利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

本方案介绍了一种利用牛单核细胞来源的树突状细胞进行疫苗免疫原性检测的功能性体外实验方法，可在开展体内研究之前评估疫苗效果，从而填补了家畜疫苗学领域的一项现有空白。该方法涉及树突状细胞的制备与应用。

作为功能最强的抗原提呈细胞，树突状细胞已成为研究包括疫苗效力在内的细胞内免疫机制的关键研究对象。该检测方法可作为疫苗候选物筛选的工具、疫苗生产过程中的质量控制手段，以及抗原和佐剂筛选的选择依据。本次实验操作由动物生产与健康实验室的科学家 Richard Kangethe 进行示范。

首先将从小牛颈静脉穿刺获取的血液与含肝素的真空采血管颠倒混匀。然后将20毫升抗凝血液转移至无菌的50毫升离心管中，并加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释。用移液器吸取15毫升淋巴细胞分离液加入另一无菌50毫升离心管中，并将该离心管倾斜至45度角位置。

使用25毫升移液管将30毫升血液PBS培养基小心地叠加在淋巴细胞分离液上方，然后缓慢将离心管恢复至垂直位置，再进行离心。接着用巴斯德移液管收集浅白色的外周血单个核细胞（PBMC）层，并将其转移至一个新的50毫升离心管中。每次用40毫升PBS洗涤收集的PBMC，共洗涤两次，并充分混匀。

离心后，将沉淀重悬于15毫升氯化铵钾缓冲液（ACK缓冲液）中。室温孵育10至15分钟后，加入最多40毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并以最大加速度和减速度离心。将沉淀重悬于10毫升完全培养基中。

然后每1000万个细胞加入5 µL CD14 MicroBead缓冲液，使用移液器充分混匀。进行流式细胞术分析时，向PBMCs中加入10 µL CD14异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）或FITC标记抗体，在4至8 °C孵育15分钟，随后进行流式细胞术检测。向未染色的PBMCs中加入1 mL fax缓冲液，在500 ×g、4 °C条件下离心7分钟。

然后，每1亿个细胞用500微升脱气的fax缓冲液重悬沉淀。接下来，将免疫磁性细胞分离柱插入分离器中，并在柱出口下方放置一个50毫升收集管，用于收集流穿液。用1毫升脱气的fax缓冲液洗涤柱子后，将已使用的15毫升管更换为新的收集管。

每次用500微升缓冲液吸取一亿个细胞，使细胞悬液通过柱子。然后每次用3毫升脱气的fax缓冲液冲洗柱子，共冲洗三次。收集穿流液后，将最先洗脱出的初始淋巴细胞组分标记为CD14阴性细胞组分。

从分离装置上取下柱子，并在柱子下方放置一个新的无菌15毫升离心管以收集流出液。向柱子中加入5毫升fax缓冲液，并立即使用推杆将其推过柱子。收集并标记第二次流出液或初始单核细胞组分，作为CD14阳性细胞组分。

将完全培养基加入收获的CD14阳性单核细胞中，调整细胞密度至每毫升含100万个细胞。随后，将1毫升细胞悬液加入无菌24孔板的每个孔中，再向每孔补充40微升试剂盒提供的细胞因子混合液。第2天，用移液器将每孔中一半的培养物转移至各自的1.5毫升离心管中。

将1.5毫升离心管在500g条件下离心7分钟后，弃去上清液，并将沉淀重悬于500微升新鲜的完全培养基中。取500微升重悬的细胞悬液转移回相应的孔中，使每孔终体积达到1毫升。每孔加入20微升细胞因子混合物进行富集。

为制备抗原致敏的MoDCs，向24孔板中每毫升初始MoDC培养物加入一微升狂犬病病毒疫苗或RV悬液，在5%二氧化碳、37摄氏度条件下孵育48小时。第七天，将含有抗原致敏MoDCs的24孔板置于冰上10分钟，随后每孔加入一毫升预冷的PBS，充分混匀。将悬液转移至15毫升离心管中。

用两毫升冰冻的PBS洗涤各孔。收集每孔中的残留细胞，并将洗涤后的液体转移至相应的离心管中。在500g条件下离心细胞悬液7分钟。

弃去上清液后，将抗原刺激的 MoDCs 细胞沉淀重悬于完全培养基中，调整终浓度为每毫升 100,000 个细胞。进行 MoDC-淋巴细胞共培养时，在抗原刺激后的第七天，向无菌 24 孔板的各孔中加入 1 毫升未致敏淋巴细胞悬液以及 1 毫升抗原刺激或未刺激抗原的 MoDC 悬液。孵育两天后，向每孔补充 20 纳克/毫升重组白细胞介素-2，并继续孵育 120 小时。

第14天，取1毫升共培养物转移至无菌的1.5毫升离心管中，并对离心管进行离心。随后用1毫升抗原刺激或未刺激的MoDCs重悬细胞沉淀。充分混匀后，将细胞悬液转移至相应的孔中。

在对PBMCs、初始淋巴细胞和单核细胞进行细胞表面染色后，使用移液器将一毫升细胞悬液转移至无菌的1.5毫升离心管中，并在500g条件下离心10分钟。随后将沉淀物重悬于一毫升PBS中，并转移至15毫升离心管中。同时，使用一毫升PBS收集残留细胞及相应的离心管。

然后向含有细胞的15毫升离心管中加入10毫升PBS，通过移液混匀。在850×g条件下离心7分钟，弃去上清液，并用倾倒上清液后残留的少量液体小心重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移至V型底96孔板中，并密封各孔以防止溢出。

染色完成后，进行流式细胞仪分析。根据实时预览结果，调整荧光阈值（包括电压和增益）以及细胞大小，最终在目标细胞群周围绘制门控，同时排除任何细胞碎片。CD14细胞染色和流式细胞术结果显示，初始单核细胞组分包含98%的CD14阳性单核细胞，并具有抗原摄取功能。

通过检测MHC II类分子以及共刺激分子CD86和CD40细胞表面标志物的表达，对初始状态的MoDCs进行表型鉴定，证实其具有树突状细胞或类似树突状细胞的表型。在第9天进行MoDC与淋巴细胞共培养时，观察到经RV脉冲处理的MoDCs出现形态学改变，表现为树突样突起的延伸。与未经脉冲处理的MoDC淋巴细胞培养相比，在第16天，经脉冲处理的MoDC淋巴细胞共培养体系中，CD4阳性及CD8阳性T细胞上活化标志物Ki67和CD25的表达显著上调，表明淋巴细胞增殖明显增强。

与非特异性组相比，经RV脉冲的成熟MoDC共培养体系中的CD8阳性T细胞Ki67表达上调了八倍。同一共培养体系中的CD4阳性细胞相比对照组Ki67表达增加了七倍，表明经RV致敏的MoDC能够在体外条件下向初始淋巴细胞呈递RV抗原并激活这些细胞。以GAPDH作为校准基因的共培养体系qPCR定量结果显示，所有共培养体系中干扰素γ的表达量增加了30%以上，Ki67的表达量增加了5%以上。

与非特异性处理组相比，在RV脉冲MoDC淋巴细胞共培养中观察到分泌的干扰素γ浓度显著升高。进行分层操作时应极其缓慢且小心，确保将血液轻柔地铺在淋巴细胞分离液上方。收集PBMC时需格外小心，避免从其他层中收集过多物质。

在此步骤之后，可应用流式细胞术、ELISA 和定量 PCR 等其他方法来评估免疫标志物的激活情况。