通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

在通过激光辅助向体内注入结晶型二氧化硅粉尘所建立的小鼠矽肺模型中，该结晶型二氧化硅悬浮液多次注入在很大程度上模拟了人类矽肺病的发生与发展过程。该方法节省时间与操作难度，兼具实用性与高效性，且由于操作方式的原因，不会对上呼吸道造成机械性损伤。

该方法也可用于制备病毒、细菌等疾病的模型。演示该实验步骤的是我实验室的硕士研究生 Hangbing Cao，他擅长制备矽肺小鼠模型。在进行鼻腔滴注前，至少提前一天准备结晶二氧化硅粉尘（CSD）。

为此，将二氧化硅在玛瑙研钵中研磨半小时。为检查颗粒大小和形貌，使用导电胶带固定硅颗粒，制备扫描电子显微镜（SEM）样品。使用吹风机轻轻吹去未牢固粘附的颗粒，然后进行图像采集。

接下来，使用超声波振荡器将研磨后的二氧化硅与无菌生理盐水混合，配制成浓度为20毫克/毫升的溶液。最后，将制备好的CSD悬浮液涡旋振荡10秒。通过鼻滴方式，向麻醉小鼠给予50微升CSD，持续4至8秒。

用等量生理盐水处理对照小鼠，然后用手掌固定小鼠身体，用拇指和食指捏住其颈部背部的皮肤，同时用其余手指固定小鼠后肢。用另一只手的食指轻轻按压小鼠心搏区域，每5秒按压5至10次。将石蜡包埋的肺组织置于60摄氏度的加热板上加热超过4小时。

为脱蜡并水化石蜡切片，将切片先后浸入二甲苯中各30分钟，重复两次；随后依次将切片浸入无水乙醇、95%、85%和75%乙醇中，每种浓度各5分钟，最后放入去离子水中；然后将切片置于苏木精染色缸中染色10分钟，再用流水轻轻冲洗5分钟。接着将切片浸入伊红染色缸中染色10秒。将样品依次浸入75%、85%、95%及无水乙醇中各5分钟进行脱水，再将切片浸入二甲苯中5分钟以透明化组织，最后滴加约60微升中性树胶封片。

将盖玻片小心地覆盖在切片上。进行Masson染色时，用新配制的50%Weigert苏木精对脱蜡并水化的石蜡切片染色10分钟，然后将组织浸入酸性乙醇溶液中10秒，再用流动水轻轻冲洗切片，使细胞核显蓝色。接着，滴加红色染色液染色7分钟，并用30%盐酸工作液洗涤1分钟。

将切片浸入95%酒精中20秒后，用无水乙醇脱水，每次1至3秒，重复两次，然后参照之前的方法对样本进行透明和封片。进行天狼星红染色时，将脱蜡并水化的切片浸入天狼星红染色液中染色1小时，随后用Mayer苏木精染色液对细胞核染色8至10分钟。染色后，在流水下轻轻冲洗10分钟，然后进行脱水、透明和封片处理。

将脱蜡并水化的石蜡切片浸入30毫升浓度为3毫克/毫升的EDTA抗原修复溶液中。将切片煮沸20至30分钟，随后用去离子水洗涤，并在PBST中孵育5分钟。用新鲜配制的0.3%过氧化氢溶液浸泡切片15分钟，再用PBST洗涤三次，每次5分钟。

用0.3% Triton 100溶液对样本膜进行通透处理15分钟，并加入30至40微升5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。去除封闭液后，加入适当稀释的一抗NF-kappa B和CD-68，在2至8摄氏度条件下于显微镜载玻片IHC湿盒中孵育过夜。次日，将样本转移至室温放置1小时后，用PBST洗涤3次，每次5分钟。

将样品在室温下与兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗孵育一小时。孵育后，用PBST再次洗涤样品，每次五分钟，共洗三次，然后将样品与对应于酶标记抗体的DAB底物孵育五至二十分钟。用去离子水淬灭反应后，用Weigert苏木精对样品复染30秒。

在流水下冲洗一分钟，然后对组织进行脱水、透明和封固。在进行 Western 印迹分析之前，将组织置于冰上，用 RIPA 工作液使用手持式电动研磨器匀浆五分钟。在冰上振荡孵育一小时，然后在 4°C 条件下以 14,800 ×g 离心 15 分钟。

收集上清液，并使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。向上清液中加入20微升5X上样缓冲液，然后将用RIPA缓冲液配制的每微升含6微克蛋白的储存液置于金属浴中，于100摄氏度加热20分钟。将每管100微升的蛋白溶液分装后于-80摄氏度保存。

进行电泳时，用RIPA裂解液将等分试样稀释至每微升含2至3微克蛋白，然后每孔加入20微克样品以运行凝胶。使用湿转法，以400毫安电流将蛋白转移至经甲醇预活化20秒的PVDF膜上，转移时间为1至2小时。用PBST溶液洗涤膜5次，每次5分钟，随后用5% BSA或脱脂奶粉封闭1小时。

将条带浸入含有用5% BSA稀释的NF-kappa B和beta actin一抗溶液中，在2至8摄氏度下轻轻振荡孵育过夜，随后用PBST洗涤。接着，先将条带在稀释的二抗中室温轻轻振荡孵育1小时，然后与增强型化学发光显影液作用3分钟。

将胶条置于凝胶成像系统中曝光20秒，并使用系统软件测量胶条的灰度值以评估蛋白水平。CSD的扫描电镜图像显示，其颗粒呈不规则形状。通过天狼星红染色检测胶原沉积，结果显示，小鼠暴露于CSD一个月后，肺纤维化的进展显著加快。

偏振显微镜揭示了三种不同类型的胶原纤维，其中呈红色的Ⅰ型胶原纤维是矽肺病的风险因素，但在对照组中未发现明显的纤维化，相应的纤维化评分也证实了这一点。经CSD处理的小鼠肺组织HE染色显示典型的二氧化硅结节，其特征为中心区域因吞噬CSD后发生液化性坏死，周围则被巨噬细胞包绕。

Masson 染色还显示，结节富含伴有纤维化的 CSD。CD-68 免疫组织化学染色进一步揭示了肺组织中广泛存在巨噬细胞。偏振光显微镜显示，这些巨噬细胞已吞噬 CSD，导致严重的肺损伤。

免疫组织化学染色显示，与对照组相比，CSD处理组的NF-κB染色更强，表明其炎症反应更高。代表性Western印迹结果也显示，CSD处理小鼠肺组织中NF-κB的表达水平更高，且两组间的表达差异具有显著性。为避免呼吸道阻塞并促进呼吸功能恢复，在持续5秒的操作后，需如示范所示轻轻按摩小鼠心脏区域5至10次。

该模型可用于探索矽肺病的某些潜在机制，并有助于治疗药物的筛选，同时建立剂量和持续时间等关键参数。该技术为向小鼠模型暴露颗粒物（无论是否添加细菌）提供了一种方便、有效且经济的方法。监测小鼠行为有助于确定吸入颗粒物可能产生的影响。