胰腺组织解剖以分离活的单细胞

所证明的胰腺组织解离方案很简单，并提供了一种在恶性肿瘤过程（包括实体瘤）的不同阶段从胰腺组织中分离活单细胞的工具。恢复完整和活的腺泡细胞是一项重大挑战。该方案可以从正常胰腺、具有癌前病变的胰腺或含有大量基质和免疫细胞的胰腺肿瘤中恢复活的单细胞。

使用该方案解剖人类胰腺肿瘤或发炎的胰腺可以帮助研究这些疾病以寻找新的生物标志物和治疗方法。该方法易于使用，只需最少的练习即可提供所需的结果。该视频将有助于查看协议的小细节。

在开始解剖之前，将所有仪器和设备准备好在冰上。固定安乐死的小鼠后，用70%乙醇喷洒其腹部。用剪刀和镊子在动物的生殖器区域做一个2.5厘米的V形切口，然后向上完全打开腹腔。

将胃定位在小鼠的左侧和胰腺的左侧，胰腺靠近脾脏。使用两个镊子，将胰腺与胃和十二指肠分开，不要撕裂。继续将胰腺与小肠、空肠和回肠分开。

将胰腺向右侧移动，用镊子分离胰腺与胸腔之间的剩余连接，使胰腺和附着的脾脏完全分离。小心地取出不含肠系膜脂肪或其他邻近组织的胰腺，并将其摊开在冰上的培养皿中进行检查。按照文中提到的组合物，制备解离缓冲液1和2，提前洗涤缓冲液和酶活性终止液。

将胰腺置于冰上的50毫升管中，并用10%胎牛血清（FBS）和汉克平衡盐溶液（HBSS）冲洗。脂肪会漂浮，胰腺会下沉。这是一种可视化和快速去除仍附着在胰腺上的污染性白色脂肪组织的简单方法。

接下来，将小鼠胰腺组织转移并保存在含有5毫升HBSS的无菌培养皿中，直至切割。使用Noyes剪刀和手术刀，将胰腺切成一到三立方毫米的小块。将组织转移到离心管中后，以 350G 和 4 摄氏度离心 5 分钟。

吸出并弃去上清液以除去细胞碎片和血细胞。在37摄氏度下搅拌，将碎片重悬于含有0.02%胰蛋白酶-C和0.05%EDTA的解离缓冲液1中10分钟。立即用 10% FBS 和 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 洗涤，并在 350G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。

通过将沉淀重悬于10毫升洗涤缓冲液中再次洗涤，并像以前一样在下一个解离步骤之前离心5分钟。将胰腺在解离缓冲液 2 中在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，以每分钟 180 转的速度搅拌。15分钟后，使用无菌血清移液管上下剧烈移液胰腺碎片10次，进行机械解离。

重复使用尺寸递减的移液器，从 25、10 到 5 毫升。孵育样品，使其达到 37 摄氏度。使用光学显微镜根据悬浮液中单细胞的量监测解离。

使用台盼蓝监测细胞活力。继续孵育，每五分钟取样一次检查解离。孵育至90%的细胞分离成单个细胞。

胰腺组织充分解离后，表现为胰腺碎片消失和溶液浑浊度增加，用酶活性终止液在4摄氏度下洗涤5分钟两次，停止酶促反应。从这一步开始，将细胞悬浮液保持在冰上。将细胞悬液通过70微米尼龙网。

较小的尼龙网尺寸可能会降低细胞活力。在显微镜下检查细胞活力。在计数细胞之前，重悬并用 5 至 10 毫升冰冷的缓冲洗涤溶液洗涤沉淀。

如果观察到几个红细胞，则在室温下用红细胞裂解缓冲液处理细胞两分钟。在观察到团块的情况下，如前所述，应再次用胰蛋白酶处理样品。如果活力低于 80%，则应使用磁激活细胞分选或带有 MACS MS 色谱柱的 MACS 死细胞去除试剂盒分离活细胞。

分离的胰腺组织的红色是由于腺泡细胞中tdTomato的表达所致。在解离的早期阶段，分离的细胞数量很少，团块数量很大。后来，在避免减少活细胞数量的同时获得分离的活细胞。

较长的孵育时间降低了细胞的活力。使用荧光激活的细胞分选估计 tdTomato 阳性细胞。温和解离方案支持多种细胞类型的回收，具有高活力，可以对所需细胞类型进行细胞分选。

使用血细胞计数器进行活细胞到死细胞计数。冷冻胰腺切片的荧光图像显示tdTomato阳性腺泡细胞。单细胞RNA测序证实了在所有时间点的每个切除组织中检测到荧光激活细胞分选中检测到的所有细胞类型。

研究了腺泡细胞中羧肽酶1或CPA1的表达，表明对其他细胞类型转录组的污染最小。需要注意的是，较长的孵育时间会降低细胞的活力，因此在显微镜下每隔几分钟监测样品并观察组织解离和细胞活力非常重要。细胞分离方案可用于单细胞RNA测序、培养细胞或作为类器官的起始原料。

该技术可以探索胰腺癌如何发展，并研究浸润发炎或癌组织细胞之间的相互作用。