Name: 斑马鱼细胞系的细胞毒性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解使用斑马鱼ZEM2S和ZFL细胞系进行细胞毒性测定的方法，通过96孔板结合多种活力终点评估化学品急性毒性。该方案支持无动物生态毒理学研究。

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谨以此文纪念本文的共同作者 Márcio Lorencini 博士，他是一位杰出的化妆品领域研究人员，毕生致力于推动巴西的化妆品研究。作者感谢巴拉那联邦大学生理学系多用户实验室提供的设备支持，以及高等教育人员改进协调机构（CAPES，巴西）（资助代码 001）和 Grupo Boticario 提供的经费支持。

注意：本实验方案所用材料的列表请参见材料表，所用溶液和培养基的组成请参见表1。
1. 准备 ZFL 和 ZEM2S 细胞
<ol>
	<li>取一个培养在相应完全培养基中、汇合度为80%的ZFL或ZEM2S细胞T75培养瓶，在28 °C条件下培养，无需CO2环境。</li>
	<li>移除培养瓶中的培养基，加入10 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 M）洗涤细胞。向培养瓶中加入3 mL 1×胰蛋白酶（0.05% v/v；含0.5 mM胰蛋白酶-EDTA），在28 °C下孵育3分钟。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶使细胞脱落，随后加入3 mL完全培养基以终止胰蛋白酶消化反应。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，在100 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>离心后小心弃去上清液，加入1 mL ZFL或ZEM2S细胞的完全培养基，使用移液器重悬细胞沉淀。</li>
</ol>
2. 台盼蓝染料排斥法细胞计数
<ol>
	<li>添加 10 µL 细胞悬液的 10 µL 将台盼蓝染料加入微量离心管中，用于细胞计数和活力评估。使用移液器混合细胞悬液与染料。</li>
	<li>然后，转移 10 µL 将此混合液（细胞悬液 + 台盼蓝）加入血细胞计数板的纽鲍尔计数室中，计数位于计数室四角的四个大方格（象限 Q）内的细胞，未被台盼蓝染色的细胞视为活细胞。使用公式（1): 
	<img alt="细胞计数计算公式，ΣQ/4 × 10^4，用于细胞定量的方程。" src="/files/ftp_upload/64860/64860eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> (1)</li>
	<li>通过使用公式（1）乘以二（由于使用台盼蓝造成的稀释因子）。 
	注意：也可使用自动细胞计数系统（例如., 可使用具有细胞计数和活力检测功能的细胞计数仪。</li>
</ol>
3. 在96孔板中接种细胞
<ol>
	<li>计算获得进行细胞毒性检测所需细胞数量的细胞悬液体积。每种细胞系所需的活细胞数量如下：
	<ol>
		<li>每孔接种 60,000 个活的 ZEM2S 细胞；因此，整块板使用六百万个细胞，溶于 20 mL 完全培养基中（每孔 200 µL，96 孔板）。</li>
		<li>每孔接种 40,000 个活的 ZFL 细胞；因此，整块板使用四百万个细胞，溶于 20 mL 完全培养基中（每孔 200 µL，96 孔板）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>随后，将相应体积的细胞悬液转移至试剂储液槽（无菌），并用 ZFL 或 ZEM2S 的完全培养基补足至 20 mL。使用多通道移液器轻轻吹打混匀溶液。
	 
	注意：注意避免产生泡沫或气泡。</li>
	<li>使用多通道微量移液器向透明聚苯乙烯 96 孔板的每孔中加入 200 µL 细胞悬液。将培养板在 28 °C 下孵育 24 小时。
	 
	​注意：该板至少应设置三个不含细胞的空白对照孔，仅向这些孔中加入完全培养基。边缘效应（由边缘孔蒸发率较高引起）在 96 孔板实验中较为常见，可能影响板边缘孔中细胞的存活率28。该效应的强弱可能因 96 孔板的品牌和设计而异28。尽管我们未观察到 ZFL 和 ZEM2S 细胞在边缘孔中存在细胞生长或存活率的干扰，但仍建议使用 Parafilm 封口膜或压敏封口膜密封培养板以防止该效应，或仅在中间 60 个孔中培养细胞，并在边缘孔中加入 PBS。</li>
</ol>
4. 细胞暴露于待测化学品
<ol>
	<li>使用多通道移液器小心弃去孔中的用过的培养基。</li>
	<li>用不同浓度的待测化学品处理细胞。在ZFL或ZEM2S细胞的无胎牛血清（FBS）培养基中配制待测化学品的不同浓度溶液（暴露培养基），然后每孔加入100 µL上述溶液，每个浓度设三个技术重复孔（即每个待测化学品浓度对应三个孔）。</li>
	<li>对照组应与待测化学品在同一块板上设置，每个对照组设三个技术重复孔（每个对照组三个孔）。空白对照（B）：在无细胞的孔中加入100 µL暴露培养基；阴性对照（NC）：在含细胞的孔中加入100 µL暴露培养基；阳性对照（PC）：用含1% Triton X-100的暴露培养基处理细胞。在某些情况下，应设置溶剂对照（SC），其溶剂终浓度应明确且不具细胞毒性。 
	注：建议使用0.5% DMSO作为溶剂；在这些细胞系中，DMSO作为溶剂使用浓度可达1%，且不会使相对于阴性对照的细胞毒性超过10%的阈值。</li>
	<li>将培养板在28 °C下孵育24小时。使用封口膜或压敏封板膜密封培养板，以防止培养基蒸发。 
	​注：某些化学品可能具有固有的背景吸光度或荧光，可能会干扰指示染料的吸光度或荧光信号（例如，有色化合物可能影响吸光度，血清白蛋白29，以及干扰还原酶活性的化合物30,31）。在此情况下，需额外设置对照，即在不含细胞的孔中加入待测化学品溶液，以验证化学品自身的吸光或自发荧光是否对染料信号产生干扰。若检测到干扰，应评估该干扰是否可被排除，以获得对细胞毒性的准确预测。</li>
</ol>
5. 细胞毒性检测
注意：所有溶液的配制请参照表1。以下所有步骤（图1）均需在无菌条件下进行。不建议使用移液器丢弃暴露后的培养基，因为在化学处理后细胞容易从孔壁脱落。
<ol>
	<li>AB 和 CFDA-AM 检测
	<ol>
		<li>在测试化学品暴露 24 小时后，小心倾倒弃去暴露培养基，将内容物倒入收集盘中。</li>
		<li>用 200 µL PBS 洗涤培养板。小心将 PBS 倒入收集盘中，避免细胞丢失。</li>
		<li>每孔加入 100 µL AB/CFDA-AM 溶液。在 28 °C 避光孵育 30 分钟。</li>
		<li>使用荧光酶标仪检测荧光强度，AB 的激发波长为 530 nm，发射波长为 595 nm；CFDA-AM 的激发波长为 493 nm，发射波长为 541 nm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NR 检测 
	注意：NR 检测步骤需紧接在 AB 和 CFDA-AM 检测之后进行（图 1）。
	<ol>
		<li>将 NR 工作液（40 µg/mL）在 600 × g 条件下离心 10 分钟。 
		注意：离心后试管中的 NR 沉淀不得转移至培养板中。因此，在离心 NR 工作液后，使用移液器小心吸取上清液，避免吸入 NR 沉淀物，并将上清液转移至试剂储液槽中。</li>
		<li>小心倾倒弃去 AB/CFDA-AM 溶液，将内容物倒入收集盘中。</li>
		<li>使用多通道移液器每孔加入 100 µL NR 工作液。在 28 °C 孵育 3 小时。 
		注意：3 小时孵育后，应使用显微镜观察培养板中是否出现 NR 沉淀。NR 沉淀可能干扰细胞活力的定量结果，因此不应存在。</li>
		<li>小心倾倒弃去 NR 溶液，将内容物倒入收集盘中。每孔加入 150 µL PBS 进行洗涤。</li>
		<li>每孔加入 150 µL NR 提取液，将培养板置于板式振荡器上轻轻振荡 10 分钟。使用酶标仪在 540 nm 处测定吸光度。 
		注意：应在 690 nm 处进行第二次读数，以排除培养板中的背景吸收干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTT 检测 
	注意：MTT 检测必须与上述检测分开进行（使用新培养板）（图 2）。
	<ol>
		<li>小心倾倒弃去暴露培养基，将内容物倒入收集盘中。</li>
		<li>使用多通道移液器每孔加入 100 µL MTT 工作液。在 28 °C 孵育 4 小时。</li>
		<li>倾倒弃去 MTT 溶液，将内容物倒入收集盘中。</li>
		<li>每孔加入 100 µL DMSO 以溶解甲臜结晶，将培养板置于板式振荡器上振荡 10 分钟。使用酶标仪在 570 nm 处测定吸光度。 
		注意：应在 690 nm 处进行第二次读数，以排除培养板中的背景吸收干扰。需特别注意，测试化学品可能与 MTT 发生相互作用，必须对此进行评估以确保所生成数据的质量32。为此，应设置不含细胞的对照孔，其中包含测试浓度的化学品和 MTT（0.5 mg/mL），经孵育后观察孔中是否发生颜色变化，此类变化可能导致吸光度升高并产生假阳性活力结果。在本检测中应避免使用与 MTT 发生反应的化学品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 计算细胞活力/细胞毒性
注意：使用原始吸光度或荧光值计算细胞活力百分比，该百分比相对于阴性对照（用于直接溶于暴露培养基中的受试化学品）或溶剂对照（用于使用二甲基亚砜等溶剂配制的受试化学品）。在确定细胞活力百分比之前，原始数据必须通过空白对照进行归一化处理。
<ol>
	<li>计算每种测试化学品浓度及对照组的平均吸光度或荧光值（每个处理组三个孔）。</li>
	<li>为确定相对于对照组（阴性对照或溶剂对照）的细胞活力百分比，请使用公式（2）： 
	<img alt="细胞活力计算公式，用于荧光或吸光度测量的研究分析。" src="/files/ftp_upload/64860/64860eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> （2） 
	注意：吸光度（abs）或荧光（fluo）单位表示每种浓度下三个孔中测得的吸光度或荧光的平均值；空白组指不含细胞的孔。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

细胞毒性检测被广泛用于 体外 毒性评价，本文介绍四种常用的细胞毒性检测方法，这些方法已针对斑马鱼细胞系进行了优化（即96孔板的细胞密度、MTT法中的孵育时间、化学暴露条件下胎牛血清的去除，以及SC的最高可接受浓度）。由于这些检测方法通过不同的细胞活力终点指标（代谢功能、溶酶体膜完整性及细胞膜完整性）来量化细胞毒性，联合使用可对化学物质在斑马鱼细胞系中的细胞毒性进行准确评估。本方案还建议在CO₂培养条件下培养ZFL和ZEM2S细胞系2无CO₂培养条件，因其培养基成分能够充分缓冲培养体系，将pH维持在7.4（生理pH）。培养基的组成及CO2本方案中所述的两种细胞系的无二氧化碳培养环境在文献中已有广泛报道。ZFL细胞系通常在L-15和RPMI培养基中培养，可添加或不添加碳酸氢钠，且无需CO237,38,39,40</s...

化学物质需要针对其对人类健康和环境的安全性进行测试。分子和细胞生物标志物在安全性评估中正受到监管机构和/或立法机构（如 REACH、OECD、US EPA）越来越多的重视，以预测其对生物体的影响。1,2，因为它们可能先于 体内 不良结局（例如，内分泌干扰、免疫反应、急性毒性、光毒性）3,4,5,6,7在此背景下，细胞毒性被用作预测鱼类急性毒性的指标5,8；然而，它在生态毒理学研究中还可有多种其他应用，例如确定化学物质的亚细胞毒性浓度，以研究其对鱼类产生的各种不同效应（如.，内分泌干扰效应）。
在细胞培养系统（体外系统）中，化学物质的细胞毒性可通过不同类型的终点指标方法进行测定。例如，某些细胞毒性方法可基于细胞死亡过程中观察到的特定形态学变化作为终点指标，而另一些方法则可通过检测细胞死亡、活力与功能、形态、能量代谢以及细胞贴壁与增殖等指标来确定细胞毒性。化学物质可通过多种不同机制影响细胞活力，因此有必要采用涵盖多种细胞活力终点指标的评估方法，以准确预测化学物质的效应9。
MTT 和 Alamar Blue（AB）是基于细胞代谢活性来测定对细胞活力影响的检测方法。MTT 检测法评估线粒体酶琥珀酸脱氢酶的活性10。只有在活细胞中，黄色的 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）才会被还原为蓝紫色的甲臜，其光密度与活细胞数量成正比10。AB 检测法是一种灵敏的氧化还原指示剂，由线粒体酶介导，活细胞将刃天青还原为试卤灵时会发出荧光并发生颜色变化11；然而，胞质和微粒体酶也参与 AB 和 MTT 的还原过程12。这些酶可能包括多种还原酶，如醇和醛氧化还原酶、NAD(P)H:醌氧化还原酶、黄素还原酶、NADH 脱氢酶以及细胞色素11。
中性红（Neutral Red, NR）检测法是一种基于活细胞对染料摄取能力的细胞活力检测方法，其原理是该染料可被活细胞的溶酶体摄取13。中性红的摄取依赖于细胞维持pH梯度的能力。溶酶体内部的质子梯度使其pH值低于细胞质。在正常的生理pH条件下，中性红的净电荷约为零，使其能够穿透细胞膜。进入细胞后，染料被质子化而带电，并被保留在溶酶体内。因此，被保留的中性红越多，表明活细胞数量越多14。任何损伤细胞表面或溶酶体膜的化学物质都会影响该染料的摄取。
CFDA-AM 检测是一种基于保留 5-羧基荧光素二乙酸乙酰氧基甲基酯（CFDA-AM）的荧光法细胞活力检测方法15。5-CFDA-AM 作为一种酯酶底物，可被转化为羧基荧光素，后者是一种具有极性且无法透过活细胞膜的荧光物质15；因此，该物质保留在完整细胞膜的内侧，表明细胞具有活性。
最近，三种细胞毒性检测方法（CFDA-AM、NR 和 AB 检测）被整合到一项经过验证的 ISO（国际标准化组织）指南（ISO 21115:2019）16 和经济合作与发展组织（OECD）测试方法（OECD TG 249）中，用于在 24 孔板中利用 RTgill-W1 细胞系（源自虹鳟 [Oncorhynchus mykiss] 鳃组织的永生化细胞系）评估鱼类急性毒性17。尽管目前已存在基于细胞的鱼类急性毒性预测方法，但研究人员仍致力于开发适用于其他鱼类物种的类似方法，并提高该方法的通量。一些实例包括：构建转染了特定毒性通路报告基因的 ZFL 细胞系18,19、在 RTgill-W1 细胞系中开展光毒性测试20，以及利用 ZFL 和 ZF4 细胞系（源自 1 日龄斑马鱼胚胎的成纤维细胞）结合多种细胞毒性检测方法评估毒性21。
Danio rerio（斑马鱼）是水生毒性研究中使用的主要鱼类物种之一；因此，基于斑马鱼细胞系的鱼类毒性检测方法可能具有重要价值。ZFL 细胞系是一种斑马鱼上皮性肝细胞系，具有肝脏实质细胞的主要特征，能够代谢外源性化合物7,22,23,24,25。而 ZEM2S 细胞系则是一种来源于囊胚期的斑马鱼胚胎成纤维细胞系，可用于研究对鱼类发育的影响26,27。因此，本实验方案描述了四种细胞毒性检测方法（MTT 法、AB 法、NR 法和 CFDA-AM 法），并进行了相应优化，适用于在 96 孔板中对 ZFL 和 ZEM2S 细胞系进行检测。

<table><tbody><tr><td>5-CFDA, AM（5-羧基荧光素二乙酸酯，乙酰氧基甲酯）</td><td>Invitrogen</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板，96 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td>表面：标准，平底</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>粉末，高葡萄糖，含丙酮酸钠</td></tr><tr><td>FBS - 胎牛血清，经鉴定，符合 USDA 批准地区标准</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 营养混合物，粉末</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td>粉末</td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 培养基</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td>粉末</td></tr><tr><td>中性红&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4638</td><td>粉末，生物试剂，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>轨道摇床&amp;nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm 旋转直径</td></tr><tr><td>含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（10X）</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td>粉末，生物试剂，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td>粉末</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>粉末，&amp;nbsp;分子生物学用生物试剂</td></tr><tr><td>噻唑蓝四氮唑溴盐&amp;nbsp; 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液（0.4%）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>该细胞系由美国威斯康星大学密尔沃基分校 Michael J.&lt;br/&gt; Carvan 教授惠赠</td></tr><tr><td>ZFL 细胞系</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼细胞系的细胞毒性检测

Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines

鱼类细胞系在生态毒理学研究中日益得到广泛应用，细胞毒性检测已被提出作为预测鱼类急性毒性的方法。因此，本实验方案介绍了经改良的细胞毒性检测方法，用于评估斑马鱼（zebrafish）细胞的存活率斑马鱼) 胚胎（ZEM2S）和肝脏（ZFL）细胞系置于96孔板中。所评估的细胞毒性终点包括线粒体完整性（Alamar Blue [AB] 和 MTT 检测）以及膜完整性 通过 酯酶活性（CFDA-AM 检测）和溶酶体膜完整性（中性红 [NR] 检测）。在96孔板中暴露于待测物质后，进行细胞毒性检测；其中 AB 和 CFDA-AM 检测在同一块板上同时进行，随后进行 NR 检测，而 MTT 检测则在另一块独立的板上进行。AB 和 CFDA-AM 检测的读数采用荧光法，MTT 和 NR 检测采用吸光度法。利用这些鱼类细胞系进行的细胞毒性检测可用于研究化学物质对鱼类的急性毒性。

图3 显示了AB、CFDA-AM、NR和MTT检测的培养板结果。在AB检测中（图3A），空白孔以及无活细胞或活细胞数量较少的孔呈现蓝色且荧光信号较低，而含有大量活细胞的孔则呈粉红色，并因活细胞将刃天青（AB）还原为粉红色产物试卤灵而表现出较高的荧光值。在CFDA-AM检测中，培养板上各孔的颜色无明显肉眼可见差异；然而，含有活细胞的孔由于能够保留CFDA-AM并将其转化为羧基荧光素（荧光物质），因而具有更高的荧光信号。
在进行中性红（NR）实验（图3B）时，空白孔应透明且吸光度值极低，因为其中无细胞保留中性红染料。在某些情况下，空白孔不透明，表明中性红在培养板上发生沉淀；此时实验结果无效。受试化学品及阳性对照（PC）在高细胞毒性浓度下表现为透明或呈极淡的粉红色，吸光度值较低；而含有活细胞的孔则保留中性红染料，呈现深粉红色且吸光度值较高。
在MTT实验（...

本方案介绍了常用于评估斑马鱼胚胎（ZEM2S）和斑马鱼肝细胞（ZFL）系在96孔板中细胞毒性的检测方法（Alamar Blue [AB]、CFDA-AM、中性红和MTT检测）。

鱼类细胞系在生态毒理学研究中的应用日益广泛，细胞毒性检测已被提议作为预测鱼类急性毒性的方法……

使用斑马鱼细胞系进行细胞毒性检测的实验方案可用于回答有关化学品对鱼类急性毒性的问题，或有助于确定其他替代鱼类检测中的合适测试浓度。该96孔板检测方法的主要优势在于结合了多种细胞活力终点指标，以评估对斑马鱼细胞的细胞毒性，而斑马鱼是生态毒理学研究中一种重要的鱼类物种。该实验方案非常简单。如果正确遵循所有所述步骤，则不应遇到任何问题。本方案有助于实现无需动物实验的生态毒理学研究，可用于评估不同器官或生命阶段鱼类细胞系（如胚胎细胞中的肝细胞）的效应。开始接种 ZEM2S 或 ZFL 细胞时，需计算所需相应细胞悬液的体积，以获得实验所需的细胞数量。将对应细胞系的完全培养基加入无菌试剂储液槽中，并将计算好的细胞悬液体积转移至储液槽，使总体积达到 20 毫升。使用多通道移液器轻轻吹打溶液，上下混匀，避免产生泡沫或气泡。然后使用多通道微量移液器向透明聚苯乙烯 96 孔板的每孔加入 200 微升细胞悬液，使 ZEM2S 细胞每孔活细胞数为 60,000 个，ZFL 细胞每孔活细胞数为 40,000 个。将培养板在28摄氏度下孵育24小时。为使任一类型的细胞暴露于不同浓度的测试化学品中，需在不含胎牛血清或FBS的相应细胞系培养基中配制所需浓度的测试化学品溶液。24小时孵育结束后，使用多通道移液器小心弃去孔中的废弃培养基。然后，每孔加入 100 µL 特定测试化学物质溶液，设技术重复三孔，即每种测试化学物质浓度对应三个孔。将对照组与测试化学物质一同置于同一块板上，同样设置技术重复三孔。对于空白对照，在三个无细胞的孔中各加入 100 µL 暴露培养基。对于阴性对照，在含有细胞的三个孔中各加入100微升暴露培养基。对于阳性对照，将含有细胞的三个孔暴露于用暴露培养基配制的1%Triton X-100溶液中。用封口膜或压敏封板膜密封培养板，防止培养基蒸发，并将培养板在28°C下孵育24小时。在测试化学品暴露24小时后，小心地将孔板中的暴露液倒入收集盘中弃去，并用200微升PBS洗涤每个孔。然后，为去除PBS同时避免细胞丢失，小心地将PBS倒入收集盘中。为进行刃天青（Alamar Blue，AB）或羧基荧光素二乙酸酯乙酰甲酯（CFDA-AM）检测，每孔加入100微升相应溶液，在28摄氏度避光条件下孵育30分钟。接下来，在文本中提到的合适激发波长和发射波长下，使用荧光酶标仪测量荧光。进行中性红（NR）检测时，取浓度为40微克/毫升的NR工作液，以600 ×g离心10分钟。随后，通过将孔内液体倾倒至收集盘中，小心移除先前加入的AB和CFDA-AM溶液。使用多通道微量移液器，每孔加入 100 微升 NR 工作液，在 28 摄氏度下孵育 3 小时。孵育结束后，小心将 NR 溶液从培养板倒入收集盘中，每孔加入 150 微升 PBS 洗涤孔板。洗涤后，每孔加入 150 微升 NR 提取液，在板式振荡器上轻轻振荡孵育 10 分钟，随后使用酶标仪在 540 纳米处测定吸光度。进行 MTT 实验时，在24小时的受试化学品暴露后，小心地将暴露培养基倒入收集盘中，然后使用多通道移液器在避光条件下每孔加入100 µL MTT工作液。将培养板在28 °C下避光孵育4小时。随后将MTT溶液倒入收集盘中弃去，每孔加入100 µL DMSO以溶解甲臜结晶。使用酶标仪在517纳米处测定吸光度前，将酶标板置于摇床上孵育10分钟。在AP实验中，空白孔、阳性对照孔以及测试化学品高细胞毒浓度对应的孔呈现蓝色且荧光较弱，表明活细胞缺失或减少。相反，测试化学品低细胞毒浓度对应的孔以及含有大量活细胞的阴性对照孔则将刃天青还原为粉红色的试卤灵，表现出较高的荧光强度。对于中性红（NR）检测，测试化学品和阳性对照的高细胞毒性浓度呈现透明或淡粉色，吸光度较低；而含有存活细胞并保留中性红染料的孔则呈现深粉色且吸光度较高。类似地，在MTT检测中，不含活细胞的孔呈透明状，而含有活细胞的孔则将MTT转化为紫色的甲臜。根据计算得到的细胞活力百分比，估算了不同测试化学品在ZFL和ZEM2S细胞系中的半最大抑制浓度（IC50值）。在含FBS与不含FBS的培养条件下，细胞活力未见显著差异，表明在24小时的化学暴露期内，可使用不含FBS的培养基。MTT和NR检测结果显示，DMSO浓度在0.1%至1%范围内变化对细胞活力无显著影响，表明这些细胞系可耐受浓度高达1%的DMSO作为溶剂。操作贴壁细胞时需格外小心，避免在整个实验过程中发生细胞自脱落现象；配制中性红工作液时应仔细操作，防止染料沉淀。该方法可应用于利用体外模型研究化学物质对鱼类多种影响的研究，并有助于推动非动物性生态毒性研究的发展。

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

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本文介绍了一种高效、简便且快速的三维培养方案，用于两种斑马鱼（Danio rerio）细胞系——ZEM2S（胚胎细胞）和...

一种斑马鱼胚胎和肝脏细胞系球状体的三维培养方法

我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。...

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

本方案描述了一种在受精后3至7天的斑马鱼幼鱼中进行药物筛选并随后进行形态学评估的实验流程。...

早期斑马鱼幼鱼中的小分子筛选与毒性检测

本文描述了基于微孔板的胞外酶活性比色法或荧光法分析流程。这些方法可在合理的时间范围内，对大量环境样品中的酶活性进行快速测定。...

利用高通量微孔板法测定水体、土壤和沉积物中微生物胞外酶活性

了解使用斑马鱼ZEM2S和ZFL细胞系进行细胞毒性测定的方法，通过96孔板结合多种活力终点评估化学品急性毒性。该方案支持无动物生态毒理学研究。

斑马鱼细胞系的细胞毒性检测

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