Name: 2D人干细胞来源心肌细胞中心脏收缩力调节疗法的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习使用视频显微技术和柔性水凝胶基质评估人诱导多能干细胞来源心肌细胞的收缩特性。该方法为心脏电生理医疗器械的非侵入性评价提供了可靠工具，支持监管科学发展并加速患者获得创新疗法。

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本工作部分得到了橡树岭科学与教育研究所管理的设备与放射健康中心研究参与项目的资助，该项目由美国能源部与美国食品药品管理局之间的机构间协议支持。作者感谢Richard Gray、Trent Robertson和Anna Avila提供的建议和技术协助。本研究由美国食品药品管理局科学与工程实验室办公室资助。

1. 培养皿和培养基的准备
注意：典型的基于细胞外基质（ECM）的水凝胶分装量为约 200 µL，置于无菌的 1.5 mL 离心管中，于 −20 °C 保存。
<ol>
	<li>在无菌细胞培养操作台中，向每个孔中加入 2 mL 0.1% 明胶（材料表），制备无菌的 6 孔板。盖上 6 孔板盖，于 37 °C 孵育至少 1 小时。</li>
	<li>在将人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）接种到柔性水凝胶基质上的前一天，将一份水凝胶（材料表）在冰上置于冰箱中解冻。</li>
	<li>通过混合 500 mL RPMI 1640 培养基、10 mL 50x B-27 添加剂和 5 mL 青霉素-链霉素9，配制心肌细胞培养基（材料表）。</li>
</ol>
2. 冻存 hiPSC-CMs 的接种
<ol>
	<li>在将 hiPSC-CMs 接种到柔性水凝胶基质前两天，先将 hiPSC-CMs 预接种于经 0.1% 明胶包被的无菌 6 孔板中。按照标准复苏方案解冻 hiPSC-CMs9,25。</li>
	<li>随后，根据生产商说明书，每孔接种总计 1,500,000 个 hiPSC-CMs（材料表）（图 1A）26。</li>
	<li>将 hiPSC-CMs 在标准心肌细胞培养基中培养 2–4 天，使其在 37 °C 和 5% CO2 条件下从冷冻保存中恢复。每 48 小时用 100% 新鲜心肌细胞培养基更换耗尽的培养基。</li>
</ol>
3. 预包被的hiPSC-CMs的解离与计数
<ol>
	<li>在解离前检查 hiPSC-CMs 的状态。评估 hiPSC-CMs 的健康状况，确保其具有活性并稳定搏动。 
	注意：hiPSC-CM 群体的纯度至关重要（例如，&#62;90% 表达心肌肌钙蛋白 T）7。建议采用心肌细胞筛选方法（如代谢筛选或分选），以减少非心肌细胞对水凝胶基质的干扰25,26。</li>
	<li>用不含 CaCl2 或 MgCl2 的 D-PBS 洗涤 hiPSC-CMs，每孔 4 mL，共洗涤 2 次（材料表）。吸除 D-PBS，每孔加入 1 mL 室温解离试剂，于 37 °C 孵育 15 分钟。</li>
	<li>向无菌 15 mL 圆锥形离心管中加入 10 mL 心肌细胞培养基。</li>
	<li>使用 1,000 µL 移液器将 hiPSC-CMs 从 6 孔板中解离（图 1B）。将细胞悬液加入 15 mL 圆锥形离心管中26。</li>
	<li>用 1 mL 新鲜心肌细胞培养基冲洗孔内残留的 hiPSC-CMs，并将其加入 15 mL 圆锥形离心管中。将离心管中液体终体积调整至 15 mL。</li>
	<li>离心 5 分钟（200 × g）。弃去上清液，保留至 1 mL 刻度线处。用心肌细胞培养基重悬细胞，终体积为 5 mL。</li>
	<li>使用手动或自动细胞计数器对 hiPSC-CMs 进行计数。</li>
	<li>在准备柔性水凝胶基质期间，将 hiPSC-CM 悬液于室温孵育（最长 30 分钟）。</li>
</ol>
4. 柔性水凝胶基底的制备
<ol>
	<li>准备一支量程为 1 µL 的 20 µL 移液器、20 µL 移液器吸头（例如，20 µL）以及一个无菌的 48 孔玻璃底培养板。在制备水凝胶基底前，确保已准备好秒表/计时器。</li>
	<li>在无菌细胞培养操作台中，通过轻轻敲击管壁混合基于细胞外基质（ECM）的水凝胶基底材料，并立即将其放回冰上。</li>
	<li>在接种第一个水凝胶基底前，立即启动秒表/计时器——此时刻记为时间零点。</li>
	<li>用移液器将 1 µL 水凝胶基底材料上下吹打约 3 次，以预冷移液器吸头。将约 1 µL 未稀释的水凝胶基底材料水平地加至 48 孔板每个孔的底部（图 1C、图 2A 和 图 3A），移液器保持 45° 倾斜角度。所有水凝胶基底应在每个孔内以相同方向接种（图 2 和 图 3），以便在 40 倍放大倍数下进行实验时能够识别基底7,9,17,27。 
	注意：每条约 1 µL 的液线即为一个水凝胶基底（图 3）。通常制备 48 个孔约需 5 分钟。使用水平倾斜的微孔板架（例如 30°）可能有助于更清晰地观察孔底及水凝胶基底。务必覆盖整个孔的长度（即从左至右）。过短的水凝胶基底可能过厚，从而降低基底稳定性。切勿让水凝胶基底在移液器吸头中干燥。若发生干燥，应迅速更换新吸头并立即继续操作。也可使用预冷的移液器吸头。基于 ECM 的水凝胶基底在未置于冰上时可能迅速发生聚合。建议一次制备多个孔（例如 10 个）。此外，推荐先在模拟的 48 孔板中进行练习。</li>
	<li>盖上 48 孔板盖，将水凝胶基底在无菌细胞培养操作台中室温孵育 8–10 分钟后再接种细胞（图 2B）。 
	注意：必须严格遵守建议的孵育时间。孵育超过 10 分钟会导致水凝胶基底过硬且无可见收缩；孵育少于 8 分钟可能导致基底塌陷。</li>
	<li>立即使用 1,000 µL 移液器将 hiPSC-CMs 以滴加方式直接接种到水凝胶基底上，每孔接种约 30,000 个活细胞，使用约 200 µL 心肌细胞培养基（图 2B 和 图 3B）。 
	注意：此步骤可终止水凝胶基底的聚合过程，并确保 hiPSC-CMs 位于基底之上7,9,17,27。</li>
	<li>盖上板盖，将 hiPSC-CMs 在无菌细胞培养操作台中室温静置孵育 10–15 分钟（图 2C），以使 hiPSC-CMs 能够黏附于水凝胶基底。</li>
	<li>轻柔地向每孔加入约 100 µL 新鲜心肌细胞培养基（终体积：每孔约 300 µL）。盖上板盖，转移至 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 2–4 天。在进行收缩实验前，每 24 小时更换一次完全培养基。 
	注意：应目视检查 hiPSC-CMs 的形态是否正常；接种后立即观察，hiPSC-CMs 应呈圆形（图 3B）。接种后第 2 天，可观察到融合的二维 hiPSC-CMs 单层合胞体（图 3C）（补充视频 S1），并可见明显的收缩活动（补充视频 S2）。</li>
</ol>
5. 收缩记录与分析
<ol>
	<li>配制CCM检测培养基，即含有以下成分的Tyrode's溶液（单位：mmol/L）：CaCl2 0.5、NaCl 134、KCl 5.4、MgCl2 1、葡萄糖 10、HEPES 10，用NaOH调节pH至7.4，并在水浴中平衡至37 °C。 
	注：使用次优细胞外钙浓度（0.5 mM）可扩大CCM检测的动态范围。</li>
	<li>开启显微镜和环境控制腔室，使其平衡至37 °C和5% CO2。</li>
	<li>从48孔板中移除心肌细胞培养基，并用600 µL CCM检测培养基轻轻冲洗每个孔两次。</li>
	<li>每孔加入300 µL CCM检测培养基，将48孔板置于显微镜的环境控制腔室内。插入电极，并使细胞平衡5分钟。</li>
	<li>使用基于视频的显微技术记录收缩视频。打开视频采集软件，设置帧率为100帧/秒。在hiPSC-CM单层细胞的中心附近选择一个感兴趣区域（ROI）。 
	注：请勿在hiPSC-CM单层细胞边缘附近选择感兴趣区域，因为该区域可能在收缩记录中不稳定。</li>
	<li>随后，使用商用脉冲发生器（材料表）对细胞进行场刺激，以电刺激同步起搏2D hiPSC-CM单层细胞。以1.5倍阈值、1 Hz频率进行起搏，基础脉冲参数为（例如：单相方波起搏脉冲，刺激脉冲持续时间为2 ms，场强约为14 V/cm）17。</li>
	<li>记录基线状态、仅起搏（即CCM前）（图1D）的收缩视频，至少持续五个搏动周期17,28。</li>
	<li>随后，使用实验性电刺激信号刺激hiPSC-CM单层细胞（图1D）。按照本方案，采用标准CCM刺激参数：两个对称的双相脉冲，每相持续时间为5.14 ms（总持续时间为20.56 ms），场强约28 V/cm（相位振幅），无相间间隔，以及30 ms延迟（即从起搏脉冲结束到CCM脉冲开始的时间）（图1D）29,30，并记录CCM诱导的收缩视频，至少持续五个搏动周期。</li>
	<li>关闭CCM信号，改用基础起搏脉冲进行刺激，并记录恢复期（即CCM后）的收缩视频，至少持续五个搏动周期。</li>
	<li>使用标准收缩分析软件自动分析收缩视频，量化关键的收缩特性（例如，收缩幅度、收缩速率、舒张速率、达峰时间、90%复极时间和50%收缩持续时间）7,17,31,32。</li>
	<li>在接种于柔性水凝胶基底后第2至第14天期间，使用该2D hiPSC-CM模型进行收缩功能实验。</li>
</ol>

本文反映了作者的观点，不应被理解为代表美国食品药品监督管理局的观点或政策。提及商业产品、其来源或其与本文报道材料相关的使用，并不应被理解为卫生与公共服务部对这些产品的实际或暗示认可。作者声明本研究不存在利益冲突。

本文所述方案介绍了一种利用商业试剂在柔性细胞外基质（ECM）基水凝胶底物上生成强有力收缩的二维 hiPSC-CM 单层的方法7,17。接种于柔性水凝胶底物上的 hiPSC-CM 可保持活性，并表现出增强的收缩特性7。该技术依赖于常规的实验室设备和操作能力7。本方案中存在多个关键步骤，特别是涉及 ECM 基水凝胶底物的操作，需格外注意细节。一个潜在问题是培养基中存在血清，可能导致 hiPSC-CM 形成网络结构（如内皮/血管样网络），而非融合的单层细胞层；因此，在建立柔性水凝胶 hiPSC-CM 单层期间（即第 0 天至第 4 天），建议使用无血清培养基。同样，一次性制备过多水凝胶底物可能因操作者疲劳而导致底物质量差或不均匀。尽管操作需迅速，但每个水凝胶底物的完整性至关重要。此外，接种 hiPSC-CM 及更换培养基时应谨慎操作，避免用力过猛。更换培养基时，应从孔板边缘顶部轻柔加入，以免破坏水凝胶底物或细胞。与标准的二维 hiPSC-CM 培养（即常规组织培养用塑料或玻璃表面）类似，密度过低会导致单层无法完全形成。必须通过肉眼观察确认 hiPSC-CM 已正确接种在水凝胶底物上，并使用计时器确保操作时间准确。此外，根据底物制造商提供的 ECM 特性说明和使用指南，将二维 hiPSC-CM 单层在水凝胶底物上培养超过 14 天可能导致单层结构破坏。
当前方法存在若干局限性，必须加以考虑。首先，本方案所使用的细胞来自商业化的 hiPSC-CMs 供应商，这些细胞形成电耦合的合胞体。该合胞体包含三种心脏亚型（即心室型、心房型和结节型）hiPSC-CMs 的混合物17。某些研究可能更受益于仅含单一亚型的 hiPSC-CMs 群体（例如，100% 心室型或 100% 心房型）。其次，本方法仅使用了 hiPSC-CMs，而包括心肌成纤维细胞、内皮细胞和神经元在内的非肌细胞可能增强 hiPSC-CMs 的功能22,36。第三，二维培养的 hiPSC-CMs 表现出多种相对不成熟心肌细胞的特征，包括自发搏动、形态不规则以及缺乏收缩力反应8,37。第四，尽管本方案可生成强烈收缩的二维 hiPSC-CM 单层，但功能更优的三维 hiPSC-CM 模型（如工程化心肌组织，ECTs）在生理钙浓度下可能产生更强的 CCM 诱导收缩反应8,38。最后，本文所述方案适用于 48 孔板格式；但通过优化并引入自动化操作，可将其扩展至高通量格式（例如 96 孔板或 384 孔板）。
目前，hiPSC-CM 研究的金标准是传统的刚性二维培养条件（即组织培养用塑料或玻璃）。尽管这种条件适用于电生理学3和钙处理39研究，但其产生的收缩特性极为有限5,6,7。因此，传统的刚性二维培养条件不适用于评估 CCM 的收缩效应8。功能增强的三维 hiPSC-CM 工程化收缩组织（ECT）方法38在技术上具有挑战性，耗时较长，且需要复杂的设备，而这些设备并非所有实验室都能 readily 获得。在本方案中，我们描述了一种简便的方法，可在比三维 ECT 方法或长期传统二维方法更短的时间内生成具有强健收缩能力的二维 hiPSC-CM 单层细胞7,40,41。此外，本方法所用试剂均为商业化产品，包括水凝胶基底和 hiPSC-CMs，且二者在批间一致性方面表现良好。虽然我们使用了可拆卸的铂丝电极（电极间距：2.0 mm，宽度：1.0 mm），但多种电极材料和构型均适用于体外 CCM 收缩功能的评估in vitro8,15,17,18,22。同样，目前已有多种自动化软件可用于收缩视频的分析7,31,32。
目前大多数非临床评估心脏医疗器械收缩功能的方法主要依赖于成本高昂的in vivo动物模型（例如狗或猪）以及技术上具有挑战性的乳头肌条实验（例如兔）18。本文描述了一种用于评估心脏电生理医疗器械信号对收缩功能影响的人体in vitro模型。该工具可减少对动物实验的依赖，并可用于心脏电生理器械收缩性能的in vitro评估。

随着美国人口老龄化，心力衰竭患者的数量持续增加，直接医疗费用也随之上升1,2迫切需要开发治疗心力衰竭的新型疗法，并建立创新的非临床方法来测试这些疗法。人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已被提出作为一种 体外 有助于治疗开发过程的工具，并已用于监管申报3,4然而，由于在标准刚性二维培养条件下（即常规组织培养用塑料或玻璃）培养时，其收缩性能较弱，因此在收缩功能研究中的广泛应用受到限制5,6,7,8我们先前已证明，将分离的单个hiPSC-CMs接种于柔性水凝胶基质上，可产生显著且可见的收缩特性9我们证明了分离的hiPSC-CMs具有与新鲜分离的成年兔心室心肌细胞相似的收缩特性。此外，我们还展示了该方法在评估药理学试剂对收缩反应中的应用价值7此外，其他研究已将该技术应用于基础科学和疾病建模的机制评估10,11,12此处，该方法已扩展应用于二维 hiPSC-CM 单层细胞，以评估其在生理相关的心脏收缩力调节（CCM）医疗设备电信号评价中的效用 体外 如所示。
CCM是一种心内心脏衰竭疗法，在心动周期的绝对不应期内向心肌输送非兴奋性电生理信号13,14评估人类心脏细胞模型中CCM的可重复方法尚且缺乏。以往的研究采用多种心脏细胞模型来评估CCM的收缩反应。我们证明了 体外 新鲜分离的兔心室心肌细胞在CCM刺激下表现出钙瞬变和收缩幅度的短暂增加15另一项在分离的犬心室心肌细胞中开展的研究表明，CCM可增强细胞内钙瞬变幅度16然而，大多数CCM研究都采用了 离体 和 体内 动物模型制备。这些研究之间难以相互关联，因为它们采用了不同的CCM脉冲参数和物种17一项在离体兔乳头肌模型中的研究显示，CCM可增强心肌收缩力8,18，且一系列全心研究已证实CCM可增强心肌收缩功能19,20,21这些研究已提供了重要的机制性见解。然而，目前尚缺乏可重复的人类模型 体外 心脏电生理及收缩力研究，包括细胞外电刺激（CCM）。为此，我们开发了多种二维和三维人诱导多能干细胞（hiPSC）模型，并证明CCM可参数依赖性地增强收缩功能。此外，研究发现CCM诱导的正性肌力效应部分由神经输入和β-肾上腺素能信号通路介导。8,17,22然而，关于CCM疗法的作用机制仍需进一步研究，而利用收缩性人类心肌细胞有助于实现这一目标。因此，迫切需要开发用于评估新型CCM装置与信号的人源非临床工具，以加快监管审批流程，减轻对动物模型的依赖，并支持器械研发过程中的决策制定。8,17,23,24开发简便、可自行操作的实验方案至关重要，这些方案应能够转移至任何实验室，使用常规设备且对细胞数量要求较低，从而降低成本。该方法阐明了CCM刺激对人心肌细胞功能的影响，为CCM的安全性或有效性提供了重要见解。17在此，我们描述了一种在柔性水凝胶基质上生成二维人诱导多能干细胞来源的心肌细胞单层的方法，以建立一种标准化的非临床工具，用于量化健康与疾病状态下心脏电生理医疗设备（即CCM）对心肌收缩反应的急性影响。

<table><tbody><tr><td>0.1% 明胶</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>预铺培养基质</td></tr><tr><td>48孔板</td><td>MatTek&amp;nbsp;</td><td>P48G-1.5-6-F</td><td>水凝胶基底 hiPSC-CM 培养，玻璃</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>140675</td><td>hiPSC-CM 培养，塑料</td></tr><tr><td>含胰岛素的 B-27 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>心肌细胞培养基</td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>c70-500</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>CellOPTIQ 平台与软件&amp;nbsp;</td><td>克莱德生物科学</td><td></td><td>收缩记录与分析</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>352099</td><td>hiPSC-CM 解离</td></tr><tr><td>数字CMOS相机</td><td>滨松</td><td>C11440-42U30</td><td>收缩视频记录</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>细胞洗涤</td></tr><tr><td>环境控制箱</td><td>OKOLAB 公司</td><td>H201-K-FRAME</td><td>环境调控</td></tr><tr><td>葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1kg</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-107</td><td>hiPSC-CM 计数</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>iCell 心肌细胞铺板培养基</td><td>富士胶片细胞动力学有限公司&amp;nbsp;</td><td>M1001</td><td>hiPSC-CM 铺板培养基</td></tr><tr><td>iCell 心肌细胞&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 01434</td><td>富士胶片细胞动力学有限公司&amp;nbsp;</td><td>R1017</td><td>hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>培养箱（37 &amp;deg;C，5% CO₂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50116047</td><td>维持 hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>成像 hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>m33-500</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>生长因子减少型基质胶基底膜基质</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>356230</td><td>柔性水凝胶基底</td></tr><tr><td>1.5 ml 微型离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>水凝胶基质分装</td></tr><tr><td>Model 4100 隔离式高功率刺激器</td><td>AM-Systems</td><td>Model 4100&amp;nbsp;</td><td>脉冲发生器</td></tr><tr><td>MyCell 心肌细胞 DCM LMNA L35P，01016</td><td>富士胶片细胞动力学有限公司&amp;nbsp;</td><td>R1153</td><td>DCM hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>心肌细胞培养基</td></tr><tr><td>移液器 L-20</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>水凝胶基质包被</td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，1000 µl</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-509</td><td></td></tr><tr><td>20 μl 吸头</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10S</td><td>制备水凝胶基质</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330-500</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>RPMI 1640，含葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>心肌细胞培养基</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>s641-212</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>刺激电极</td><td></td><td></td><td>起搏与CCM刺激</td></tr><tr><td>秒表/计时器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-261-840</td><td>水凝胶基质包被</td></tr><tr><td>台盼蓝染色</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>hiPSC-CM 计数</td></tr><tr><td>TrypLE Express&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>hiPSC-CM 解离</td></tr></tbody></table>

在二维人源干细胞衍生心肌细胞中评估心脏收缩力调节治疗

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）目前正被广泛探索用于多种 体外 应用，并已用于监管申报。在此，我们将该技术的应用扩展至心脏医疗器械的安全性或性能评估。我们开发了一种新方法，用于评估心脏医疗器械对在柔性细胞外基质（ECM）基水凝胶基底上培养的、具有强健收缩能力的二维人诱导多能干细胞来源心肌细胞（2D hiPSC-CMs）单层的收缩特性的影响。该工具可利用标准实验室设备，定量评估心脏电生理器械信号对人类心脏功能（如收缩特性）的作用。二维hiPSC-CM单层在48孔板格式中，于柔性水凝胶基底上培养2–4天。
将hiPSC-CMs暴露于标准的心脏收缩力调节（CCM）医疗设备电刺激信号下，并与对照组（即仅起搏）的hiPSC-CMs进行比较。通过基于像素位移的视频检测分析，量化了二维hiPSC-CMs的基础收缩特性。接种于柔性水凝胶基底上的CCM刺激二维hiPSC-CMs表现出较基线（即CCM刺激前）显著增强的收缩性能，包括峰值收缩幅度增加以及收缩和舒张动力学加快。此外，利用柔性水凝胶基底可实现基于视频的心肌兴奋-收缩耦联多参数读出（即电生理、钙处理和收缩）在健康与疾病状态hiPSC-CMs中的并行检测。准确检测和量化心脏电生理信号对人类心肌收缩的影响，对于心脏医疗设备的研发、优化及风险降低至关重要。该方法可稳健地可视化并量化心肌合胞体的收缩特性，有望在非临床阶段的心脏医疗设备安全性或有效性测试中发挥重要价值。本文详细描述了构建二维hiPSC-CMs水凝胶基底单层的实验方法。

本方案描述了一种简单且可靠的工具，用于在柔性水凝胶基质上生成明显收缩的二维 hiPSC-CM 单层细胞。通过基于视频的记录结合收缩力分析软件，可实现对心肌细胞收缩特性的测量。该方法能够量化心肌细胞收缩的关键参数，包括收缩幅度、收缩斜率、舒张斜率、达峰时间、恢复至基线 90% 的时间以及 50% 收缩持续时间。该模型可用于表征 hiPSC-CMs 的基础收缩特性（图4) 来自不同“健康”供体，并可扩展至心脏电生理医疗设备信号（即，CCM）的评估。应用标准 CCM 刺激参数（图1D)29,30 导致收缩性能增强 体外 (图5 和 表1)17.
我们进一步证明，该方法可用于评估在有或无 CCM 刺激的情况下，细胞外钙离子浓度调节对人心肌细胞收缩特性的影响（图6）17。实验观察到预期的收缩力对钙离子浓度的依赖性7,17，同时也观察到 CCM 刺激增强了心肌细胞单层对钙离子的敏感性。此外，对β-肾上腺素能信号通路的药理学检测（图7）表明，CCM 诱导的正性肌力效应部分由β-肾上腺素能信号介导17。此外，该技术可拓展应用于患者特异性的疾病心肌细胞，包括扩张型心肌病（DCM）来源的心肌细胞33,34,35（图8），以研究 CCM 在疾病背景下的作用效果；事实上，在本研究测试的 CCM “剂量”下，观察到收缩幅度增强，以及收缩和舒张动力学加快（图8）。尽管我们实验室拥有一个模拟 CCM 的装置，但本文所采用的方法并不局限于该系统，也可应用于其他心脏电生理设备。
<img alt="通过显微镜检测心肌功能的hiPSC-CMs设置；包括铺板、水凝胶阵列和CCM刺激。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1二维 hiPSC-CM 示意图总结 体外 CCM 模型 (A将hiPSC-CMs以单层形式预接种于经0.1%明胶包被的6孔板中。B培养2天后，将hiPSC-CMs进行解离，并制备用于接种至柔性水凝胶基质上。C分离的hiPSC-CMs以高密度接种于48孔板格式排列的水凝胶基质上（左），并在含0.5 mM细胞外钙的Tyrode溶液中进行检测（右）。D商用脉冲发生器及标准临床CCM脉冲参数29,30 （右）用于刺激hiPSC-CMs；心脏功能通过基于视频的分析进行评估（左）。ECCM处理前（基线：5 V）、CCM处理期间（CCM：10 V）和CCM处理后（恢复期：5 V）的代表性收缩记录。该图已重印自Feaster等人的研究。17缩写：hiPSC-CM = 人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞；CCM = 心脏收缩力调节 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="48孔板制备示意图；用于细胞培养设置的ECM水凝胶及hiPSC-CMs接种。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：柔性水凝胶基底接种与铺板示意图。（A）将完全解冻且未稀释的基于ECM的水凝胶基底加入无菌48孔板中（左图），每孔1 µL水凝胶基底（右图）。（B）将水凝胶基底在室温下孵育8–10分钟（右图），随后在低培养基体积（约200 µL）条件下接种高密度hiPSC-CMs（左图）。（C）孵育10–15分钟后，向每孔加入培养基（左图），并将培养板转移至标准组织培养孵育箱中（右图）。缩写：ECM = 细胞外基质，hiPSC-CM = 人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞；RT = 室温。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌菌落形成过程，显微镜图像显示生长模式，可见比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：基于细胞外基质的水凝胶基底。（A）将基底材料加入48孔玻璃底板的一个孔后立即拍摄的代表性水凝胶基底图像（无细胞）。（B）人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）接种后0小时。（C）hiPSC-CMs接种后24小时。本图转载自Feaster等17。白色箭头指示水凝胶基底的边缘，放大倍数为4倍。比例尺 = 1 mm。缩写：hiPSC-CM = human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏收缩分析图和柱状图；收缩幅度、时间测量结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：二维hiPSC-CM单层细胞收缩特性的表征。 （A）在1 Hz（5 V）电刺激下二维hiPSC-CM的代表性收缩记录。（B）显示一个收缩周期的代表性收缩轨迹。（C）汇总柱状图。数据以均值±标准误表示，n = 18。缩写：hiPSC-CM = 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏收缩幅度分析；显示CCM治疗前后效果的图表；数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：CCM对2D hiPSC-CM收缩特性急性作用的影响。（A）CCM前（5 V）、CCM期间（10 V）及CCM后（5 V）的代表性收缩记录。（B）即时效应的代表性收缩轨迹（即CCM前最后一次搏动、CCM第一次搏动和CCM后第一次搏动，以+表示）。（C）即时效应的汇总柱状图。数据以均值±标准误表示，变化百分比。n = 23。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。本图已重印自Feaster等人的研究17。缩写：hiPSC-CM = 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞；CCM = 心脏收缩力调节。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞外钙对收缩的影响；振幅、斜率与Ca2+浓度（mM）的关系图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6细胞外钙调制对CCM反应的影响 (A) 各组在CCM前（5 V）、CCM期间（10 V）和CCM后（5 V）的即时效应代表性收缩轨迹；hiPSC-CMs暴露于逐渐增加的细胞外钙（Cao0.25–2 mM。B-D) 转换后的数据（S型曲线）用于直观显示CCM对收缩特性（即幅度和动力学）钙敏感性的影响（Hill斜率 = 1.0）。每组 n = 6–8。该图已重印自 Feaster 等人。17缩写：hiPSC-CM = 人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞；CCM = 心脏收缩力调节 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="心脏收缩力图和柱状图；对照组与美托洛尔效应；收缩分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：药理学干预实验。 各组在心脏收缩力调节（CCM）前（5 V）、CCM期间（10 V）及CCM后（5 V）的代表性收缩曲线；hiPSC-CMs预先用（A）对照溶剂或（B）美托洛尔（2 µM）处理。（C、D）各条件下的汇总柱状图。数据以均值 ± 标准误表示，变化百分比。每组 n = 10。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。本图改编自 Feaster 等人17。缩写：hiPSC-CM = 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞；CCM = 心脏收缩力调节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="心脏收缩分析；显示振幅（DCM 与 DCM+CCM）及参数柱状图的曲线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图 8：CCM 对病变 2D hiPSC-CM 收缩特性急性作用的影响。（A）DCM L35P 在基线对照（干预前，6 V）以及 DCM L35P 联合 CCM（10 V）条件下的代表性收缩轨迹。（B）汇总柱状图。数据以均值 ± 标准误表示，变化百分比。n = 3。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01。缩写：hiPSC-CM = 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞；CCM = 心脏收缩力调节；DCM = 扩张型心肌病。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充视频 S1：hiPSC-CMs 在基于细胞外基质的水凝胶上的延时成像。 接种于柔性水凝胶基底上的二维 hiPSC-CMs；时间：0–90 小时；48 孔玻璃底板中的一个孔；4 倍放大。hiPSC-CMs 形成水平单层合胞体（即从左到右）。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 S2：基于细胞外基质的水凝胶上的 hiPSC-CMs。接种于柔性水凝胶基底上的二维 hiPSC-CMs；时间：约 24 小时；使用 48 孔玻璃底板的一个孔；4 倍放大。hiPSC-CMs 形成单层形态，并在接种后约 24 小时表现出强烈的收缩性。比例尺 = 1 mm。该视频来自 Feaster 等人17。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>CCM</td>
			<td>之后</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>振幅 </td>
			<td>16 ± 4%**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>达到峰值50%所需时间 </td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>达到峰值90%所需时间 </td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>恢复至基线50%所需时间 </td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>恢复至基线90%所需时间 </td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>收缩持续时间10% </td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>收缩持续时间50%</td>
			<td>-6 ± 5 %</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>收缩持续时间90% </td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：收缩特性。 相对于CCM前（5 V）的百分比变化；数据为每组在CCM期间（10 V）和CCM后（5 V）所有搏动的平均值±标准误。n = 23。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。本表格已重印自 Feaster 等人17。

在此，我们展示了一种利用二维人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）单层在柔性基底上培养，并结合基于视频的显微镜技术，用于无创评估心脏医疗设备收缩力的方法。该工具将有助于 体外 心脏电生理设备收缩特性的评估

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）目前正被探索用于多种体外应用，并已被用于……

美国食品药品监督管理局（FDA）的科学与工程实验室办公室正在开发监管科学工具，以协助医疗器械开发者和FDA审评人员。我们的最终目标是通过当前最先进的科学手段，加快患者获得创新、安全且有效的医疗器械的进程。在本方案中，我们应用前沿的诱导性多能干细胞技术，对用于治疗危及生命的心脏疾病的医疗器械进行评估。这种简单的工具可利用标准实验室设备在培养皿中对心脏电生理学设备进行可重复的评估。它还可与来自患有各种心脏病捐赠者的患者特异性细胞联合使用。首先，在将心肌细胞接种到柔性水凝胶基质上之前至少两天，将解冻的人诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞接种于经0.1%明胶包被的无菌六孔板中。将人iPSC来源的心肌细胞在标准心肌细胞培养基中培养2至4天，培养条件为37摄氏度、5%二氧化碳，以使其从冻存状态中恢复。每48小时用100%心肌细胞培养基更换耗尽的培养基。在消化前通过评估细胞健康状况、确保细胞活力及稳定搏动，检查人iPSC来源心肌细胞的状态。用不含氯化钙和氯化镁的 DPBS 洗涤心肌细胞，每孔加入 4 毫升。每孔加入 1 毫升室温解离试剂，于 37 摄氏度孵育 15 分钟。接着，向无菌的 15 毫升锥形管中加入 10 毫升心肌细胞培养基。使用1,000微升移液器将心肌细胞从六孔板中解离，并将细胞悬液加入锥形管中。用1毫升新鲜心肌细胞培养基冲洗各孔，以收集残留的心肌细胞，并将其加入锥形管中。然后用培养基将锥形管中的终体积调至15毫升。将离心管在200 G条件下离心五分钟，弃去上清液至一毫升刻度线处。用心肌细胞培养基重悬细胞，终体积为五毫升，使用手动或自动细胞计数器对心肌细胞进行计数。接下来，在室温下孵育心肌细胞悬液约30分钟，同时准备柔性水凝胶基底。在组织培养超净台中准备好一支设定为1微升的20微升移液器、移液器吸头、一个无菌的48孔玻璃底培养板以及一个秒表计时器。通过轻轻敲击管壁混匀细胞外基质（ECM）或基于ECM的水凝胶基质，随后立即放回冰上。在接种第一份水凝胶基质前立即启动秒表计时器，并将此时刻标记为时间零点。将移液器吸头上下吸取约一微升水凝胶基质溶液三次，以冷却移液器吸头。然后，将约一微升未稀释的水凝胶基质溶液水平加至48孔板每个孔的底部，移液时保持移液器呈45度角。每个孔中的水凝胶基质应以相同方向接种，以便在40倍放大条件下进行实验时易于识别基质位置。将盖子盖在48孔板上，置于组织培养罩内，室温孵育8至10分钟，然后再加入细胞。孵育结束后，立即在低培养基体积（约200微升心肌细胞培养基）条件下，将约30,000个活心肌细胞以滴加方式直接接种到水凝胶基质上，每孔接种约30,000个活细胞。盖上盖子后，将心肌细胞在罩内室温下静置孵育10至15分钟，避免扰动，以使细胞能够黏附于水凝胶基质上。向每个孔中轻柔加入 100 µL 新鲜心肌细胞培养基。将盖好盖子的培养板放入 37°C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 2 至 4 天。打开显微镜和环境控制腔室，使其平衡至 37°C 和 5% CO₂。从48孔板中移除心肌细胞培养基，然后用600微升心脏收缩力调节（CCM）检测培养基轻轻冲洗每个孔两次。随后每孔加入300微升CCM检测培养基，将48孔板置于显微镜的环境控制腔室内。插入电极，使细胞平衡5分钟。使用基于视频的显微技术记录收缩视频时，打开视频录制软件并将帧率设置为每秒100帧。然后在hiPSC-CM单层细胞的中央附近选择一个感兴趣区域（ROI）。随后使用商用脉冲发生器对细胞进行场刺激，以电刺激方式起搏二维心肌细胞单层。将心肌细胞置于1.5倍阈值、1赫兹的基线脉冲参数下进行刺激。例如，采用单相方波起搏脉冲，刺激脉冲持续时间为2毫秒，电压为5伏。在CCM之前仅记录基线起搏收缩视频，至少持续5个搏动。随后，使用实验性电刺激信号刺激心肌细胞单层，该信号具有30毫秒延迟、两个对称的双相脉冲，每相持续时间为5.14毫秒，总持续时间为20.56毫秒，每相振幅为10伏，相间间隔为零。记录至少五个心动周期的CCM诱导收缩视频。关闭CCM信号，改用基础起搏脉冲进行刺激，并记录CCM结束后恢复期的收缩视频，至少持续五个心动周期。使用标准的收缩分析软件自动分析收缩视频，并量化关键的收缩特性，如收缩幅度、收缩斜率、舒张斜率、达峰时间、恢复至基线90%的时间以及50%收缩持续时间。对二维人源iPSC来源的心肌细胞单层的收缩特性进行了表征，并量化了心肌细胞收缩功能的关键参数。应用标准的CCM刺激参数后，体外心肌细胞的收缩功能得到增强。评估了在有或无CCM刺激条件下，细胞外钙离子浓度调节对人心肌细胞收缩特性的影响。观察到收缩具有预期的基础钙依赖性，同时还观察到CCM可提高心肌细胞单层的钙敏感性。此外，通过药理学手段对β-肾上腺素能信号通路进行探究，揭示了CCM诱导的正性肌力效应部分由β-肾上腺素能信号通路介导。此外，该工具可进一步扩展至患者特异性的疾病心肌细胞，包括扩张型心肌病的心肌细胞，以理解CCM在疾病状态下的作用。本文主要关注评估人类心肌的收缩特性。然而，利用该工具，还可以评估其他心脏兴奋-收缩耦联的检测指标，包括动作电位和钙处理。这是首个将诱导多能干细胞技术与心脏器械评估相结合的监管科学工具。这种替代方法为在培养皿中评估医疗器械铺平了道路，有望减少对动物和人体试验的需求。

evaluation-cardiac-contractility-modulation-therapy-2d-human-stem

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

2D人干细胞来源心肌细胞中心脏收缩力调节疗法的评估

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

在此，我们展示了由诱导性多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞生成人源工程化心肌组织的方法。我们介绍了一种分析收缩力的方法，并以hERG通道抑制剂E-4031引起收缩模式改变的示例进行说明。该方法具有高度的稳健性，适用于心脏药物筛选。...

用于心脏药物安全性筛选的人工心脏组织自动收缩分析

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

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在温度控制的384孔板中使用钙敏感荧光染料测量人诱导多能干细胞衍生心肌细胞合胞体的收缩

本文介绍了一种利用模拟心脏生理环境的电刺激和机械刺激来训练细胞群体的实验方案。这种电机械刺激可增强经处理细胞的心肌生成潜能，是在细胞治疗、疾病建模及药物筛选领域具有前景的策略。...

同步电刺激与机械刺激以增强细胞的心肌生成潜能

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

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用于临床前心脏风险评估的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞结构与收缩变化的杂交细胞分析系统

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

本方案介绍了如何使用MyoBLAZER系统测量供体心脏来源的成人原代心肌细胞的收缩力。MyoBLAZER是一种可靠的平台，可用于临床前药物研发阶段评估药物诱导的收缩力变化。...

分离的成年成人原代心肌细胞中心肌收缩力的测量

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

学习使用视频显微技术和柔性水凝胶基质评估人诱导多能干细胞来源心肌细胞的收缩特性。该方法为心脏电生理医疗器械的非侵入性评价提供了可靠工具，支持监管科学发展并加速患者获得创新疗法。

在二维人源干细胞衍生心肌细胞中评估心脏收缩力调节治疗

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