Name: 使用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学和代谢 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解SPH CRISPR激活系统在小鼠脂肪组织中研究米色脂肪生物学的方法。该技术利用腺相关病毒递送sgRNA靶向PRDM16基因，实现内源性基因过表达，为研究产热基因程序提供新途径。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者感谢来自巴西坎皮纳斯州立大学（Unicamp）实验动物科学生物学多学科研究中心（Cemib）的支持，该中心协助生成了AdipoSPH小鼠；同时感谢免疫代谢与细胞信号传导实验室以及国家科学技术研究所——光子学在细胞生物学中的应用（INFABIC）提供的全部实验支持。本研究获得圣保罗研究基金会（FAPESP）的经费支持：2019/15025-5；2020/09308-1；2020/14725-0；2021/11841-2。

动物实验按照坎皮纳斯大学《实验动物护理和使用指南》进行（实验动物使用协议编号 CEUA #5810-1/2021）。
1. 分子克隆
<ol>
	<li>单导向RNA（sgRNA）的设计
	<ol>
		<li>使用 CHOPCHOP 设计用于 CRISPR 激活的 sgRNA，网址为 https://chopchop.cbu.uib.no/&#160;或任何其他合适的工具。使用以下参数设计靶向 Prdm16 基因的 sgRNA：靶基因：Prdm16；物种：Mus musculus；方法：Crispr/Cas9；目的：激活。 
		注意：针对转录起始位点（TSS）上游200 bp区域内的每个目标区域设计sgRNA。例如，本研究中靶向Prdm16的sgRNA结合于TSS上游154 bp处。</li>
		<li>为sgRNA添加与载体骨架pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry中SacI限制性酶切位点相匹配的突出端（参见 材料表）。包含序列：5'- (N20)AGCT-3'（N = 核苷酸）。例如，靶向 Prdm16 基因的序列为 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3'，加上突出端后为 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'。</li>
		<li>使用可用的工具获取 3' sgRNA 反向互补序列&#160;https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html。例如，靶向 Prdm16 基因的 3’ sgRNA 序列为 3’- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5’。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>互补单链寡核苷酸的退火
	<ol>
		<li>加入1 µL的5'和3'单链寡核苷酸（各100 µM储备浓度）、1 µL T4连接酶缓冲液、0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）（1 × 104 单位/毫升）和 6.5 µL 的 H2O至终反应体积为10 µL。使用PCR仪以下列条件使互补的单链寡核苷酸退火：37 °C孵育30分钟，95 °C孵育5分钟，随后以5 °C/min的降温速率降温。 
		&#8203;注意：PNK 酶随附 PNK 缓冲液，但不含磷酸化反应所需的足量 ATP（参见 材料表）。为简化反应，使用T4连接酶缓冲液（而非PNK缓冲液）。T4连接酶缓冲液可提供磷酸化反应所需的适量ATP（1 mM）。PNK酶用于寡核苷酸5'末端的磷酸化，以进行后续的连接反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>退火后的sgRNA寡核苷酸连接
	<ol>
		<li>将25 ng质粒pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry与2 µL退火的sgRNA寡核苷酸、1 µL SacI酶、2 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA连接酶（1-3 u/µL）混合（参见 材料表）和 H2最终反应体系体积为10 µL。</li>
		<li>使用PCR仪孵育反应体系进行连接反应，程序设置如下：37 °C 5分钟、25 °C 5分钟，共15个循环，最后在4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化后菌落聚合酶链式反应（PCR）
	<ol>
		<li>转化感受态细胞 E. coli DH10B&#160;细胞（参见 材料表使用4 µL连接产物通过热激法（42 °C，45 s）转化，并涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的琼脂平板上。</li>
		<li>使用PCR预混液通过菌落PCR验证转化子菌落（参见 材料表）。挑取菌落，与5 µL预混液、0.1 µL通用引物（储存浓度：100 µM）、0.1 µL sgRNA反向引物（储存浓度：100 µM）混合表1）以及 5 µL H2O. 使用PCR仪进行PCR反应，反应条件如下：初始变性（94 °C，2 min）；随后进行35个循环的变性（94 °C，20 s）、退火（60 °C，30 s）、延伸（72 °C，30 s）；最后进行终延伸（72 °C，5 min）。采用1.5%琼脂糖凝胶，在0.5×TAE缓冲液中以90 V电泳30 min分离DNA。 
		&#8203;注意：阳性克隆会产生约 280 bp 的条带。</li>
		<li>使用通用引物对阳性样本进行Sanger测序表1，补充文件1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒纯化
	<ol>
		<li>使用质粒纯化试剂盒从阳性克隆中纯化质粒（参见 材料表），按照制造商的说明进行操作。 
		注意：使用阴离子交换树脂或适用于细胞转染的其他试剂盒纯化质粒。</li>
		<li>在含有100 µg/mL氨苄青霉素的标准细菌培养基中，将阳性克隆于37 °C、200 rpm振荡培养12小时。</li>
		<li>将细菌细胞在 6,000 × g 4 °C 下离心 10 分钟。随后根据试剂盒说明书的步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. AAV 包装
注意：AAV 包装按照先前发表的文献15,16进行，仅做了 minor modifications。
<ol>
	<li>使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的25 mL DMEM培养基，将293T细胞（见材料表）接种于175 cm2培养瓶中（每瓶接种5 × 106个细胞）。在37 °C、5% CO2、95%湿度条件下培养，直至细胞融合度达到50%–70%。</li>
	<li>将14 µL聚乙烯亚胺（1 µg/µL）与1 mL 150 mM NaCl混合。将AAV生产所需的三种质粒按1:1:1的摩尔比混合（即17.7 µg pAdDeltaF6、7.9 µg AAV2/8（见材料表）和5.9 µg步骤1中克隆的sgRNA）溶于1 mL 150 mM NaCl中。将聚乙烯亚胺:NaCl混合液逐滴加入含DNA（质粒混合物）的离心管中，于25 °C孵育20分钟。 
	&#8203;注：pAdDeltaF6为辅助质粒，pCapsid pAAV2/8为包装质粒，表达复制（Rep）和衣壳（cap）基因。这两种质粒均为AAV生产所必需。</li>
	<li>转染前，将细胞培养基更换为含1% FBS和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（0.5 g/L）的18 mL DMEM。向每个培养瓶中加入2 mL聚乙烯亚胺:DNA混合液，并将细胞置于CO2培养箱（37 °C、5% CO2、95%湿度）中继续培养。</li>
	<li>5小时后，加入5 mL补充有10% FBS和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（0.5 g/L）的DMEM。</li>
	<li>孵育3天后，用细胞刮刀将细胞从培养瓶中刮下。收集10个（175 cm2）细胞培养瓶中的293T细胞至50 mL离心管中，并加入DMEM（见材料表）至终体积30 mL。</li>
	<li>向每个含293T细胞的50 mL离心管中加入3 mL氯仿，使用涡旋振荡器高速振荡混合5分钟。加入7.6 mL 5 M NaCl重悬细胞，并短暂涡旋。在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将水相转移至新的离心管中，加入9.4 mL 50%（v/v）聚乙二醇（PEG）8000。使用涡旋振荡器高速混合10秒，将样品置于冰上1小时。</li>
	<li>在4 °C条件下以3,000 × g离心30分钟。弃去上清液，让沉淀在空气中干燥10分钟。</li>
	<li>加入1.4 mL HEPES缓冲液（50 mM，pH 8），使用涡旋振荡器高速混合5分钟。加入3.5 µL 1 M MgCl2、14 µL DNase I（20单位/µL）和1.4 µL RNase A（10 µg/µL）。在37 °C水浴中孵育20分钟，然后将样品转移至新的1.5 mL离心管中（每管700 µL）。</li>
	<li>向每个1.5 mL离心管中加入700 µL氯仿，使用涡旋振荡器高速混合10秒。在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟，将水相转移至新管中。重复此步骤3次。</li>
	<li>在生物安全柜中挥发氯仿30分钟。然后，将300 µL水相转移至0.5 mL超滤离心管（见材料表）。在25 °C条件下以14,000 × g离心5分钟。弃去滤过液，再次离心直至全部液体通过滤膜。</li>
	<li>通过加入300 µL Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗滤膜，并用移液器吹打混匀溶液。在25 °C条件下以14,000 × g离心5分钟。重复该洗涤步骤4次。</li>
	<li>在25 °C条件下以14,000 × g离心8分钟。将滤膜倒置放入新离心管中，在25 °C条件下以1,000 × g离心2分钟。</li>
</ol>
3. 通过qPCR对AAV进行滴定
<ol>
	<li>按照 Fripont 等人15的原始研究方法，制备用于 AAV 滴定的标准曲线，并确定 AAV 滴度。</li>
</ol>
4. 在体 向腹股沟白色脂肪组织（iWAT）注射AAV
<ol>
	<li>根据每种材料的具体要求，分装手术所需器械和耗材，并进行灭菌处理。</li>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪进行麻醉。通过用力按压小鼠足爪和尾部并检查反射是否存在来确认麻醉效果。在小鼠眼睛上涂抹眼膏，以防止手术期间眼睛干涩。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于仰卧位，使用剃毛器在靠近髋关节的侧腹部区域剃除少量毛发，用于iWAT注射。涂抹脱毛膏5分钟，然后用水彻底清除残留脱毛膏，以避免皮肤灼伤。</li>
	<li>使用干净的纱布交替进行三轮皮肤消毒：先用消毒液（聚维酮碘）涂抹皮肤，再用70%酒精处理。每次使用后丢弃纱布。</li>
	<li>最后再对皮肤进行一次消毒液涂抹。&#160;然后，用灭菌剪刀在关节近端区域做1-2 cm切口，用镊子撑开皮肤以暴露脂肪组织。白色脂肪组织（WAT）附着于皮肤两侧，从背部起始处向下延伸至睾丸区域。 
	注意：&#160;手术或缝合过程中应使用手术巾以避免污染。</li>
	<li>通过切口用镊子轻轻将脂肪组织向上提起，以确保注射位置和深度准确。 
	注意：操作时需小心，避免将组织从其原始位置移出。</li>
	<li>使用微量注射器（规格：33；针尖类型：4；角度：12；长度：10）（参见材料表），吸取2.5 µL AAV（含靶向内源性Prdm16基因的sgRNA，浓度为5.6 × 1010 病毒基因组 [VG]/µL）。将针头以30°–45°角小心插入iWAT中。在组织的不同位置重复注射5次，以实现对整个iWAT脂肪垫的均匀感染。建议总注射体积为15 µL。 
	注意：注射深度取决于脂肪垫的厚度。&#160;抽吸注射液时应采用无接触技术。</li>
	<li>使用4/0单股缝线缝合剃毛区域的皮肤切口。将小鼠置于加热垫上，直至意识恢复。每10–15分钟监测一次动物状态，直至完全苏醒。动物恢复意识后，观察其运动行为，应呈直线行走，无痛苦或不适表现。</li>
	<li>术后48小时内进行疼痛控制，腹腔注射盐酸曲马多（5 mg/kg），连续给药3天（每日2次）。 
	注意：应密切观察动物是否出现痛苦或不适迹象，并监测饮水和进食情况。&#160;建议在手术前或手术开始时预先给予有效剂量的镇痛药，以实现预防性镇痛。&#160;</li>
	<li>在恢复期间，将小鼠饲养于可自由获取食物和饮水的笼具中。恢复期结束后，实施安乐死。本研究中采用注射麻醉剂过量（腹腔注射）的方式进行安乐死，剂量为诱导剂量的3倍（300–360 mg/kg盐酸氯胺酮 + 30–40 mg/kg盐酸赛拉嗪），随后进行断头处理。 
	&#8203;注意：强烈建议在动物完全从麻醉中恢复之前，将其单独饲养于独立笼具中。</li>
</ol>
5. 体外 基质血管细胞（SVFs）向米色脂肪细胞的分化
<ol>
	<li>根据 Aune 等人的方法17，从 AdipoSPH 小鼠的 iWAT 中分离并接种原代 SVF。将来源于 AdipoSPH 小鼠 iWAT 的 SVF 接种至含有完全培养基（DMEM，含 3.1 g/L 葡萄糖、0.5 g/L L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、10% FBS 和 2.5% P/S）的 6 孔板中，孵育 1–2 小时。 
	注意：SVF 组分包含多种不同类型的细胞。在此步骤中，尚无法确定能够分化为脂肪细胞的接种前体细胞数量。</li>
	<li>吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（1× PBS）洗涤孔板 2 次，然后更换为新鲜完全培养基。将细胞置于 37 °C、5% CO2、95% 湿度条件下培养，直至细胞融合度达到 70%–80%。</li>
	<li>通过加入诱导培养基（表 2）启动分化（第 0 天）。 
	注意：诱导培养基中的药物混合物对于增强米色脂肪细胞分化以及促进产热基因程序的表达是必需的17。</li>
	<li>2 天后（第 2 天），将诱导培养基更换为维持培养基（表 2）。</li>
	<li>再过 2 天后（第 4 天），将维持培养基更换为新鲜维持培养基（表 2），继续培养 2 至 3 天。</li>
	<li>此后每 48 小时更换一次维持培养基，直至前脂肪细胞完全分化为成熟脂肪细胞（通常在加入诱导培养基后约 6 天）。可通过光学显微镜观察成熟脂肪细胞，此时分化后的细胞可见富含脂滴。</li>
</ol>
6. 体外 SVF的AAV感染
注意：来自 AdipoSPH 小鼠 iWAT 的基质血管组分（SVF）用携带 sgRNA-Prdm16 的腺相关病毒（AAV）进行感染，具体方法参照 Wang 等人先前描述的方法18，并稍作修改。
<ol>
	<li>按照步骤 5.1-5.3 中所述方法，将细胞接种于 6 孔培养板中，使用完全培养基培养，直至细胞融合度达到 70%-80%。</li>
	<li>将携带 sgRNA-Prdm16 的 AAV 以 5.6 × 1010 VG/µL 的浓度与 2 mL 完全培养基及六甲基溴化铵（8 µg/mL）混合（参见材料表）。更换完全培养基，加入含有 AAV 的完全培养基以转导细胞。将转导后的细胞在 37 °C、95% 湿度、5% CO2 条件下孵育 12 小时。</li>
	<li>按照步骤 5 的方法对细胞进行传代和接种，以促进其增殖并分化为米色脂肪细胞。 
	注意：进行耗氧量检测时，将步骤 6.2 中获得的 4.0 × 104 个细胞接种于 24 孔细胞培养板中，每孔加入诱导培养基。后续的细胞增殖与分化步骤按步骤 5 所述进行。当细胞融合度达到 80%-100% 并完全分化后，进行耗氧量检测，方法如先前报道19。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Cohen, P., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+functional+complexity+of+thermogenic+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cellular and functional complexity of thermogenic fat.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+editing%3A+Repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-mediated+control+of+gene+repression+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li>
<li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification%2C+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960(2019).</li>
<li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+production+everywhere%3A+a+simple%2C+fast%2C+and+reliable+protocol+for+in-house+aav+vector+production+based+on+chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction.</a> Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103(2020).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li>
<li>Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+murine+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100118(2020).</li>
<li>Cohen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+PRDM16+and+beige+adipose+causes+metabolic+dysfunction+and+a+subcutaneous+to+visceral+fat+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch.</a> Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).</li>
<li>Harms, M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+and+beige+fat%3A+development%2C+function+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm16+determines+the+thermogenic+program+of+subcutaneous+white+adipose+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+adipose+tissue+development+from+transgenic+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding adipose tissue development from transgenic animal models.</a> Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).</li>
<li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+an+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+issues+in+AAV-mediated+in+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).</li>
<li>Deshmukh, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics-based+comparative+mapping+of+the+secretomes+of+human+brown+and+white+adipocytes+reveals+EPDR1+as+a+novel+batokine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).</li>
<li>Sponton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+glucose+and+lipid+homeostasis+via+PLTP+as+a+mediator+of+BAT-liver+communication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication.</a> EMBO reports. 21 (9), 49828(2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CRISPR 技术最有用的非编辑应用之一是通过 CRISPRa 系统激活内源性基因，从而研究基因功能6。SPH 是一种高效的 CRISPRa 系统，最初被报道可通过靶向多个神经发生相关基因，诱导星形胶质细胞转化为活性神经元14。在本研究中，AdipoSPH 被证明是研究米色脂肪生物学的合适工具，其通过激活脂肪细胞中内源性 Prdm16 的表达发挥作用。SPH 诱导的脂肪细胞中 Prdm16 过表达可激活产热基因程序，并诱导出现米色化表型，该表型模拟了此前报道的 Prdm16 转基因（Tg）小鼠模型23。本研究选择 Prdm16 作为诱导米色脂肪细胞的靶基因，是基于该转录因子在调控棕色和米色脂肪分化过程中的核心作用，以及其在成熟脂肪细胞中对产热基因程序（例如，增强 Ucp1 表达）的调控功能。然而，当前模型允许研究人员根据研究目的，选择性地过表达任意内源性基因。
研究脂肪组织生物学的传统转基因模型依赖于基因改造的啮齿类动物，这些动物在脂肪细胞...

米色（或称“褐样”）脂肪细胞是一类表达解偶联蛋白1（UCP1）且富含线粒体的脂肪细胞，存在于白色脂肪组织（WAT）库中。米色脂肪可在寒冷暴露及其他刺激条件下，由一部分脂肪前体细胞或成熟的白色脂肪细胞转化而来1,2。米色脂肪细胞能够以依赖或不依赖UCP1的方式将能量转化为热量3。无论其产热功能如何，米色脂肪还可通过其他机制改善代谢健康，例如分泌脂肪因子以及发挥抗炎和抗纤维化作用。在小鼠和人类中的研究表明，诱导米色脂肪生成可改善全身的葡萄糖和脂质稳态3。然而，尽管近年来对米色脂肪生物学的认识迅速发展，其大多数代谢益处及相关机制仍尚未完全阐明。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）最初在真核细胞中被描述为一种可通过Cas9蛋白的核酸酶活性在基因组特定位点产生双链断裂（DSB）的工具4,5。Cas9由合成的单链引导RNA（sgRNA）引导，靶向特定的基因组区域，从而导致DNA双链断裂。除了利用Cas9核酸酶进行基因编辑外，CRISPR-Cas9技术还发展成为一种序列特异性的基因调控工具6。通过开发出催化失活的Cas9蛋白（dCas9），并将其与能够增强基因表达的转录调控模块相融合，由此诞生了CRISPR激活（CRISPRa）工具。目前已出现多种CRISPRa系统，例如VP647,8、协同激活介质（SAM）9、SunTag10,11、VPR12,13以及SunTag-p65-HSF1（SPH）14，后者结合了SAM与SunTag激活系统的组分。最近的研究表明，在N2a神经母细胞和原代星形胶质细胞中，使用SPH诱导神经发生相关基因的表达水平高于其他CRISPRa系统14，证明SPH是一种具有前景的CRISPRa工具。
在此，我们利用了一种先前开发的SPH小鼠14 构建一种条件性小鼠模型，使其在脂肪细胞中特异性表达SPH，该模型基于脂联素Cre谱系（AdipoSPH）。通过使用携带靶向内源性Prdm16基因的gRNA的腺相关病毒（AAV），诱导腹股沟白色脂肪组织（iWAT）发生米色化（白色向米色转化），从而增强产热基因程序的表达。此外， 体外 Prdm16 过表达增强了耗氧量。因此，该方案提供了一种多功能的 SPH 小鼠模型，可用于探索脂肪组织内米色脂肪发育的机制。

<table><tbody><tr><td>3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2877</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro 293T 细胞系</td><td>Takarabio</td><td>632273</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心滤膜</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC510008</td><td>100 KDa</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）F-12，含 GlutaMAX&amp;trade; 添加剂</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td>高浓度葡萄糖、氨基酸和维生素</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Excelta 自开式显微剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 细胞刮刀（100 个装）</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 高精度直头锥形超细尖镊子/持针钳</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 尖头解剖剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>六亚甲基溴化铵（Polybrene）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast 快速 DNA 连接系统</td><td>Promega</td><td>M8225</td><td></td></tr><tr><td>质粒大提纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>微升注射器</td><td>Hamilton</td><td>80308</td><td>型号 701</td></tr><tr><td>NEB 10-beta/Stable&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019H</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 感受态细胞</td></tr><tr><td>pAAV2/8&amp;nbsp;</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>112864</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>91947</td><td></td></tr><tr><td>pAdDeltaF6&amp;nbsp;</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23966</td><td>线性，分子量 25000</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Rioqu&amp;iacute;mica</td><td>510101303</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>罗格列酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>SacI 酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Design Premier Adson 镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-741</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td>475-40417</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Promega</td><td>M180B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶缓冲液&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 酶试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>盐酸曲马多</td><td>SEM</td><td>43930</td><td></td></tr><tr><td>Vidisic 凝胶&amp;nbsp;</td><td>Bausch + Lomb&amp;nbsp;</td><td>99620</td><td></td></tr></tbody></table>

利用crispr suntag-p65-hsf1激活系统研究米色脂肪生物学与代谢

Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术推动了生物学领域的革命，近年来该技术的应用已远远超出最初描述的基因编辑范畴。CRISPR激活系统（CRISPRa）将无催化活性的Cas9（dCas9）蛋白与不同的转录调控模块结合，以诱导内源性基因表达。SunTag-p65-HSF1（SPH）是一种近期开发的CRISPRa技术，它将协同激活介质（SAMs）的组分与SunTag激活元件相结合。该系统可通过设计定制的单导向RNA（sgRNA）实现单个或多个基因的过表达。在本研究中，利用先前构建的SPH小鼠，生成了一种在脂肪细胞中条件性表达SPH（脂肪素Cre谱系）的小鼠模型，命名为AdipoSPH。为诱导白色脂肪向米色脂肪转化（即“褐变”表型），将携带靶向内源Prdm16基因（一个已被充分证实与棕色及米色脂肪发育相关的转录因子）的sgRNA的腺相关病毒（AAV）注射至腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中。该小鼠模型成功诱导了内源Prdm16的表达，并激活了产热相关基因程序。此外， 体外 SPH诱导的Prdm16过表达增强了米色脂肪细胞的耗氧量，表型模拟了先前Prdm16转基因小鼠模型的结果。因此，本方案描述了一种多功能、低成本且省时的小鼠模型，可用于脂肪组织生物学的研究。

AdipoSPH 小鼠系通过繁育 SPH 与 Adipoq-Cre 小鼠品系而获得。两个小鼠品系均具有 C57BL6J-DBA/2J 杂交背景（根据商业供应商信息；参见 材料列表SPH小鼠品系最初由Zhou等人描述。14.
体内 通过 AdipoSPH 介导的 Prdm16 过表达促进米色脂肪细胞发育 
为评估本研究所描述模型形成米色脂肪细胞的能力 体内将携带靶向Prdm16基因sgRNA的腺相关病毒注射至AdipoSPH小鼠的腹股沟白色脂肪组织。Prdm16是决定米色脂肪细胞发育与功能的明确转录因子。20,21需要说明的是，此处我们选择了一种经过先前测试和验证的、靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA。14携带空载 s...

本方案介绍了在脂肪细胞中使用CRISPR SunTag-p65-HSF1（AdipoSPH）作为研究米色脂肪生物学的一种替代腺相关病毒（AAV）的策略。 在体 注射携带靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA 的 AAV 足以诱导米色脂肪发育并增强产热基因程序。

利用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学与代谢

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术推动了生物学领域的革命，近年来开发的工具已被广泛应用于……

本方案介绍了SPH CRISPR激活系统，作为一种替代传统病毒载体的策略，用于在脂肪细胞中进行功能获得性实验。该系统通过腺相关病毒递送定制的单链向导RNA，可在脂肪组织复杂的细胞环境中实现单个或多个脂肪细胞内源性基因的过表达。本方案中的难点步骤涉及单链向导RNA的克隆，以及腺相关病毒的制备和向脂肪组织中的注射。首先，使用 chopchop 或其他合适的工具设计用于 CRISPR 激活的单导向 RNA（sgRNA）。根据以下参数设计靶向 PRDM16 基因的 sgRNA：以小鼠（Mus musculus）中的 PRDM16 基因为靶标，采用 CRISPR/Cas9 系统进行激活。为 sgRNA 添加末端突出序列，以匹配载体骨架 PAAVU6GRNACBHM cherry 中的 Sac1 限制性酶切位点。包含 5'AGCT 3'，其中 n 代表核苷酸。使用指定工具获取 3' sgRNA 的反向互补序列。接下来，为使单链互补寡核苷酸退火，加入 1 微升 5' 单链寡核苷酸和 1 微升 3' 单链寡核苷酸、1 微升 T4 连接酶缓冲液、0.5 微升 T4 多核苷酸激酶以及 6.5 微升水，最终反应体系为 10 微升。使用PCR仪对互补的单链寡核苷酸进行退火处理，先在37摄氏度孵育30分钟，再在95摄氏度孵育5分钟，随后以每分钟降低5摄氏度的速率降温。退火完成后，进行sgRNA寡核苷酸的连接反应：在10微升的终反应体系中加入25纳克PAAVU6GRNACBHM cherry质粒、2微升退火后的sgRNA寡核苷酸、1微升Sac1酶、2微升10倍浓度的T4 DNA连接酶缓冲液、1微升T4 DNA连接酶以及适量水。使用PCR仪进行连接反应，程序设置为37摄氏度孵育5分钟、25摄氏度孵育5分钟，共循环15次，最后在4摄氏度保存。接下来，将4微升连接产物通过42摄氏度热激45秒转化至感受态大肠杆菌DH10B细胞中，并涂布于含有10微克/毫升氨苄青霉素的琼脂平板上。使用PCR预混液通过菌落聚合酶链式反应（PCR）验证转化菌落：挑取单菌落，加入5微升预混液、0.1微升通用引物、0.1微升sgRNA反向引物以及5微升水，混匀后进行PCR扩增。PCR程序设置如下：94摄氏度预变性2分钟；随后进行35个循环，每个循环包括94摄氏度变性20秒、60摄氏度退火30秒、72摄氏度延伸30秒；最后在72摄氏度进行终延伸5分钟。PCR结束后，使用0.5X TAE缓冲液在90伏电压下进行琼脂糖凝胶电泳分离DNA，电泳时间为30分钟。将阳性样品使用通用引物送测Sanger测序。随后，根据制造商说明书，使用质粒提取试剂盒从阳性克隆中纯化质粒。将麻醉后的小鼠置于仰卧位，使用剃毛器在靠近髋关节的腹侧区域剃除少量毛发，用于腹股沟白色脂肪组织（IWAT）注射。涂抹脱毛膏并保持五分钟。用清水去除残留的脱毛膏，以避

investigation-beige-fat-biology-metabolism-using-crispr-suntag-p65

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学和代谢

从小鼠白色脂肪组织中分离得到的原代白色前脂肪细胞可分化为米色/褐色样细胞。本文介绍了一种可靠的细胞模型系统，用于研究白色脂肪“褐变”的分子调控机制。...

基质血管细胞的分离与向米色/褐色样细胞的分化

在本视频报告中，我们展示了切伦科夫发光成像（CLI）技术在小鼠肩胛间棕色脂肪组织中的应用，涵盖其在激活状态和抑制状态下的成像结果。...

肩胛间棕色脂肪组织的切伦科夫发光成像

本文介绍了一种从成熟脂肪细胞中分离细胞核、通过荧光激活分选进行纯化以及在单细胞水平上进行转录组学分析的实验方案。...

用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

本报告描述了一种从新生小鼠中同时分离原代棕色和白色前脂肪细胞的实验方案。分离得到的细胞可在体外培养，并可诱导其分化为完全成熟的白色和棕色脂肪细胞。该方法可用于在培养条件下对原代脂肪细胞进行遗传学、分子水平及功能特性分析。...

从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞

利用微型PET/MR成像方法对小鼠产热性脂肪组织库进行功能成像与定量分析。...

使用[18F]FDG微正电子发射断层扫描/磁共振成像对小鼠棕色和米色脂肪组织进行可视化与定量分析

本文介绍了一种用于量化棕色脂肪组织（BAT）活性对人类代谢生理学意义的实验方案。该方法通过结合碳水化合物负荷、间接热量测定法以及锁骨上区域温度变化的测量来实现。这种新颖的方法有助于开发针对人类棕色脂肪组织产热作用的药物靶点。...

结合间接热量测定法、红外热成像和血糖水平检测来测量人体棕色脂肪组织产热活性

本文介绍了一种用于测量人类和实验动物餐后棕色脂肪组织活性的实验方案。...

红外热成像技术用于检测棕色脂肪组织活性变化

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。...

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

本文介绍了一种详细方案，阐述如何利用从啮齿类动物或人类脂肪组织中分离出的微血管片段，作为一种简便的方法来构建具有功能性的血管化米色脂肪组织。...

由微血管片段构建血管化产热脂肪组织的三维培养

在本实验方案中，我们描述了利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统相结合的技术，构建脂肪组织特异性敲除小鼠的方法。所述步骤包括sgRNA的设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及将AAV显微注射至棕色脂肪组织（BAT）叶中的操作。...

利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9与腺相关病毒单导向RNA系统联合构建棕色脂肪特异性基因敲除小鼠

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

了解SPH CRISPR激活系统在小鼠脂肪组织中研究米色脂肪生物学的方法。该技术利用腺相关病毒递送sgRNA靶向PRDM16基因，实现内源性基因过表达，为研究产热基因程序提供新途径。

利用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学与代谢

探索更多视频