Name: 胚胎和肝脏斑马鱼细胞系球状体的3D培养方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学习使用ZEM2S和ZFL细胞系建立斑马鱼球状体的三维培养方法。该方案操作简便快速，可生成大小均一的球状体，适用于鱼类毒性检测和环境安全评估研究。

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谨以此文纪念本文的共同作者 Márcio Lorencini 博士，他是一位杰出的化妆品领域研究人员，毕生致力于推动巴西的化妆品研究。作者感谢巴拉那联邦大学生理学系多用户实验室提供的设备支持，以及高等教育人员改善协调机构（CAPES，巴西）（资助代码 001）和 Grupo Boticário 提供的经费支持。

在圆底96孔板中生成ZFL和ZEM2S细胞系三维球状体的关键步骤如图1所示。
注意：有关本实验方案中使用的所有材料的详细信息，请参见材料表；本实验方案中所用溶液和培养基的详细信息，请参见表1。
1. 细胞培养基与单层细胞培养
<ol>
	<li>将两种细胞系（ZFL、ZEM2S）在28 °C、无CO2的培养箱中以单层形式培养，当细胞融合度达到约80%时，按1:3的传代比例进行传代。
	<ol>
		<li>从一个培养至约80%融合度的T75培养瓶中开始，该瓶中的斑马鱼细胞按上述方法培养。</li>
		<li>移除完全培养基，并借助移液器向培养瓶中加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 M）清洗细胞。</li>
		<li>借助移液器向培养瓶中加入3 mL 1×胰蛋白酶-0.5 mM EDTA（0.05% [v/v]），在28 °C下孵育3分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。</li>
		<li>轻轻敲击培养瓶以释放细胞，然后加入3 mL完全培养基终止胰蛋白酶消化作用。</li>
		<li>使用移液器将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，在100 × g 条件下离心5分钟。</li>
		<li>待细胞沉淀形成后，小心吸除上清液，加入1 mL相应细胞系（ZFL或ZEM2S）的完全培养基，并用移液器重悬细胞。取部分细胞悬液用于细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用台盼蓝染料排斥法进行细胞计数
<ol>
	<li>取 10 µL 细胞悬液和 10 µL 台盼蓝染液加入微量离心管中，用于细胞计数和活力评估。使用移液器混匀细胞悬液与染液。</li>
	<li>然后，取 10 µL 上述混合液（细胞悬液 + 台盼蓝）加入血细胞计数板（Neubauer 计数室），计数位于计数室四角的四个大方格（象限：Q）中的细胞，未被台盼蓝染色的细胞视为活细胞。使用公式（1）计算活细胞数量： 
	<img alt="细胞数量计算公式，ΣQ/4 × 10⁴，定量分析用公式示意图" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">     （1）</li>
	<li>为计算细胞悬液中的最终细胞数量，需将通过公式（1）得出的细胞数乘以 2（因使用台盼蓝导致的稀释倍数）。 
	注：也可使用自动细胞计数系统。</li>
</ol>
3. 在 ULA-培养板中进行细胞接种
<ol>
	<li>计算细胞数量后，将细胞悬液调整至适宜浓度用于接种培养板 200 µL 每孔加入该悬浮液，接种于96孔圆底超低吸附板中，每种细胞系所需细胞数量如下所示：
	<ol>
		<li>接种7,000个存活细胞 ZFL 每孔细胞数；因此，对于整块ULA板，使用700,000个细胞加入20 mL完全培养基中。</li>
		<li>接种 3,500 个可存活细胞 ZEM2S 每孔细胞数；因此，对于整块ULA板，使用350,000个细胞加入20 mL完全培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在培养基储液槽中制备调整好细胞浓度的细胞悬液，并使用多通道移液器轻轻混匀，注意避免产生泡沫或气泡。使用多通道移液器加入 200 µL 将调整后的细胞悬液加入超低吸附培养板（ULA-plate）的每孔中。 
	注意：必须使用石蜡膜或压敏封口膜密封培养板，以防止96孔板中的培养基蒸发。</li>
</ol>
4. 类球体形成
<ol>
	<li>将ULA板置于28 °C培养箱中，在70 rpm的摇床上孵育5天。通过5天的旋转摇动使球状体形成（图2），其平均直径达到约225 µm（ZFL球状体）和约226 µm（ZEM2S球状体）12。 
	注意：孵育5天后（此时圆形度最大），球状体即可用于后续实验。</li>
	<li>若需将球状体在培养中维持超过5天，每5天用多通道移液器移除100 µL用过的培养基，并加入100 µL新鲜的完全培养基。 
	​注意：操作过程中注意避免吸出球状体。</li>
</ol>
5. 类球体大小（直径）和形态（圆形度指数）的测量
<ol>
	<li>获取图像。
	<ol>
		<li>在配备图像采集系统的倒置光学显微镜下，获取一个已知标尺的图像。 
		注意：使用显微镜载物台校准载玻片或已知象限尺寸的血细胞计数板（Neubauer板）来获取比例尺。</li>
		<li>在显微镜下，使用获取刻度图像时所用的同一物镜，拍摄完全形成的球状体（即.，5天大的球体。 
		注意：所有图像必须使用相同的成像采集系统拍摄，因为图像分辨率对于确定类球体的大小和形状至关重要，而不同类型的系统之间分辨率可能存在差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置比例尺。
	<ol>
		<li>使用 ImageJ 软件打开已定义尺度的图像（点击 文件 | 打开).</li>
		<li>选择 直线选择器 从工具栏中选择，并用鼠标在图像中已定义标尺的延长线上拖动以绘制一条线。</li>
		<li>设置比例尺，通过选择 分析 | 设置比例尺，并等待 设定比例尺 窗口打开。</li>
		<li>在 设置比例尺 窗口，填写空白处 已知距离 已知距离（µm）对应于直线；填充 长度单位 与 um 用于 µm. 点击 好的. 
		注意：比例尺单位为像素/µm 显示在窗口底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置测量参数。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 软件中，选择 分析 | 设置测量参数 打开 设置测量参数 窗口</li>
		<li>在 设置测量参数 窗口中，选中所需测量项目的复选框（即， 面积 和 形态 描述符）。点击 好的.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量类球体的直径和圆度。
	<ol>
		<li>打开类球体的图像（文件 | 打开).</li>
		<li>选择 自由选择工具 在工具栏中，使用鼠标选择类球体的外侧，如图所示 图3A. 
		注意：要放大或缩小图像，请按住 Ctrl 键并使用鼠标向上或向下滚动，或按下 Ctrl 使用键盘上的向上或向下箭头键进行选择。</li>
		<li>选择 分析 | 测量 以打开 结果 窗口，用于显示测量值。</li>
		<li>使用 面积 值，使用公式（计算球状体的大小（直径）2): 
		<img alt="圆直径的计算公式：\(d = \sqrt{\frac{\text{面积}}{\pi}} \times 2\)；几何代数。" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">     (2)</li>
		<li>圆形度指数在结果窗口中显示为“Circ.”，并由软件根据公式（3): 
		<img alt="形状紧凑度公式，\(4\pi \times \frac{\text{面积}}{\text{周长}^2}\)，数学方程。" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3">     (3) 
		注意：圆形度指数为1.0时代表完美的球形形态，而接近0.0的值则表示细长的形态13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

这是一种简单、便捷且快速的方法，用于生成斑马鱼肝细胞和胚胎细胞系的球状体。本研究团队在现有三维球状体方法的基础上进行改进，开发了该方法，以克服科学文献中报道的与球状体形成相关的问题，以及三维球状体检测中数据准确性存在的不确定性。例如，已有报道指出，传统方法存在操作困难、生成球状体耗时、进行检测前需挑选大小和形状相似的球状体，以及在悬滴法中将球状体从液滴转移至微孔板过程中存在技术难题3,7,12。此外，本实验方案建议在无CO2条件下培养ZFL和ZEM2S细胞系。本方案中针对这两种细胞系所推荐的培养基组成及无CO2培养环境在文献中已有广泛报道。ZFL细胞系通常在L-15和RPMI培养基中培养，可添加或不添加碳酸氢钠，且无需CO2环境14,15,<sup ...

类球体是在三维培养条件下，细胞紧密接触生长而形成的细胞小球。类球体具有模拟 体内 组织微环境已在多种细胞系和原代细胞中得到研究1,2然而，尽管球状体已广泛应用于哺乳动物的毒性研究，但针对非哺乳类脊椎动物（如鱼类）的毒性研究用球状体的开发仍处于进行中3对于鱼类细胞系，类球体已通过多种不同方法制备，例如使用不同类型的培养板进行轨道振荡（OS）3,4,5,6,7，以及利用磁性纳米颗粒的磁悬浮方法8然而，某些用于球体培养的方法可能存在较多缺点。
例如，在大型微孔板（24孔板）中使用旋转法可能产生大量大小和形状各异的类球体；事实上，已有研究证实可形成多类球体结构7。因此，实验前需耗费大量人力手动挑选大小和形态相似的类球体。悬滴三维培养法常用于哺乳动物细胞系类球体的制备1,2,9,10,11，该方法可在每个液滴中生成单个类球体，从而避免上述问题。然而，尽管改良的悬滴法（悬滴结合轨道振荡）能够以低成本方法生成ZFL类球体，但仍存在一些缺点12。所形成的细胞聚集体无法在液滴中长期维持，因此必须将其转移至孔板中。该过程需要大量操作，并需在超净工作台中长时间逐滴使用微量移液器完成12。此外，该方法需要10天时间才能完全形成ZFL类球体（5天悬滴培养 + 5天OS培养）12。这些局限性可能制约三维鱼类类球体在毒性测试中的应用，尤其是在化学品优先排序和产品可持续性等潜在应用方面。
因此，本文描述了一种3D培养方案，该方案基于96孔超低吸附板（ULA板）和轨道摇床（22 mm旋转直径）的联合使用，能够生成ZFL（D. rerio 正常肝细胞）和ZEM2S（D. rerio 囊胚期胚胎）细胞系的单个球状体。该方法操作简便且可重复，在较短时间内（5天）即可产生大量大小和形态相似的球状体。该方法的优势有助于推动鱼类3D模型在工业和学术界水生毒性研究中的应用，以及促进生态毒性测试替代方法的发展。

<table><tbody><tr><td>96孔透明圆底超低吸附微孔板，独立包装，带盖，无菌</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，粉末，高糖，含丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 营养混合物，粉末</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Java图像处理与分析软件（ImageJ）1.52p 版</td><td>&amp;nbsp;National&lt;br/&gt; Institutes of Health, USA</td><td></td><td>可访问网址：https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基，粉末</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床&amp;nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm 旋转直径</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (10倍浓度)，含钙和镁</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td></td></tr><tr><td>FBS－胎牛血清，经鉴定合格，来自美国农业部批准地区</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠，粉末，分子生物学级生物试剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液（0.4%）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.5%），不含酚红</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>该细胞系由美国威斯康星大学密尔沃基分校 Michael J.&lt;br/&gt; Carvan 教授惠赠</td></tr><tr><td>ZFL 细胞系</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

一种斑马鱼胚胎和肝脏细胞系球状体的三维培养方法

A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines

鱼类细胞系具有广阔的应用前景 体外 生态毒理学评估模型；然而，传统的单层培养系统（二维培养）存在众所周知的局限性（例如，培养寿命及某些功能的维持） 体内 细胞功能）。因此，人们提出了类球体等三维培养模型，因为这些模型能够重现类似组织的结构，更真实地模拟 体内 条件。本文介绍了一种高效、简便且快速的三维培养方案，用于利用两种斑马鱼（斑马鱼细胞系：ZEM2S（胚胎来源）和 ZFL（正常肝细胞）。该方案包括将细胞接种于圆底、超低吸附性 96 孔板中，在 70 rpm 转速下振荡培养 5 天后，每孔形成一个单一类球体。所形成的类球体具有稳定的大小和形态，该方法可避免单孔内形成多个类球体，因此无需手动挑选大小一致的类球体。该类球体构建方法操作简便、快速且可重复性强，适用于高通量实验 体外 检测。

通过该方法可在每个孔中形成大小和形状稳定的单个球状体。图2展示了在ULA板的孔中，ZFL和ZEM2S细胞在轨道振荡（70 rpm）条件下单个球状体的形成过程。ZFL和ZEM2S细胞系在三维培养中表现出不同的行为。ZEM2S细胞系自轨道振荡第一天起即表现出易于形成球状结构的特征（图2E），而ZFL细胞系则需要5天才能达到理想的球状形态（图2A-C）。通过该方法生成的球状体在更长时间的培养中（>5天）也表现出良好的形态稳定性，如图2D（16天龄的ZFL球状体）和图2H（10天龄的ZEM2S球状体）所示。球状体的直径和圆形度通过使用科学图像处理与分析软件对所获图像中的投影面积进行测量确定13（...

本文介绍了一种高效、简便且快速的三维培养方案，用于两种斑马鱼（Danio rerio）细胞系——ZEM2S（胚胎细胞）和 ZFL（正常肝细胞）——的球状体形成。

鱼类细胞系在生态毒性评估中具有良好的体外模型潜力；然而，传统的单层培养系统（2D培养）存在众所周知的……

该方案可轻松生成斑马鱼类球体，这是一种在鱼类毒性测试中具有多种潜在应用的三维体外模型。这是一种简单快速的方法，可生成大小和形状非常相似的斑马鱼类球体。如果正确遵循所有描述的步骤，则不应遇到任何问题。斑马鱼类球体可为研究化学物质对鱼类的影响机制提供重要帮助，有助于提升化妆品等产品的环境安全评估水平。本次实验操作由本实验室遗传学博士Irisdoris Rodrigues de Souza进行示范。首先，取一个约80%融合度的T75培养瓶，内含斑马鱼细胞。吸除完全培养基，用移液管向培养瓶中加入 0.01 摩尔的 PBS 洗涤细胞。轻轻摇动培养瓶，使 PBS 充分洗涤，然后吸除 PBS。向培养瓶中加入 3 毫升含 0.5 毫摩尔 EDTA 的胰蛋白酶溶液，在 28 摄氏度下孵育 3 分钟。为使细胞从培养瓶中脱落，轻轻敲击培养瓶以松动细胞。然后加入三毫升完全培养基终止胰蛋白酶消化。使用移液器将细胞悬液转移至15毫升锥形离心管中，在100 G条件下离心五分钟。然后小心吸去上清液。加入1 mL相应细胞系所用的完全培养基，用移液器重悬细胞沉淀。取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝染液加入至微量离心管中，用于细胞计数及活力评估。使用移液器将细胞悬液与染料混匀，取10微升该混合液转移至血细胞计数板（Neubauer chamber）中。计数位于计数板四角的四个大方格内的细胞，未被台盼蓝染色的细胞视为活细胞。然后根据屏幕上显示的公式计算活细胞数量。将此细胞数量乘以2，以计算细胞悬液中的最终细胞数量。计算出细胞数量后，调整细胞悬液，使每孔加入200微升该悬液至96孔圆底超低吸附板中，并确保每种细胞系所需的细胞数量。将调整好浓度的细胞悬液置于培养基储液槽中，并使用多通道移液器混匀，避免产生泡沫或气泡。使用多通道移液器，向超低吸附圆底96孔板的每个孔中加入200 µL调整好的细胞悬液。必须用Parafilm封口膜或压敏封口膜密封该板，以防止96孔板中的培养基蒸发。将培养板置于28 °C、无二氧化碳的培养箱中，在70 RPM的摇床上孵育5天。5天后，在倒置光学显微镜下观察类球体，以评估所形成的类球体。为测量其形态和大小，需拍摄类球体的图像，并使用软件对图像进行处理和分析。在根据已知比例尺设置软件以测量选定区域后，选择类球体的外侧以确定其面积和圆形度。通过计算直径 d 来利用类球体的面积确定其大小，软件则根据所选的面积和周长，使用公式提供类球体的圆形度。ZFL 细胞聚集体在轨道振荡的第一天形成。细胞聚集体在第三天时圆形度增加，并在第五天达到合适的球形形态。图中显示的是ULA板中培养16天的ZFL细胞球。ZEM2S细胞系从开始旋转振荡的第一天起即可形成细胞球。类球体在第三天保持其形态并增大体积，第五天时达到最大圆形度。图中显示的是U型底非黏附板中培养10天的ZEM2S类球体。本图展示了ZFL和ZEM2S细胞系类球体的测量尺寸，以及ZFL和ZEM2S类球体的圆形度指数测量结果。此图展示了ZFL和ZEM2S类球体的生长模式。图中显示了在100 RPM转速下振荡培养五天后形成的ZFL类球体和ZEM2S类球体。本图还呈现了在70和100 RPM转速下形成的类球体的生长模式及圆形度指数。70 RPM 是通过此方法形成 ZFL 和 ZEM2S 类球体的最适转速。使用凝集素 Alexa Fluor 594 对细胞膜染色、DAPI 对细胞核染色，显示类球体核心区域的细胞完整性。AlamarBlue 还原生成的刃天青荧光表明，两类类球体核心区域均存在活细胞。本实验展示了ZEM2S和ZFL细胞系在3D培养和2D培养条件下的MTT活力检测结果，表明两者之间无显著差异。在进行该操作时，务必密封培养板，以避免培养基pH值变化以及孔内液体蒸发。这些球状体可用于多种体外实验，以评估鱼类肝脏的毒性效应，或利用胚胎来源的ZEM2S细胞系开展发育相关研究。该方案有助于推进体外鱼类试验的发展，为非动物依赖的生态毒理学研究进步做出贡献。

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胚胎和肝脏斑马鱼细胞系球状体的3D培养方法

我们介绍一种简单、快速地生成类三维组织球体的方法，及其在量化细胞间相互作用差异方面的潜在应用。...

一种简单的悬滴细胞培养法用于生成三维球状体

类球体是一种三维细胞培养模型，与二维细胞培养单层模型相比，能够更准确地模拟细胞的生存环境。在本示例实验方案中，我们将看到科研人员利用结直肠癌细胞系生成类球体，并通过活细胞成像技术追踪类球体的生长过程。...

从细胞系生成球状体：一种三维（3D）细胞培养方法

体节发生是一种节律性的发育过程，可在脊椎动物胚胎中对体轴进行空间模式化。此前，我们构建了转基因斑马鱼品系，利用荧光报告基因来观察驱动该过程的周期性基因。在此，我们将这些品系的分散细胞进行体外培养，并随时间成像其振荡行为in...

单细胞成像斑马鱼体节时钟的分散型前体节中胚层细胞培养物的制备

介绍了对幼年斑马鱼脑血管发育进行成像的方法。同时提供了促进三维成像以及利用化学处理手段调控脑血管发育的技术。...

斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

本文提供了一种可重复的方法，用于通过源自成年斑马鱼全脑或端脑、中脑或小脑区域的神经球实验来检测成年神经发生。此外，我们还描述了在斑马鱼神经球中操控基因表达的操作步骤。...

成年斑马鱼脑源性神经球的分离与培养

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。...

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

我们介绍了一种高效且易于使用的方案，用于制备斑马鱼胚胎的原代细胞培养物，以进行转染和活细胞成像；同时提供了一种从成年斑马鱼脑组织制备原代细胞的方案。...

斑马鱼原代细胞的培养与转染

本文介绍了斑马鱼后部体轴的三维组织培养方案，可实现对脊椎动物体节形成的活体研究。该外植体模型能够控制体轴伸长、调控形态发生素来源，并实现组织水平上具有亚细胞分辨率的活体成像。...

一种用于研究斑马鱼脊椎动物体节分化的三维尾部外植体培养方法

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

我们介绍了一种用于培养高可重复性类球体并通过图像采集和蛋白质组学进行表型表征的实验方案。...

功能性三维球状体细胞培养的半自动化表型分析

类器官技术革新了器官发育、药物发现和疾病研究中的个性化组织建模。类器官工程正朝着构建复杂合成组织的方向发展。其目标是整合形态发生、类组装体技术与生物基质，以推动组织工程的进步。本实验方案有助于模拟肝脏器官发生过程，并为合成组织的构建建立指导性规范。...

利用人类细胞系进行肝脏器官发生建模、类组装体构建及合成组织设计的体外培养技术

学习使用ZEM2S和ZFL细胞系建立斑马鱼球状体的三维培养方法。该方案操作简便快速，可生成大小均一的球状体，适用于鱼类毒性检测和环境安全评估研究。

一种斑马鱼胚胎和肝脏细胞系球状体的三维培养方法

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