Name: 通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解通过鼻滴法反复给予结晶二氧化硅建立矽肺小鼠模型的方法。该模型能有效模拟人类矽肺病理进程，具有操作简便、成本低廉且无机械损伤的优势，适用于呼吸系统疾病机制研究与药物筛选。

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本研究由安徽省高校协同创新计划项目（GXXT-2021-077）和安徽理工大学研究生创新基金（2021CX2120）资助。

所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物 No. 8023，1978 年修订版）的规定，并经安徽科技大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。
1. 小鼠的饲养与管理
<ol>
	<li>将20只健康的C57BL/6雄性小鼠按1:1的比例随机分配至实验组和对照组。让小鼠在新环境中适应1周。</li>
	<li>每天提供12小时恒定的光照时间。使用时间控制器以确保定时精确。</li>
</ol>
2. 准备CSD悬液
<ol>
	<li>鼻腔滴注前至少1天，将二氧化硅在玛瑙研钵中研磨0.5小时。</li>
	<li>观察晶体颗粒的大小和形状，使用扫描电子显微镜（SEM）拍摄具有代表性的照片。
	<ol>
		<li>使用导电胶带将颗粒固定，以制备SEM样品。用吹风机轻轻吹去未牢固粘附的硅颗粒。</li>
		<li>抽真空至样品室，开启高压，捕获图像。 
		注意：镜头与样品之间的工作距离（WD）为5.9 mm，加速电压为2.0 kV，放大倍数（Mag）为100,000倍，使用SignalA探测器。颗粒呈不规则结晶分散状态，约80%的颗粒直径为1–5 µm（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备20 mg/mL的无菌CSD悬浮液。用无菌生理盐水稀释CSD，并在室温（RT）下使用超声振荡器（40 kHz，80 W）处理30分钟，混匀。</li>
	<li>在进行鼻腔滴注前，将CSD悬浮液在涡旋混合器上充分搅拌混合10秒。</li>
</ol>
3. 向小鼠施用鼻腔滴注
<ol>
	<li>使用麻醉机以每小时 3.6 mL 的流速给予 2% 异氟烷，快速麻醉小鼠（图 1B，左图）。 
	注意：麻醉操作应在通风橱中进行，以避免技术人员吸入麻醉气体。通过观察小鼠呼吸由快速不规则转变为缓慢平稳的状态，确认麻醉深度是否合适。</li>
	<li>在 4–8 秒内将 50 µL CSD 经鼻滴注（图 1B，右图）。
	<ol>
		<li>进行鼻腔滴注时，将小鼠头部置于研究人员食指指尖的掌指关节处。</li>
		<li>保持小鼠俯卧位，四指轻微弯曲，拇指指尖轻触小鼠下唇以拉直气道。避免接触咽部，以防诱发咽反射。</li>
		<li>使用 200 μl 移液器吸取 50 μl 液体，根据小鼠呼吸频率分 3 至 4 次滴入鼻腔，每次滴加 15 至 20 μl。每 3 天给药一次，12 天内共给药 5 次。对照组小鼠给予等量生理盐水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻柔按摩小鼠心区 5–10 次，持续 5 秒。
	<ol>
		<li>用手掌固定小鼠身体，用拇指和食指捏住其颈部背侧皮肤，其余手指固定小鼠后肢。&#160;然后用另一只手的食指在 5 秒内轻压小鼠心跳区域 5–10 次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>待小鼠呼吸稳定后，将其放入带有加热垫的恢复笼中观察，直至从麻醉中恢复，随后将小鼠放回原饲养笼。于第 31 天处死小鼠。</li>
</ol>
4. 收集肺组织并制备石蜡切片
<ol>
	<li>腹腔注射 0.18 mL 10% 水合氯醛，确保小鼠对脚趾或尾部刺激无反应（使用有齿镊进行测试），然后进行下一步操作。</li>
	<li>将小鼠四肢固定在泡沫实验板上，并喷洒 75% 酒精以润湿毛发。在锁骨中线处剪除大部分胸肋，打开小鼠胸腔，暴露心脏和肺组织。</li>
	<li>使用眼科手术剪立即剪开右心房，并从左心房搏动最明显的部位向心尖缓慢注入 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），使全血流出。随后，取下右肺下叶，于 -80 °C 保存，用于 Western blot 分析。</li>
	<li>PBS 灌注后，在同一部位继续灌注 10 mL 4% 多聚甲醛（PFA）。收集剩余肺组织，置于 30 mL 4% PFA 中固定，用于病理学分析。</li>
	<li>固定 72 小时后，将样本包埋于石蜡中。
	<ol>
		<li>在室温下，依次使用去离子水配制的梯度乙醇（EtOH）溶液（60%、70%、80%、90%、100%）对组织进行脱水处理，每级处理 1 小时。随后用二甲苯洗涤两次，每次 1 小时以透明化组织。</li>
		<li>将组织样本浸入熔化的石蜡中，在 50 °C 下加热 2 小时以完成浸蜡。在另一容器中重复此过程一次。将含组织的石蜡模具冷却 1 小时，使其凝固。</li>
		<li>待石蜡完全凝固且组织包埋完成后，使用石蜡切片机将组织切成 5 µm 厚的切片。精确的切片与载玻片贴附步骤此前已有描述11。 
		&#8203;注意：当组织接受 10 mL 4% PFA 灌注后出现肌肉抽搐、尾巴扭曲成 &#34;S&#34; 形或屈曲现象时，提示灌注充分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 进行苏木精-伊红（HE）染色
<ol>
	<li>将石蜡包埋组织置于热板（60 °C）上加热超过 4 小时，以促进组织与载玻片的黏附并改善脱蜡效果。</li>
	<li>脱蜡并水化石蜡切片。将载玻片样本先后浸入二甲苯中两次，每次 30 分钟。随后依次浸入无水乙醇、95%、85%、75% 乙醇，最后进入去离子水中，各步骤均持续 5 分钟。</li>
	<li>进行苏木精-伊红染色。将组织放入苏木精染色缸中染色 10 分钟，用缓流自来水冲洗 5 分钟。然后将载玻片浸入伊红染色缸中染色 10 秒。</li>
	<li>依次用 75%、85%、95% 和无水乙醇对样本脱水，每步 5 分钟。将组织切片浸入二甲苯中透明 5 分钟。滴加约 60 µL 中性树胶封片，盖上盖玻片，缓慢放下以避免产生气泡。</li>
</ol>
6. 进行Masson染色
<ol>
	<li>脱蜡并水化石蜡包埋样本，操作如步骤5.2所述。然后用50% Weigert苏木精染液对细胞核染色10分钟。将组织浸入酸性乙醇中解离10秒，再用流动水轻轻冲洗组织切片，使细胞核显蓝色。 
	注意：Weigert苏木精染液需现配现用。</li>
	<li>每张组织切片滴加40 µL李春红染色液，染色7分钟，随后用弱酸工作液（30%盐酸）洗涤1分钟，以去除未结合的李春红染料。</li>
	<li>将切片浸入95%乙醇中20秒，再用无水乙醇脱水两次，每次1–3秒。随后用二甲苯透明处理，并按步骤5.4所述，滴加60 µL中性树胶封片。</li>
</ol>
7. 进行天狼星红染色
<ol>
	<li>按照步骤5.2所述方法对石蜡切片进行脱蜡和水化处理。</li>
	<li>用 Sirius red 染色液对切片浸染1小时。</li>
	<li>用 Mayer 苏木精染色液对样品的细胞核染色8-10分钟，然后用流水轻轻冲洗10分钟。随后对组织切片进行脱水和透明处理，并按照步骤5.4所述方法封片。</li>
</ol>
8. 进行免疫组织化学染色
<ol>
	<li>按照步骤5.2所述方法对石蜡样本进行脱蜡和水化。</li>
	<li>用约30 mL的3 mg/mL EDTA抗原修复液浸润组织样本，煮沸20-30分钟。用去离子水清洗组织，然后在含0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）中孵育5分钟。</li>
	<li>用0.3%过氧化氢溶液浸泡样本15分钟，以灭活组织中的内源性过氧化物酶。用PBST清洗3次，每次5分钟。 
	注意：0.3%过氧化氢溶液必须在避光条件下新鲜配制。</li>
	<li>用0.3% Triton-100溶液对组织膜进行通透处理15分钟。随后加入30-40 µL的5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。</li>
	<li>去除封闭液。加入稀释的一抗NF-κB（稀释比例1:200）和CD68（稀释比例1:1,000），将样本置于免疫组化湿盒中，在2-8 °C孵育过夜，防止蒸发和光照。</li>
	<li>次日，将样本转移至室温（RT）孵育1小时。然后用PBST清洗3次，每次5分钟。</li>
	<li>在室温下用辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗（稀释比例1:500）孵育样本1小时，并用PBST清洗3次，每次5分钟。 
	注意：一抗和二抗均使用5% BSA溶液稀释。</li>
	<li>加入与酶标记抗体对应的3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物孵育5-20分钟。当染色强度达到最佳时，用去离子水终止反应。 
	注意：DAB溶液需新鲜配制并避光保存。显色反应应在显微镜下实时观察，以确定终止染色的时机。阳性样本呈现明显着色，阴性样本则无颜色生成。</li>
	<li>用Weigert苏木精对样本复染30秒。接着用流水冲洗组织1分钟。然后按照步骤5.4所述方法进行脱水、透明和封片处理。</li>
</ol>
9. 进行蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>裂解肺组织以提取蛋白质。向20 mg肺组织中加入200 µL RIPA工作液。</li>
	<li>使用手持式电动研磨器在冰上匀浆组织5分钟，并在冰上轻轻振荡孵育1小时。随后，在4 °C条件下以14,800 × g 离心15分钟。</li>
	<li>收集上清液，使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。用RIPA将蛋白储存液配制成6 µg/µL的浓度。向80 µL蛋白裂解液中加入20 µL 5×上样缓冲液。将含有蛋白的微量离心管置于金属浴中加热（100 °C）20分钟，以破坏蛋白的二级结构。</li>
	<li>冷却后，将100 µL蛋白储存液分装至各管中，并将样品储存在-80 °C冰箱中。电泳前用1×上样缓冲液将蛋白浓度稀释至2–3 μg/μL。 
	注意：蛋白提取过程应在冰上进行。配制RIPA工作液时，向99 µL RIPA中加入1 µL 100 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），以抑制磷酸化蛋白降解。&#160; 按1:4的比例用RIPA稀释5×上样缓冲液，制备1×上样缓冲液。&#160;</li>
	<li>每孔加入20 µg样品并运行凝胶。对于5%浓缩胶，使用80 V电压电泳20分钟，使蛋白从相同起始点向下迁移。对于10%分离胶，使用100 V电压运行1小时，以尽可能分离不同分子量的蛋白。</li>
	<li>用甲醇预活化PVDF膜20秒。采用湿转法，以400 mA电流将蛋白转移至PVDF膜上，持续1–2小时。 
	注意：确保电泳槽和电转槽处于水平状态。由于膜转移过程中会产生大量热量，需用冰对整个槽进行冷却。</li>
	<li>用TBST溶液每次洗涤5分钟，共洗5次。然后用5% BSA或5%脱脂奶粉在室温下封闭1小时。用5% BSA稀释一抗NF-κB（1:1,000）和β-actin（1:1,000）。将膜条浸入抗体溶液中，在2–8 °C轻轻振荡孵育过夜。</li>
	<li>用PBST洗涤膜条。接着，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗按1:10,000稀释，并在稀释后的二抗溶液中室温轻轻振荡孵育1小时。</li>
	<li>配制增强型化学发光（ECL）显影液，滴加于膜条上，孵育3分钟。</li>
	<li>将膜条置于凝胶成像仪中曝光20秒。利用系统软件测定膜条的灰度值，以评估蛋白表达水平。以β-actin作为内参对照。</li>
</ol>

<ol><li>Olsson, A., Kromhout, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+cancer+burden%3A+the+contribution+of+exposure+to+process-generated+substances+at+the+workplace%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace.</a> Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).</li>
<li>The Lancet Respiratory. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+world+is+failing+on+silicosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The world is failing on silicosis.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283(2019).</li>
<li>Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+massive+fibrosis%3A+An+overview+of+the+recent+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature.</a> Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232(2022).</li>
<li>Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Silicosis.</a> Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).</li>
<li>Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coal+workers%27+pneumoconiosis-attributable+years+of+potential+life+lost+to+life+expectancy+and+potential+life+lost+before+age+65+years+-+United+States%2C+1999-2016%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).</li>
<li>Voelker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+Lung+resurgence+raises+new+challenges+for+coal+country+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians.</a> JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).</li>
<li>Nakashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+heme+oxygenase-1+in+silica-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury.</a> Respiratory Research. 19 (1), 144(2018).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minute+cellular+nodules+as+early+lesions+in+rats+with+silica+exposure+via+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation.</a> Veterinary Sciences. 9 (6), 251(2022).</li>
<li>Salehi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+responses+in+C3H%2FHeJ+mice+following+nose-only+inhalation+exposure+to+different+sizes+of+beryllium+metal+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles.</a> Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emodin+suppresses+silica-induced+lung+fibrosis+by+promoting+Sirt1+signaling+via+direct+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact.</a> Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+and+thin+sectioning+of+microbial+colony+biofilms+for+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suitable+silicosis+mouse+model+was+constructed+by+repeated+inhalation+of+silica+dust+via+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose.</a> Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).</li>
<li>Mu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coal+dust+exposure+triggers+heterogeneity+of+transcriptional+profiles+in+mouse+pneumoconiosis+and+Vitamin+D+remedies%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies.</a> Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7(2022).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muc1+deficiency+exacerbates+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model+of+silicosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+depletion+may+attenuate+the+development+of+silica-induced+lung+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice.</a> PLoS One. 5 (11), 15404(2010).</li>
<li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060(2019).</li>
<li>Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+analysis+of+pulmonary+fibrotic+response+to+silica+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice.</a> The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

矽肺小鼠模型对于研究矽肺的发病机制和治疗方法至关重要。本方案描述了一种通过重复鼻腔暴露建立小鼠矽肺模型的方法。该方法可用于研究不同暴露时间所诱导的矽肺病理特征。小鼠在呼吸机上进行麻醉，并持续监测其呼吸频率。初始阶段表现为短暂而快速的呼吸，随后呼吸逐渐变慢加深。麻醉使小鼠肌肉松弛，产生深呼吸，从而在缓慢深呼吸的时间窗内吸入CSD。在此过程中，操作者用拇指固定小鼠下颌并伸直其颈部，以防止液体进入消化道。该可吸入粉尘暴露方法无痛且非侵入性，可满足重复实施的个体化研究需求，适用于粉尘暴露相关研究。Kato等在2017年采用单次大剂量（125 mg/mL，40 µL） 通过 通过鼻腔给予多次小剂量以模拟肺部变化，我们参考该浓度来研究口咽部滴注所致的肺纤维化14.
从技术角度来看，麻醉后经鼻滴注存在若干挑战。操作过程中，操作者需用拇指固定小鼠的下颌，以拉直其颈部并防止液体进入消化道。如果小鼠未达到深度麻醉状态，或操作者技术不熟练而错过缓慢深呼吸的时间窗口，则鼻滴效果及模型的病理特征将无法达到预期。因此，为避免麻醉过深导致死亡或麻...

在采矿、陶瓷、玻璃、石英加工和混凝土等行业中，工人不可避免地会接触到不规则的结晶型二氧化硅粉尘（CSD），这种粉尘可被吸入体内，且具有较高的毒性1,2。一种由长期吸入粉尘引起的慢性疾病——矽肺病，会导致进行性肺纤维化3。根据流行病学数据，过去几十年中，全球矽肺病的发病率总体呈下降趋势，但近年来却出现上升，并且更多地影响年轻人群体4,5,6。由于该病起病隐匿、潜伏期长，其发病机制对科学研究构成了重大挑战。目前，矽肺病的具体发病过程仍不明确。此外，尚无现有药物能够阻止矽肺病的进展或逆转肺纤维化。
目前矽肺病的小鼠模型涉及经气管摄入CSD混合悬浮液。例如，在麻醉后通过颈段气管创伤将CSD注入肺部的方法，并不能模拟人类反复暴露于粉尘环境的情况7。通过气溶胶形式暴露于CSD，可以更准确地研究环境粉尘暴露对个体的影响，这种方法更能反映该毒性物质在环境中的实际浓度8。然而，由于小鼠鼻部独特的生理结构，环境中的CSD无法直接吸入肺部9。此外，相关技术所用设备价格昂贵，这促使研究人员重新评估现有的小鼠矽肺病模型10。通过在2周内经鼻滴注CSD悬浮液5次，可建立一种动态的矽肺病模型。该模型具有一致性、安全性且操作简便。需要特别指出的是，本研究实现了小鼠对CSD的反复吸入。通过该方法建立的小鼠矽肺病模型预计将更符合科研需求。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 离心管</td><td>Biosharp</td><td>BS-05-M</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性福尔马林固定液</td><td>南昌裕禄实验设备有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒剂</td><td>新泰康源消毒制品有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CD68</td><td>Abcam</td><td>ab125212</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸抗原修复液</td><td>biosharp life science</td><td>BL619A</td><td></td></tr><tr><td>DAB 显色试剂盒</td><td>NJJCBio</td><td>W026-1-1</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>西亚化学科技（山东）有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>增强型 BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0009</td><td></td></tr><tr><td>苏木精-伊红（H&amp;E）染色液</td><td>碧云天生物技术</td><td>C0105S</td><td></td></tr><tr><td>HRP 底物</td><td>Millipore Corporation</td><td>P90720</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的 Affinipure 羊抗兔 IgG(H+L)</td><td>Proteintech</td><td>Sa00001-2</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>西亚化学科技（山东）有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD 生命科学</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Masson 三色染色试剂盒</td><td>索莱宝</td><td>G1340</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Macklin</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Millipore</td><td>AXYMCT150CS</td><td></td></tr><tr><td>NF-&amp;kappa;B p65</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8242S</td><td></td></tr><tr><td>振荡恒温金属浴</td><td>Abson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>石蜡包埋机</td><td>精密（常州）医疗设备有限公司</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片机</td><td>金华科瑞特仪器有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）&amp;nbsp;</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水&amp;nbsp;</td><td>淮南市第一人民医院</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>碧云天生物技术</td><td>ST505</td><td></td></tr><tr><td>偏光显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Acculab</td><td>ALC-110.4</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>GraphPad&amp;nbsp;</td><td>Version 7.0</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Millipore</td><td>3010040001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>RODI IOT 智能多功能水净化系统</td><td>RSJ</td><td>RODI-220BN</td><td></td></tr><tr><td>Scilogex SK-D1807-E 三维摇床</td><td>Scilogex</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅</td><td>Sigma</td><td>#BCBV6865</td><td></td></tr><tr><td>天狼星红染色液</td><td>南京森贝嘉生物科技有限公司</td><td>181012</td><td></td></tr><tr><td>小动物麻醉机</td><td>安徽耀坤生物科技有限公司</td><td>ZL-04A</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头（0.1&amp;ndash;10 &amp;micro;L）</td><td>KIRGEN</td><td>KG1011</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头（100&amp;ndash;1000 &amp;micro;L）</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头（1&amp;ndash;200 &amp;micro;L）</td><td>KIRGEN</td><td>KG1212</td><td></td></tr><tr><td>涡旋&amp;nbsp;混合器&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS GeminiSEM 500</td><td>Zeiss Germany</td><td>SEM 500</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin</td><td>Bioss</td><td>bs-0061R</td><td></td></tr></tbody></table>

通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

在工业环境中暴露于呼吸性结晶二氧化硅粉尘（CSD）可导致矽肺病。通过小鼠矽肺模型，已对人类矽肺病的病理生理学、筛查及治疗方法进行了广泛研究。通过反复使小鼠吸入CSD进入肺部，可模拟人类矽肺病的临床症状。该方法在时间和产出方面具有实用性和高效性，且不会因手术造成上呼吸道的机械性损伤。此外，该模型能够成功模拟矽肺病的急性/慢性转化过程。主要操作步骤如下：将灭菌的1-5 µm CSD粉末充分研磨后悬浮于生理盐水中，并在超声水浴中分散30分钟。在异氟烷麻醉下的小鼠呼吸由浅快转为深慢，吸气持续约2秒。将小鼠置于手掌中，用拇指尖轻轻触碰小鼠下颌边缘以拉直气道。每次呼气后，小鼠通过单侧鼻孔逐滴吸入二氧化硅悬浮液，整个过程在4-8秒内完成。待小鼠呼吸稳定后，轻抚其胸部以防止吸入的CSD被咳出。随后将小鼠放回笼中。总之，该模型可沿微小颗粒物进入肺部的典型生理通路——从上呼吸道至终末细支气管和肺泡——实现CSD的定量递送。同时，该模型还能模拟职业人员因工作导致的反复暴露情况。该模型可由一人独立操作，无需昂贵设备，能够方便、有效地模拟人类矽肺病的疾病特征，且具有高度可重复性。

采用所提出的方法研究了小鼠矽肺病的潜在发病机制。我们发现，实验组小鼠的体重较对照组显著下降，且在停止暴露后体重恢复缓慢。由于本实验采用了优化的剂量，暴露于二氧化硅的小鼠未出现死亡。重复经鼻滴注至CSD的技术路线图如（图1）。先前描述的步骤包括CSD悬浮液制备、异氟烷诱导麻醉、鼻腔滴注以及胸部按摩12我们通过4周的静态喂养，证实了胶原沉积和肌成纤维细胞分化。12我们采用这种粉尘暴露方法研究了煤尘引起肺纤维化的潜在机制。通过单细胞转录组技术，发现了巨噬细胞的新亚群以及维生素D的干预作用。13在本研究中，小鼠暴露于CSD后肺纤维化进程显著加快，导致支气管周围弹性纤维受损（图2 和 图3矽肺结节由含有结晶二氧化硅颗粒（CSD）的巨噬细胞构成。纤维化结节富含大量CSD，且CD68阳性巨噬细胞可主...

本方案描述了一种通过反复暴露于二氧化硅悬浮液来建立小鼠矽肺模型的方法 通过 鼻腔滴注法。该模型能够高效、便捷且灵活地模拟人类矽肺病的病理过程，具有高度可重复性和经济性。

矽肺病可由工业环境中暴露于呼吸性结晶型二氧化硅粉尘（CSD）引起。其病理生理学、筛查及……

在通过激光辅助向体内注入结晶型二氧化硅粉尘所建立的小鼠矽肺模型中，该结晶型二氧化硅悬浮液多次注入在很大程度上模拟了人类矽肺病的发生与发展过程。该方法节省时间与操作难度，兼具实用性与高效性，且由于操作方式的原因，不会对上呼吸道造成机械性损伤。该方法也可用于制备病毒、细菌等疾病的模型。演示该实验步骤的是我实验室的硕士研究生 Hangbing Cao，他擅长制备矽肺小鼠模型。在进行鼻腔滴注前，至少提前一天准备结晶二氧化硅粉尘（CSD）。为此，将二氧化硅在玛瑙研钵中研磨半小时。为检查颗粒大小和形貌，使用导电胶带固定硅颗粒，制备扫描电子显微镜（SEM）样品。使用吹风机轻轻吹去未牢固粘附的颗粒，然后进行图像采集。接下来，使用超声波振荡器将研磨后的二氧化硅与无菌生理盐水混合，配制成浓度为20毫克/毫升的溶液。最后，将制备好的CSD悬浮液涡旋振荡10秒。通过鼻滴方式，向麻醉小鼠给予50微升CSD，持续4至8秒。用等量生理盐水处理对照小鼠，然后用手掌固定小鼠身体，用拇指和食指捏住其颈部背部的皮肤，同时用其余手指固定小鼠后肢。用另一只手的食指轻轻按压小鼠心搏区域，每5秒按压5至10次。将石蜡包埋的肺组织置于60摄氏度的加热板上加热超过4小时。为脱蜡并水化石蜡切片，将切片先后浸入二甲苯中各30分钟，重复两次；随后依次将切片浸入无水乙醇、95%、85%和75%乙醇中，每种浓度各5分钟，最后放入去离子水中；然后将切片置于苏木精染色缸中染色10分钟，再用流水轻轻冲洗5分钟。接着将切片浸入伊红染色缸中染色10秒。将样品依次浸入75%、85%、95%及无水乙醇中各5分钟进行脱水，再将切片浸入二甲苯中5分钟以透明化组织，最后滴加约60微升中性树胶封片。将盖玻片小心地覆盖在切片上。进行Masson染色时，用新配制的50%Weigert苏木精对脱蜡并水化的石蜡切片染色10分钟，然后将组织浸入酸性乙醇溶液中10秒，再用流动水轻轻冲洗切片，使细胞核显蓝色。接着，滴加红色染色液染色7分钟，并用30%盐酸工作液洗涤1分钟。将切片浸入95%酒精中20秒后，用无水乙醇脱水，每次1至3秒，重复两次，然后参照之前的方法对样本进行透明和封片。进行天狼星红染色时，将脱蜡并水化的切片浸入天狼星红染色液中染色1小时，随后用Mayer苏木精染色液对细胞核染色8至10分钟。染色后，在流水下轻轻冲洗10分钟，然后进行脱水、透明和封片处理。将脱蜡并水化的石蜡切片浸入30毫升浓度为3毫克/毫升的EDTA抗原修复溶液中。将切片煮沸20至30分钟，随后用去离子水洗涤，并在PBST中孵育5分钟。用新鲜配制的0.3%过氧化氢溶液浸泡切片15分钟，再用PBST洗涤三次，每次5分钟。用0.3% Triton 100溶液对样本膜进行通透处理15分钟，并加入30至40微升5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。去除封闭液后，加入适当稀释的一抗NF-kappa B和CD-68，在2至8摄氏度条件下于显微镜载玻片IHC湿盒中孵育过夜。次日，将样本转移至室温放置1小时后，用PBST洗涤3次，每次5分钟。将样品在室温下与兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗孵育一小时。孵育后，用PBST再次洗涤样品，每次五分钟，共洗三次，然后将样品与对应于酶标记抗体的DAB底物孵育五至二十分钟。用去离子水淬灭反应后，用Weigert苏木精对样品复染30秒。在流水下冲洗一分钟，然后对组织进行脱水、透明和封固。在进行 Western 印迹分析之前，将组织置于冰上，用 RIPA 工作液使用手持式电动研磨器匀浆五分钟。在冰上振荡孵育一小时，然后在 4°C 条件下以 14,800 ×g 离心 15 分钟。收集上清液，并使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。向上清液中加入20微升5X上样缓冲液，然后将用RIPA缓冲液配制的每微升含6微克蛋白的储存液置于金属浴中，于100摄氏度加热20分钟。将每管100微升的蛋白溶液分装后于-80摄氏度保存。进行电泳时，用RIPA裂解液将等分试样稀释至每微升含2至3微克蛋白，然后每孔加入20微克样品以运行凝胶。使用湿转法，以400毫安电流将蛋白转移至经甲醇预活化20秒的PVDF膜上，转移时间为1至2小时。用PBST溶液洗涤膜5次，每次5分钟，随后用5% BSA或脱脂奶粉封闭1小时。将条带浸入含有用5% BSA稀释的NF-kappa B和beta actin一抗溶液中，在2至8摄氏度下轻轻振荡孵育过夜，随后用PBST洗涤。接着，先将条带在稀释的二抗中室温轻轻振荡孵育1小时，然后与增强型化学发光显影液作用3分钟。将胶条置于凝胶成像系统中曝光20秒，并使用系统软件测量胶条的灰度值以评估蛋白水平。CSD的扫描电镜图像显示，其颗粒呈不规则形状。通过天狼星红染色检测胶原沉积，结果显示，小鼠暴露于CSD一个月后，肺纤维化的进展显著加快。偏振显微镜揭示了三种不同类型的胶原纤维，其中呈红色的Ⅰ型胶原纤维是矽肺病的风险因素，但在对照组中未发现明显的纤维化，相应的纤维化评分也证实了这一点。经CSD处理的小鼠肺组织HE染色显示典型的二氧化硅结节，其特征为中心区域因吞噬CSD后发生液化性坏死，周围则被巨噬细胞包绕。Masson 染色还显示，结节富含伴有纤维化的 CSD。CD-68 免疫组织化学染色进一步揭示了肺组织中广泛存在巨噬细胞。偏振光显微镜显示，这些巨噬细胞已吞噬 CSD，导致严重的肺损伤。免疫组织化学染色显示，与对照组相比，CSD处理组的NF-κB染色更强，表明其炎症反应更高。代表性Western印迹结果也显示，CSD处理小鼠肺组织中NF-κB的表达水平更高，且两组间的表达差异具有显著性。为避免呼吸道阻塞并促进呼吸功能恢复，在持续5秒的操作后，需如示范所示轻轻按摩小鼠心脏区域5至10次。该模型可用于探索矽肺病的某些潜在机制，并有助于治疗药物的筛选，同时建立剂量和持续时间等关键参数。该技术为向小鼠模型暴露颗粒物（无论是否添加细菌）提供了一种方便、有效且经济的方法。监测小鼠行为有助于确定吸入颗粒物可能产生的影响。

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通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

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