Name: 胰腺组织解剖以分离活的单细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学习胰腺组织解离技术，用于从正常胰腺、癌前病变及肿瘤组织中分离活的单细胞。该方法操作简便，可高效获取高活性细胞，助力胰腺癌研究与新治疗靶点发现。

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我们感谢 Avital Sarusi-Portuguez 博士在数据分析方面的帮助，以及 Dror Kolodkin-Gal 博士在先前研究中协助建立实验方案。感谢 Parnas 实验室所有曾经和现任的成员。感谢 Gillian Kay 博士和 Michael Kanovsky 博士在文稿编辑过程中提供的帮助。本项目获得了以色列科学基金会资助（编号 526/18 O.P.）、Alex U. Soyka 项目以及以色列癌症研究基金（研究职业发展奖）的资助。

希伯来大学（以色列耶路撒冷）和哈达萨医学中心（以色列耶路撒冷）的联合伦理委员会（机构动物护理与使用委员会）批准了本研究的动物福利方案（MD-18-15417-5 &#34;小鼠胰腺癌中的组织动态&#34;），本文所述方案符合动物实验与研究相关的所有伦理规定。希伯来大学是国际实验动物评估和认可委员会认证的机构。
注意：小鼠品系编号007908、编号019378和编号008179购自杰克逊实验室。PRT（Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato）小鼠通过上述品系杂交获得。实验使用6周龄至15月龄、两种性别的小鼠。他莫昔芬通过将粉末溶解于玉米油中配制而成。成年小鼠（6–8周龄，雌性和雄性）在第0天和第2天以400 mg/kg剂量皮下注射他莫昔芬，之后每周观察两次。由于肿瘤位于体内，无法进行测量；因此，根据伦理协议，若观察到异常临床症状，则实施安乐死。在他莫昔芬诱导后的不同时间点，采用异氟烷麻醉并颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。
1. 胰腺解剖
注意：为了在提取过程中获得最佳产量并确保良好的细胞活力，快速解剖至关重要。为了缩短胰腺分离所需时间，在处死小鼠之前，所有器械和设备必须预先准备好并置于冰上。
<ol>
	<li>通过 CO2&#160;窒息法处死小鼠，并通过颈椎脱位确认死亡。自此步骤起，所有操作必须使用无菌解剖器械进行。</li>
	<li>固定小鼠，并用70%乙醇喷洒腹部。用剪刀和镊子在生殖区域做一长约2.5 cm的V形切口，向上延伸，完全打开腹腔。</li>
	<li>在小鼠左侧找到胃部，胰腺位于脾脏附近。使用两把镊子将胰腺从胃和十二指肠上分离（避免撕裂）。继续操作，将胰腺从小肠、空肠和回肠上分离。</li>
	<li>将胰腺移至小鼠右侧。用镊子分离胰腺与胸腔之间剩余的连接组织，完全游离胰腺及其附着的脾脏。</li>
	<li>取出胰腺，置于冰上的培养皿中展平以供检查。 
	注意：此步骤需格外小心，仅取胰腺组织，避免连同肠系膜脂肪或其他邻近组织一并取出，以防细胞污染。</li>
</ol>
2. 胰腺的酶解和机械解离
<ol>
	<li>提前配制以下缓冲液。
	<ol>
		<li>解离缓冲液1：每个样本使用4 mL胰蛋白酶C和6 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（见表1）。</li>
		<li>解离缓冲液2：9 mL 1×Hanks′平衡盐溶液（HBSS）；4%牛血清白蛋白（BSA）；1 mL胶原酶P（10 mg/mL）；200 µL胰蛋白酶抑制剂（10 mg/mL）；以及200 µL DNase I（10 mg/mL）（见表1）。</li>
		<li>洗涤缓冲液：50 mL 1×HBSS；2 g BSA；1 mL胰蛋白酶抑制剂（10 mg/mL）；以及1 mL DNase 1（10 mg/mL）。</li>
		<li>酶活性终止液：含5%胎牛血清（FBS）和150 g DNase I（0.2 mg/mL）的1×HBSS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胰腺置于冰上的50 mL离心管中。用含10% FBS的1×HBSS冲洗胰腺。脂肪组织会漂浮，而胰腺会下沉。这是一种简便的方法，可直观识别并快速去除仍附着在胰腺上的白色脂肪组织污染。</li>
	<li>将小鼠胰腺组织转移至含有5 mL冰上预冷的1×HBSS的无菌培养皿中。使用Noyes剪刀和手术刀将胰腺切成1至3 mm3的小块（图2A）。若处理多个样本，应将样本保存在含10% FBS的1×HBSS中并置于冰上。</li>
	<li>将组织转移至离心管中，在4 °C下以350 × g离心5分钟。吸除并弃去上清液，以去除细胞碎片和血细胞。</li>
	<li>将组织块重悬于含0.02%胰蛋白酶C和0.05% EDTA的解离缓冲液1中，在37 °C下振荡（180 rpm）孵育10分钟。立即用含10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）洗涤。在4 °C下以350 g离心5分钟。</li>
	<li>再次将沉淀重悬于10 mL洗涤缓冲液中，在下一步解离前于4 °C下以350 × g离心5分钟进行洗涤。</li>
	<li>将胰腺组织在解离缓冲液2中于37 °C下振荡（180 rpm）孵育15分钟。</li>
	<li>孵育15分钟后，使用逐渐减小规格的无菌移液管（25、10和5 mL移液管）剧烈吹打胰腺碎片10次进行机械解离，然后放回37 °C继续孵育。
	<ol>
		<li>再孵育5分钟后，重复机械解离操作，并通过显微镜观察单细胞悬液的比例来监测解离程度。通常在此阶段，若单细胞比例低于90%，则需延长孵育时间。使用台盼蓝染色检测细胞活力。</li>
		<li>继续孵育，并每隔5分钟取样检测解离情况。 
		注意：总孵育时间取决于组织特性，不同样本间可能存在差异。当90%以上的细胞已解离为单细胞，或检测到细胞活力下降时，应终止孵育和组织解离过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当胰腺组织充分解离（表现为胰腺碎片消失且溶液浊度增加）（图2）后，在4 °C下用酶活性终止液洗涤两次，每次5分钟，以终止酶反应。自此步骤起，将细胞悬液置于冰上保存。</li>
	<li>将细胞悬液通过70 µm尼龙筛网过滤，并在显微镜下检测细胞活力。使用更小孔径的尼龙筛网可能会降低细胞活力。</li>
	<li>用5–10 mL冰浴缓冲洗涤液重悬并洗涤沉淀，计数细胞。</li>
	<li>若观察到较多红细胞，可在室温下用红细胞裂解缓冲液处理细胞2分钟。若发现细胞团块，应按照步骤2.5所述再次使用胰蛋白酶处理样本。使用台盼蓝染色在显微镜下检测细胞活力，若活力低于80%，应使用磁珠激活细胞分选（MACS）死细胞去除试剂盒配合MACS MS柱分离活细胞（见表1）。</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+single-cell+RNA-seq+highlights+intra-tumoral+heterogeneity+and+malignant+progression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cell Research. 29 (9), 777(2019).</li>
<li>Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+progression+in+the+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetic progression in the pancreatic ducts.</a> The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).</li>
<li>Schlesinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+pancreatic+preinvasive+lesions+and+cancer+reveal+acinar+metaplastic+cells%27+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity.</a> Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).</li>
<li>Kolodkin-Gal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senolytic+elimination+of+Cox2-expressing+senescent+cells+inhibits+the+growth+of+premalignant+pancreatic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions.</a> Gut. 71 (2), 345-355 (2021).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li>
<li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li>
<li>Bernard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+pancreatic+cancer+precursors+demonstrates+epithelial+and+microenvironmental+heterogeneity+as+an+early+event+in+neoplastic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression.</a> Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).</li>
<li>Moncada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+microarray-based+spatial+transcriptomics+and+single-cell+RNA-seq+reveals+tissue+architecture+in+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas.</a> Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptome+profiling+of+pancreatic+cancer+identifies+multicellular+dynamics+associated+with+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment.</a> Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).</li>
<li>Cui Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+drivers+and+transitional+cell+populations+cooperate+with+the+microenvironment+in+untreated+and+chemo-resistant+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文介绍了一种胰腺组织解离的实验方案。该方案操作简便，可用于在恶性病变过程的不同阶段（包括实体瘤）从胰腺组织中分离出具有活性的单细胞。在以往的研究中，曾使用不同类型的胶原酶来消化胰腺组织8,9。使用活性较强的胶原酶（如胶原酶D）会导致获得较多的免疫细胞，而上皮细胞的比例则较低。而使用胶原酶P则可实现对完整或肿瘤性胰腺组织均适用的消化效果。
根据我们的观察，所有细胞类型均可被分离。我们先前已通过免疫组织化学方法验证了免疫T细胞的浸润5；我们认为，在分析中观察到的各类细胞的相对数量能够较好地近似反映组织中细胞的实际分布情况，但腺泡细胞因较为脆弱而存在代表性不足的问题。如果需要准确评估组织中各类细胞的比例，我们建议采用免疫组织化学或空间转录组学技术10,11,<sup class="xr...

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具侵袭性的癌症类型之一1。临床证据表明，PDAC由外分泌系统细胞（包括腺泡细胞）发展而来，这一过程持续多年，主要由KRAS原癌基因的突变驱动2。
胰腺肿瘤包含多种不同的细胞类型，研究表明恶性细胞仅占肿瘤质量的20%–50%3。不同类型的细胞与上皮细胞相互作用，促进其转化，并增强肿瘤的形成和生长。早期事件导致腺泡细胞发生化生，从而产生称为胰腺上皮内瘤变（PanINs）的微小病变，这些病变在某些情况下可发展为胰腺导管腺癌（PDAC）4。
迫切需要研究这些相互作用并靶向关键信号。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种强大的方法，可在单细胞分辨率下揭示基因表达，从而追踪上皮细胞发生的变化，进而探索胰腺癌的发展过程。
组织解离和消化为单细胞是单细胞RNA测序（scRNA-seq）实验的第一步。胰腺组织的消化尤其具有挑战性，原因包括以下几点：（i）腺泡细胞占胰腺组织的90%以上，且含有大量消化酶，包括蛋白酶和RNase，这些酶会降低基于RNA文库的质量；（ii）腺泡细胞非常敏感，若采用标准操作流程，容易发生裂解；（iii）腺泡细胞会以极高水平表达少数基因，因此若在实验过程中发生裂解，可能污染其他细胞的基因表达谱；（iv）从肿瘤中获取的胰腺组织具有明显的纤维化（desmoplastic）特征，难以在不损伤细胞的情况下进行解剖。因此，尽管实验要求保持所有细胞类型的高存活率，但腺泡细胞数量多且敏感性高，进一步增加了实验复杂性。这些因素使得获得符合scRNA-seq实验要求的单细胞悬液——即细胞存活率高于80%且无细胞团块——变得十分困难。
本文中，我们建立了一种使用胰蛋白酶C和胶原酶P并结合频繁组织监测的实验方案。该方法可在获得单细胞悬液的同时保持较高的细胞活力，从而支持单细胞RNA测序（scRNA-seq）实验的成功进行5,6。

<table><tbody><tr><td>试剂或资源</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 尼龙网&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>cat##431751</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>cat# A7906</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 P</td><td>罗氏</td><td>cat# 11213857001</td><td></td></tr><tr><td>关键商业试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>cat#MBD0015</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>罗氏</td><td>cat# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>实验模型：生物体/品系</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>南美胎牛血清</td><td>ThermoFisher</td><td>货号#10270106</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液</td><td>生物产业</td><td>cat#02-018-1A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;KRAS&lt;sup&gt;LSL-G12D&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX008179</td><td></td></tr><tr><td>MACS 死亡细胞去除试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>货号#130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>生物产业</td><td>cat#02-023-1A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ptf1a-Cre&lt;sup&gt;内质网 &lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX019378</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ptf1a-Cre&lt;sup&gt;内质网&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;; &lt;em&gt;Rosa26&lt;sup&gt;LSL-tdTomato &lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX007908</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>生物工业</td><td>cat# 03-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>罗氏</td><td>cat#T6522</td><td></td></tr></tbody></table>

胰腺组织解离以分离有活力的单细胞

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

胰腺包含两大主要系统：内分泌系统和外分泌系统。内分泌系统负责产生和分泌激素；外分泌系统约占胰腺的90%，包含产生和分泌消化酶的细胞。这些消化酶由胰腺腺泡细胞产生，储存于称为酶原颗粒的囊泡中，随后被释放至十二指肠。 通过 胰管以启动代谢过程。腺泡细胞产生的酶可杀死细胞或降解无细胞RNA。此外，腺泡细胞十分脆弱，常规的解离方案常导致大量细胞死亡，并释放出无细胞的蛋白酶和RNA酶。因此，胰腺组织消化过程中最大的挑战之一是获得完整且具有活性的细胞，尤其是腺泡细胞。本文介绍的实验方案展示了一种我们开发的两步法，旨在满足这一需求。该方案可用于消化正常胰腺、含有癌前病变的胰腺，或含有大量间质细胞和免疫细胞的胰腺肿瘤。

在最近发表的一项研究5中，我们应用上述方案，利用小鼠模型探索胰腺导管腺癌（PDAC）发展的早期阶段。该小鼠经过基因工程改造，携带&#160;Ptf1a-CreER、LSL-Kras-G12D、LSL-tdTomato7 等基因元件，可在注射他莫昔芬后于腺泡细胞中表达持续活化的KRAS蛋白。
颈椎脱位处死小鼠后（根据小鼠伦理操作规程），切除胰腺，并应用上述方案（见图1&#160;和方案部分）。
为了优化解离方案，分别在有或无胰蛋白酶C预孵育的条件下进行组织解离。结果发现，使用胰蛋白酶C预孵育可加速组织解离，且不影响细胞活力。此外，尝试了多种胶原酶，包括胶原酶D、胶原酶1a和胶原酶P（见表1）。结果显示，使用胶原酶D会导致大量细胞死亡；事实上，在其他使用该...

胰腺化生细胞是可发展为胰腺肿瘤的恶性细胞前体。然而，分离完整且具有活性的胰腺细胞具有挑战性。本文介绍一种高效的胰腺组织解离方法，所获得的细胞可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或二维、三维共培养实验。

胰腺包含两大主要系统：内分泌系统，负责产生和分泌激素；以及外分泌系统，其占……

本研究所展示的胰腺组织解离方案操作简便，可作为一种有效工具，用于从恶性病变过程不同阶段（包括实体瘤）的胰腺组织中分离出具有活性的单细胞。获取完整且具有活性的腺泡细胞是一项主要挑战。该方案能够从正常胰腺、存在癌前病变的胰腺以及含有大量间质细胞和免疫细胞的胰腺肿瘤中成功回收具有活性的单细胞。采用本方案分离人类胰腺肿瘤或炎症胰腺组织，有助于深入研究这些疾病，以发现新的生物标志物和治疗方法。该方法操作简便，经过少量练习即可获得理想结果。本视频将有助于观察该方案中的细微操作步骤。开始解剖前，将所有器械和设备预先置于冰上备用。固定安乐死小鼠后，用70%乙醇喷洒其腹部。使用剪刀和镊子，在动物的生殖区域做一长约2.5厘米的V形切口，并向上延伸，完全打开腹腔。在小鼠左侧找到胃，以及靠近脾脏的胰腺。使用两把镊子，小心分离胰腺与胃及十二指肠，避免撕裂。继续操作，将胰腺从小肠、空肠和回肠上分离下来。将胰腺移至右侧，用镊子分离胰腺与胸腔之间剩余的连接组织，以完全游离胰腺及其附着的脾脏。小心地去除胰腺上的肠系膜脂肪及其他邻近组织，并将胰腺在冰上的培养皿中铺展开以供检查。根据文中所述成分，预先配制解离缓冲液1和缓冲液2、洗涤缓冲液以及酶活性终止液。将胰腺置于一个50毫升的离心管中，冰上操作，并用含10%胎牛血清（FBS）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）冲洗。脂肪会漂浮，而胰腺会下沉。这是一种简便的方法，可直观地识别并快速去除仍附着在胰腺上的白色脂肪组织污染物。接下来，将小鼠胰腺组织转移至含有5 mL HBSS的无菌培养皿中，置于冰上保存直至切割。使用Noyes剪刀和手术刀将胰腺切成1至3 mm³的小块。将组织转移至离心管后，在4°C条件下以350 × g离心5分钟。吸弃上清液，以去除细胞碎片和血细胞。将组织块重悬于含有0.02%胰蛋白酶-C和0.05%EDTA的解离缓冲液1中，于37摄氏度振荡孵育10分钟。立即用10%胎牛血清和杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）洗涤，并在350×g、4摄氏度条件下离心5分钟。再次将沉淀重悬于10毫升洗涤缓冲液中，洗涤一次，然后以相同条件离心5分钟，再进行下一步解离。将胰腺组织置于解离缓冲液2中，在37摄氏度下以每分钟180转的速度振荡孵育15分钟。15分钟后，使用无菌移液管对胰腺碎片进行剧烈吹打10次，以实现机械解离。使用体积逐渐减小的移液器重复操作，依次使用 25、10 至 5 毫升的移液器。将样品孵育至 37 摄氏度。利用光学显微镜根据悬液中单细胞的数量监测解离情况。使用台盼蓝监测细胞活力。继续孵育，并每五分钟取样一次以检查解离情况。孵育至90%的细胞分离为单细胞为止。当胰腺组织充分解离，表现为胰腺碎片消失且溶液浑浊度增加时，使用酶活性终止液在4°C条件下洗涤两次，每次五分钟，以终止酶促反应。从该步骤开始，将细胞悬液置于冰上保存。将细胞悬液通过70微米尼龙筛网过滤。较小的尼龙网孔尺寸可能会降低细胞活力。在显微镜下检查细胞活力。计数细胞前，用5至10毫升预冷的缓冲洗涤液重悬并洗涤细胞沉淀。若观察到多个红细胞，需在室温下用红细胞裂解缓冲液处理细胞2分钟。若观察到细胞团块，应按照前述方法再次使用胰蛋白酶处理样本。若细胞活力低于80%，应使用磁性激活细胞分选法（MACS）或MACS去死细胞试剂盒配合MACS MS柱分离活细胞。分离的胰腺组织呈现红色，这是由于腺泡细胞表达了tdTomato。在解离的早期阶段，游离细胞数量较少，而细胞团块较多。随后，在避免减少活细胞数量的前提下，获得了大量游离的活细胞。延长孵育时间降低了细胞的存活率。使用荧光激活细胞分选法对 tdTomato 阳性细胞进行估算。温和解离方案支持多种细胞类型的回收，且细胞存活率较高，可进一步对目标细胞类型进行细胞分选。活细胞与死细胞计数采用血细胞计数板进行。冷冻胰腺切片的荧光图像显示了 tdTomato 阳性的腺泡细胞。单细胞 RNA 测序证实，在所有时间点获取的每份切除组织中，均检测到荧光激活细胞分选所识别的全部细胞类型。研究了腺泡细胞中羧肽酶1（carboxypeptidase1）或CPA1的表达，表明与其他细胞类型的转录组污染极少。需要注意的是，较长的孵育时间会降低细胞活力，因此必须定期监测样本，并在显微镜下每隔几分钟观察组织解离情况和细胞活力。该细胞分离方案可用于单细胞RNA测序、细胞培养，或作为类器官培养的起始材料。该技术可用于探索胰腺癌的发展过程，并研究浸润炎症或癌变组织的细胞之间的相互作用。

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癌症研究

胰腺组织解剖以分离活的单细胞

胰岛，也称为朗格汉斯岛，是一类内分泌细胞簇，可产生调节葡萄糖及其他重要生物学功能所需的激素。本方案介绍了一种从小鼠胰腺中分离胰岛的方法：首先通过十二指肠乳头灌注胶原酶，以消化外分泌胰腺组织，再采用简化的密度梯度离心法纯化胰岛。...

通过胶原酶灌注法分离胰岛：一种分离胰岛细胞的酶消化方法

激光显微切割技术能够从微量的实质组织中分离特定细胞。本文描述了一种从手术标本中获取人胰腺胰岛用于转录组学研究的实验方案。该方案可增强人β细胞固有的自发荧光，从而便于其收集。...

改进的人类胰岛手术标本激光显微切割操作方案

一种小鼠胰岛分离及细胞内cAMP测定方法

本文介绍了一种从新生小鼠中分离完整胰岛的实验方案。胰腺经胶原酶部分消化后，进行洗涤和手工挑选。每只新生小鼠胰腺可获得20 -...

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本文介绍一种从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺组织中分离胰腺微环境中细胞的方法，重点在于间充质细胞的分离。该方法可用于分析细胞的基因表达和蛋白质分泌，从而阐明调控胰腺发育、功能及肿瘤发生过程中的外在信号。...

通过流式细胞术分离和分析胰腺间充质细胞

本胰岛分离方案描述了一种新型的胶原酶注射途径，用于消化外分泌组织，并采用简化的梯度步骤从小鼠中纯化胰岛。该方法包括酶消化、梯度分离/纯化以及人工挑选胰岛。成功分离可每只小鼠获得250–350个高质量且功能完整的胰岛。...

一种简单高效的小鼠胰岛分离方案

我们描述了一种从胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离内分泌细胞并进行单细胞RNA测序的方法。该方法可用于分析胰腺内分泌细胞谱系发育、细胞异质性及转录组动态变化。...

小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析

本方案描述了从小鼠完整胰腺中分离内皮细胞的方法。...

小鼠胰腺内皮细胞的分离

本研究建立了一种简化方法，可高效提取小鼠胰腺中的功能性原代胰岛细胞和腺泡细胞，为研究急性胰腺炎诱导糖尿病发病机制中的细胞间通讯提供了有价值的工具。...

一种从小鼠中同时分离原代胰岛和原代胰腺腺泡细胞的简便快速方法

本方案描述了一种标准化的方法，用于Lewis大鼠胰岛的手术获取、酶消化及密度梯度纯化，可高效获得高纯度的胰岛，直接用于移植或后续实验研究。 体外...

采用酶消化法与密度梯度分离法从Lewis大鼠中分离与纯化胰岛组织

学习胰腺组织解离技术，用于从正常胰腺、癌前病变及肿瘤组织中分离活的单细胞。该方法操作简便，可高效获取高活性细胞，助力胰腺癌研究与新治疗靶点发现。

胰腺组织解离以分离有活力的单细胞

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