病-靶点相互作用网络 栝楼-浙贝母 对LUAD的作用显示在 图1A在相互作用网络中，排名前十的活性成分是山柰酚、氢氧甘草苷元、染料木素、 Diosmetin 和 β-谷甾醇、棕榈油酸、甘油醇、十六烷酸、壬酸和癸酸，这些成分被确定为发挥药理作用的关键活性成分 栝楼-浙贝母 在治疗LUAD（图1B）。PPI 网络包含 122 个功能蛋白和 210 个相互作用关系，可视化结果如图所示 ...

本研究揭示了该机制 栝楼属-Fritillaria thunbergii 基于网络药理学和实验验证治疗肺腺癌。该研究还表明，PI3K/AKT 信号通路在药物作用中发挥着关键作用 栝楼属-Fritillaria thunbergii 在治疗肺腺癌方面。

网络药理学预测与实验验证 栝楼属-Fritillaria thunbergii 肺腺癌作用机制

我们旨在基于网络药理学研究瓜蒌-浙贝母治疗肺腺癌（LUAD）的作用机制

传统中医药，我们将讨论其多组分作用于多靶点的特性。这是网络生物学研究最基础的核心内容。我们展示了相关技术，可有效降低研究门槛。网络药理学是一种系统性分析技术，用于构建多因素相互作用网络的分析工具。它能够有效预测中药的单一作用通路。网络药理学的数据来源于数据库，尽管其尚无法准确预测药物与蛋白质之间的相互关系，仍需通过后续实验加以验证。首先，打开HERB数据库，以瓜蒌和浙贝母为关键词，获取这两种药物的化学成分。下载这两种药物相关组分的列表及其规范SMILES结构。现在通过HERB数据库中具有口服生物利用度和类药性参数的组分，判断所获得的组分是否具有活性。若该组分无口服生物利用度和类药性参数，则将其输入Swiss ADME数据库，以获取各组分的相关信息。选择具有高胃肠道吸收率且至少具有两个“是”类药物性质值的成分为活性成分。为预测活性成分的作用靶点，打开HERB数据库，搜索并复制活性成分的标准SMILES结构。然后打开相似性集合分析方法（similarity ensemble approach），将活性成分的标准SMILES结构粘贴到搜索框中。点击“try SEA”以获取每个活性成分的作用靶点名称、P值以及最大TC值。将数据复制到电子表格中，并利用电子表格的筛选功能，根据靶点关键词对活性成分的作用靶点进行筛选。将所有靶点复制到电子表格中，并去除重复项以获得药物靶点。现在打开 GeneCards 数据库和在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man），以预测疾病相关靶点。使用“肺腺癌”作为关键词，获取肺腺癌的疾病靶点。下载疾病靶点的电子表格，删除重复的靶点，获得肺腺癌靶点。新建一个电子表格，将肺腺癌相关靶点和药物靶点复制到同一列中，构建药物成分-疾病靶点网络。利用工具栏中的“数据识别重复项”功能，获取肺腺癌相关靶点与瓜蒌贝母忍冬活性成分相关靶点的交集靶点。打开 Cytoscape 3.8.0。点击菜单栏中的“文件”，然后选择“导入”，接着选择“从文件导入网络”。要导入电子表格文件，请通过左侧控制面板中的样式栏优化网络节点的大小和颜色。使用“分析网络”功能进行网络拓扑分析。在菜单栏中点击“工具”，然后选择“分析网络”。在表格面板中，单击标题栏中的“degree”以按度值降序排列各成分。选取前10个成分为主要活性成分和核心靶点，用于构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选核心蛋白。打开字符串数据库，将瓜蒌贝母威灵仙对抗肺腺癌的潜在靶点的文本格式列表粘贴到“名称”对话框中的列表内。然后在生物体中选择 Homo sapiens。点击搜索并选择继续按钮；当结果显示后，点击设置，在基本设置中勾选“高置信度（0.700）”，在最低必需相互作用评分下勾选网络中的高离散节点，在高级设置中进行相应配置。然后点击更新按钮。接下来，点击标题栏中的“exports”并下载以 TSV 格式保存的 PPI 关系的简短表格文本。打开 Cytoscape 3.8.0。单击文件，选择“导入”，然后选择“从文件导入网络”，以导入TSV格式文件进行可视化分析。使用网络分析器功能进行拓扑分析。通过左侧控制面板中的样式栏优化网络节点的大小和颜色。通过打开 Medscape 平台，将潜在治疗靶点的文本格式列表粘贴到对话框中，然后点击“提交”按钮，进行 KEGG 富集分析。在“输入物种”和“分析物种”中均勾选 Homo sapiens，然后点击“自定义分析”按钮。选择“富集分析”。仅勾选KEGG通路，然后点击富集分析。当进度条达到100%后，点击分析报告页面的橙色按钮以查看富集结果。点击“all in one zip file”下载富集结果，然后打开“Enrichment_GO”文件夹中的“_FINAL_GO.csv”文件以获取结果。打开 R 软件，输入命令 install package GG plot two 和 library GG Plot two 以安装 GG plot two R 软件包。按回车键运行 KEGG 可视化程序。为检测细胞活力，将处于对数生长期的 A549 细胞用 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶在 37 摄氏度下消化 1 分钟。加入1 mL DMEM完全培养基以中和胰蛋白酶，并轻轻吹打促进细胞脱落。随后离心混合液以获得细胞沉淀，并用DMEM完全培养基重悬所得细胞。将细胞悬液加入血细胞计数板，使用自动细胞计数仪进行计数，再用DMEM完全培养基稀释至5 × 10⁴ 个细胞/mL。现在将1克瓜蒌贝母乌蔹莓水提取物溶解于10 mL PBS中，通过0.22 µm滤器过滤除菌。用 PBS 将混合物稀释至不同浓度。取 100 µL 稀释后的细胞悬液加入 96 孔板的每个孔中。待细胞贴壁后，向各孔中加入 1 µL 不同浓度的瓜蒌贝母天葵子水提取物，以调节每孔的终浓度。培养 24 小时后弃去原培养基，加入 100 µL DMEM 基础培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 2 小时。孵育结束后，加入 20 µL MTS 溶液，再将细胞孵育 1 小时。将孵育后的混合物转移至另一块培养板。使用酶标仪在490纳米波长下测定吸光度，并计算细胞活力。将处于对数生长期的A549细胞稀释至每毫升5×10⁵个细胞。向六孔板中加入2毫升细胞悬液，培养12小时。按照之前的方法制备不同稀释度的瓜蒌贝母天葵子水提液后，向空白对照组加入20微升PBS溶液，向不同浓度组分别加入20微升瓜蒌贝母天葵子水提液的不同稀释液。干预24小时后，弃去上清液，并用PBS清洗细胞3次。向每个孔中加入 250 µL RIPA 裂解缓冲液，裂解细胞 30 分钟。收集裂解液进行离心，获取上清液。栝楼贝母威灵仙对抗肺腺癌的药物成分-疾病靶点相互作用网络如下所示。在相互作用网络中，获得的前10个活性成分是瓜蒌贝母威灵仙治疗肺腺癌作用的关键活性成分。该PPI网络包含122个功能蛋白和210个相互作用关系。前10个核心蛋白主要参与新生血管形成、细胞增殖、凋亡以及细胞膜转运过程。根据KEGG通路富集分析排名前20的通路中，PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、磷脂酶D信号通路和MAPK1信号通路均与肺癌密切相关，其中PI3K-AKT通路排名首位。栝楼贝母忍冬提取物在浓度超过400微克/毫升时可抑制细胞增殖，当浓度达到800微克/毫升时，对A-549细胞的抑制作用接近半数抑制浓度。各实验组经栝楼贝母忍冬提取物干预后，AKT蛋白表达水平未见显著变化。然而，p-AKT Serine-473 的表达受到抑制，并呈现出剂量依赖性效应。对瓜蒌贝母忍冬的主要成分与PI3K AKT通路关键蛋白进行了分子对接，结果表明木犀草素和山奈酚与AKT1的结合能均小于负七，提示具有较强的结合活性。最重要的是实现了中药活性成分对靶点的作用。以及网络药理学的核心靶点。

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