斑马鱼细胞系的细胞毒性检测

使用斑马鱼细胞系进行细胞毒性检测的实验方案可用于回答有关化学品对鱼类急性毒性的问题，或有助于确定其他替代鱼类检测中的合适测试浓度。该96孔板检测方法的主要优势在于结合了多种细胞活力终点指标，以评估对斑马鱼细胞的细胞毒性，而斑马鱼是生态毒理学研究中一种重要的鱼类物种。该实验方案非常简单。

如果正确遵循所有所述步骤，则不应遇到任何问题。本方案有助于实现无需动物实验的生态毒理学研究，可用于评估不同器官或生命阶段鱼类细胞系（如胚胎细胞中的肝细胞）的效应。开始接种 ZEM2S 或 ZFL 细胞时，需计算所需相应细胞悬液的体积，以获得实验所需的细胞数量。

将对应细胞系的完全培养基加入无菌试剂储液槽中，并将计算好的细胞悬液体积转移至储液槽，使总体积达到 20 毫升。使用多通道移液器轻轻吹打溶液，上下混匀，避免产生泡沫或气泡。然后使用多通道微量移液器向透明聚苯乙烯 96 孔板的每孔加入 200 微升细胞悬液，使 ZEM2S 细胞每孔活细胞数为 60,000 个，ZFL 细胞每孔活细胞数为 40,000 个。

将培养板在28摄氏度下孵育24小时。为使任一类型的细胞暴露于不同浓度的测试化学品中，需在不含胎牛血清或FBS的相应细胞系培养基中配制所需浓度的测试化学品溶液。24小时孵育结束后，使用多通道移液器小心弃去孔中的废弃培养基。

然后，每孔加入 100 µL 特定测试化学物质溶液，设技术重复三孔，即每种测试化学物质浓度对应三个孔。将对照组与测试化学物质一同置于同一块板上，同样设置技术重复三孔。对于空白对照，在三个无细胞的孔中各加入 100 µL 暴露培养基。

对于阴性对照，在含有细胞的三个孔中各加入100微升暴露培养基。对于阳性对照，将含有细胞的三个孔暴露于用暴露培养基配制的1%Triton X-100溶液中。用封口膜或压敏封板膜密封培养板，防止培养基蒸发，并将培养板在28°C下孵育24小时。

在测试化学品暴露24小时后，小心地将孔板中的暴露液倒入收集盘中弃去，并用200微升PBS洗涤每个孔。然后，为去除PBS同时避免细胞丢失，小心地将PBS倒入收集盘中。为进行刃天青（Alamar Blue，AB）或羧基荧光素二乙酸酯乙酰甲酯（CFDA-AM）检测，每孔加入100微升相应溶液，在28摄氏度避光条件下孵育30分钟。

接下来，在文本中提到的合适激发波长和发射波长下，使用荧光酶标仪测量荧光。进行中性红（NR）检测时，取浓度为40微克/毫升的NR工作液，以600 ×g离心10分钟。随后，通过将孔内液体倾倒至收集盘中，小心移除先前加入的AB和CFDA-AM溶液。

使用多通道微量移液器，每孔加入 100 微升 NR 工作液，在 28 摄氏度下孵育 3 小时。孵育结束后，小心将 NR 溶液从培养板倒入收集盘中，每孔加入 150 微升 PBS 洗涤孔板。洗涤后，每孔加入 150 微升 NR 提取液，在板式振荡器上轻轻振荡孵育 10 分钟，随后使用酶标仪在 540 纳米处测定吸光度。

进行 MTT 实验时，在24小时的受试化学品暴露后，小心地将暴露培养基倒入收集盘中，然后使用多通道移液器在避光条件下每孔加入100 µL MTT工作液。将培养板在28 °C下避光孵育4小时。随后将MTT溶液倒入收集盘中弃去，每孔加入100 µL DMSO以溶解甲臜结晶。

使用酶标仪在517纳米处测定吸光度前，将酶标板置于摇床上孵育10分钟。在AP实验中，空白孔、阳性对照孔以及测试化学品高细胞毒浓度对应的孔呈现蓝色且荧光较弱，表明活细胞缺失或减少。相反，测试化学品低细胞毒浓度对应的孔以及含有大量活细胞的阴性对照孔则将刃天青还原为粉红色的试卤灵，表现出较高的荧光强度。

对于中性红（NR）检测，测试化学品和阳性对照的高细胞毒性浓度呈现透明或淡粉色，吸光度较低；而含有存活细胞并保留中性红染料的孔则呈现深粉色且吸光度较高。类似地，在MTT检测中，不含活细胞的孔呈透明状，而含有活细胞的孔则将MTT转化为紫色的甲臜。根据计算得到的细胞活力百分比，估算了不同测试化学品在ZFL和ZEM2S细胞系中的半最大抑制浓度（IC50值）。

在含FBS与不含FBS的培养条件下，细胞活力未见显著差异，表明在24小时的化学暴露期内，可使用不含FBS的培养基。MTT和NR检测结果显示，DMSO浓度在0.1%至1%范围内变化对细胞活力无显著影响，表明这些细胞系可耐受浓度高达1%的DMSO作为溶剂。操作贴壁细胞时需格外小心，避免在整个实验过程中发生细胞自脱落现象；配制中性红工作液时应仔细操作，防止染料沉淀。该方法可应用于利用体外模型研究化学物质对鱼类多种影响的研究，并有助于推动非动物性生态毒性研究的发展。