Name: 使用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 了解利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性的体外功能检测方法。该技术可筛选疫苗候选物并评估佐剂效果，为兽医疫苗研发提供质量控制工具。

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我们感谢奥地利AGES机构的Eveline Wodak博士和Angelika Loistch博士在动物健康状况评估及提供蓝舌病病毒（BTV）方面给予的支持，感谢Bernhard Reinelt博士提供牛血，同时感谢国际原子能机构（IAEA）的Bharani Settypalli博士和William Dundon博士分别在实时PCR实验设计和语言润色方面提供的宝贵建议。

作者声明无利益冲突。

本研究展示了一种标准化的 体外 生成和表型分析牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）及其在评估商用疫苗（如RV疫苗）免疫原性中的后续应用方法。牛MoDCs可作为筛选针对牛病的潜在疫苗抗原的工具，并基于免疫应答在进入临床试验前预测其潜在的临床影响 在体 动物实验。所生成的MoDCs根据其形态学、表型和功能特征进行鉴定。我们证明了来源于牛CD14的MoDCs+ 单核细胞表现出树突状细胞的特征，例如伸出的树突样突起、表达MHC II等参与抗原呈递的细胞表面标志物、表达MoDCs上的共刺激分子（如CD40和CD86）、内吞活性，以及激活初始淋巴细胞的能力。
本实验所用的细胞培养基（DMEM 和 RPMI）广泛用于细胞分化与培养，其中 RPMI 更常用于单核细胞的分化36。在 RPMI 中添加胎牛血清（FBS）或马血清（HS）均不影响单核细胞的分化过程37。添加重组 GM-CSF 和 IL-4 可创造一种促炎环境，从而启动单核细胞分化，该...

兽医疫苗接种是畜牧养殖与动物健康的关键环节，通过预防影响全球畜牧业的各类疾病，有助于提升食品安全和动物福利水平1有效的 体外 评估潜在疫苗候选物免疫原性的方法将有助于加速&#160;疫苗研发与生产的过程。因此，有必要基于创新方法拓展免疫检测领域 体外 研究，因为这有助于揭示与免疫接种和病原体感染相关的免疫过程的复杂性。目前， 体内 动物免疫与攻毒试验需要进行周期性取样（例如血液和脾脏），用于评估候选疫苗和佐剂的免疫原性。这类检测成本高昂、耗时较长，且存在伦理问题，因为在大多数情况下，试验结束时需对动物实施安乐死。
作为替代方案 体内 检测外周血单个核细胞（PBMCs）已被用于评估疫苗诱导的免疫应答 体外2外周血单个核细胞（PBMCs）是一类异质性细胞群体，由70%-90%的淋巴细胞、10%-20%的单核细胞以及少量树突状细胞（DCs，1%-2%）组成。3外周血单个核细胞（PBMCs）含有抗原提呈细胞（APCs），如B细胞、单核细胞和树突状细胞（DCs），这些细胞持续在机体内巡逻，寻找感染或组织损伤的迹象。局部分泌的趋化因子通过与细胞表面受体结合，促进APCs向这些部位的募集和活化。对于单核细胞而言，趋化因子可引导其分化为树突状细胞或巨噬细胞4一旦树突状细胞（DC）遇到并捕获病原体，便会迁移至次级淋巴器官，在此通过主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类表面蛋白将加工后的病原体肽抗原呈递给CD8+ T细胞或CD4+ T细胞，从而触发免疫反应5,6.
树突状细胞在协调针对多种病原体的保护性免疫反应中发挥关键作用，这使其成为研究细胞内免疫机制的一个重要目标，尤其是在设计针对感染性病原体的疫苗和佐剂时。7由于从外周血单个核细胞（PBMCs）中获得的树突状细胞（DCs）比例较小（1%-2%），因此通常采用单核细胞来诱导生成树突状细胞 体外8这些单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）最初被开发作为癌症免疫治疗的一种潜在治疗策略9近年来，MoDCs 已被用于疫苗研究10,11,12，且经典单核细胞是用于MoDC制备的主要亚型（89%）13. 产物的生成&#160;的 体外MoDCs 此前已通过联合使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其他细胞因子（如白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）或IL-13）实现14,15,16.
一项实验的成功与否取决于多个关键因素，包括实验设计的严谨性、操作步骤的精确执行、试剂与仪器的质量，以及数据记录与分析的准确性。在科学研究中，每一个细节都可能影响最终结果的可靠性与可重复性。因此，研究人员必须严格遵循标准化操作流程，确保实验条件的一致性，并对潜在的干扰因素进行有效控制。此外，良好的实验记录习惯和透明的数据报告也是确保研究可信度的重要环节。通过系统化的质量控制与同行验证，可以进一步提升实验结果的科学价值与应用前景。 体外 MoDC 实验依赖于抗原刺激后成熟的 MoDC 调控免疫应答强度和类型的能力，该免疫应答特异性地针对所识别的抗原类型17. MoDCs 识别并呈递的病原体类型决定了 CD4+ 辅助性T细胞（Th细胞）可分化为Th1、Th2或Th17效应细胞，其特征在于产生针对特定病原体的分泌型细胞因子谱。Th1应答针对胞内病原体，分泌干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-β（TNF-β），介导依赖吞噬细胞的免疫保护。Th2应答针对寄生虫感染，以分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13为特征，启动不依赖吞噬细胞的体液免疫保护。Th17应答通过分泌IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22和TNF-α，介导针对胞外细菌和真菌感染的中性粒细胞依赖性免疫保护。18,19,20,21根据以往研究，有观点指出并非所有病原体都符合预期的细胞因子谱型。例如，皮肤来源的单核细胞衍生树突状细胞（MoDCs）在应对某些刺激时 利什曼原虫 寄生虫感染，刺激CD4细胞分泌IFN-γ+ T细胞和CD8+ T细胞，从而诱导产生具有保护作用的促炎性Th1反应22.
研究还表明，在用Salmonella脂多糖（LPS）致敏的鸡源MoDCs中，可通过激活Th1和Th2反应，对Salmonella typhimurium产生可变的免疫应答；而Salmonella gallinarum仅诱导Th2反应，这可能解释了后者对MoDC清除作用具有更高抵抗力的原因&#160;23。在犬源和人源MoDCs中均已有报道MoDCs对Brucella canis (B. canis)的激活作用，表明这可能代表一种人畜共患感染机制24。经B. canis致敏的人源MoDCs可诱导强烈的Th1反应，从而赋予对严重感染的抵抗力；而犬源MoDCs则诱导以Th17反应为主、Th1反应减弱的免疫应答，进而导致慢性感染的建立25。与单独的非偶联口蹄疫病毒（FMDV）相比，牛源MoDCs对与免疫球蛋白G（IgG）偶联的FMDV表现出更强的亲和力，因为MoDCs会对前者形成病毒-抗体复合物10。综上所述，这些研究揭示了MoDCs如何被用于分析病原体感染过程中免疫应答的复杂性。适应性免疫应答可通过量化与淋巴细胞增殖相关的特异性标志物进行评估。Ki-67是一种仅在分裂细胞中检测到的胞内蛋白，被视为增殖研究的可靠标志物26；同样，T细胞在活化晚期表面表达的CD25也对应于淋巴细胞增殖27,28。
本研究展示了一种标准化的方法 体外 牛MoDCs的制备及其在后续实验中的应用 体外 用于检测疫苗免疫原性的免疫学检测方法。采用一种市售的狂犬病疫苗（RV）来验证该检测方法的有效性。通过流式细胞术、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附试验检测T淋巴细胞的活化与增殖情况。&#160;通过分析公认明确的细胞活化标志物（如Ki-67和CD25）以及IFN-γ的分泌，进行酶联免疫吸附测定（ELISA）28,29,30,31在MoDC检测过程中，未进行任何动物或人体实验。

<table><tbody><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td>用于裂解收获的PBMC组分中残留红细胞的氯化铵-氯化钾缓冲液</td></tr><tr><td>BD Vacutainer肝素管</td><td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td><td>366480</td><td>10 mL，添加钠肝素158 USP单位，玻璃管，尺寸16 x 100 mm</td></tr><tr><td>牛树突状细胞生长试剂盒</td><td>Bio-Rad, UK</td><td>PBP015KZZ</td><td>由重组牛IL-4和GM-CSF组成的细胞因子混合物</td></tr><tr><td>牛IFN-&amp;gamma; ELISA试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA5638KZZ</td><td>用于检测培养上清液中IFN-&amp;gamma;表达的试剂盒</td></tr><tr><td>CD14抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2678F</td><td>小鼠抗牛CD14单克隆抗体，克隆号CC-G33，同型IgG1</td></tr><tr><td>CD25抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2430PE</td><td>小鼠抗牛CD25单克隆抗体，克隆号IL-A11，同型IgG1</td></tr><tr><td>CD4抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1653A647</td><td>小鼠抗牛CD4单克隆抗体，克隆号CC8，同型IgG2a</td></tr><tr><td>CD40抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2431F</td><td>小鼠抗牛CD40单克隆抗体，克隆号IL-A156，同型IgG1</td></tr><tr><td>CD8抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA837F</td><td>小鼠抗牛CD8单克隆抗体，克隆号CC63，同型IgG2a</td></tr><tr><td>CD86抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2437PE</td><td>小鼠抗牛CD86单克隆抗体，克隆号IL-A190，同型IgG1</td></tr><tr><td>CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>热循环PCR仪</td></tr><tr><td>Corning离心管</td><td>Falcon Corning&amp;nbsp;</td><td>352096 &amp; 352070</td><td>15 mL和50 mL，高透明度聚丙烯锥底，带刻度，无菌，带密封螺帽，Falcon管</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Plus</td><td>BD Bio Sciences</td><td>555028</td><td>固定/透化试剂盒，含BD GolgiPlug，用于流式细胞术细胞染色</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1009832500</td><td>分析纯绝对乙醇，符合EMSURE&amp;nbsp;ACS、ISO、Reag. Ph Eur标准</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td>经鉴定合格，热灭活</td></tr><tr><td>Ficoll Plaque PLUS</td><td>GE Health care Life Sciences, USA</td><td>341691</td><td>淋巴细胞分离介质</td></tr><tr><td>FlowClean清洗剂</td><td>Beckman Coulter, Life Sciences</td><td>A64669</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td><td>-</td><td>流式细胞仪直方图分析软件</td></tr><tr><td>FlowTubes / FACS&amp;nbsp;（荧光激活单细胞分选）管</td><td>Falcon Corning&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td>5 mL，无菌，圆底聚苯乙烯试管，带滤网 snap cap，用于流式细胞术分析</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素-葡聚糖</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>60842-46-8</td><td>FITC-葡聚糖分子量</td></tr><tr><td>Gallios流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>-</td><td>流式细胞仪设备</td></tr><tr><td>硬壳96孔PCR板</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>96孔，低轮廓，薄壁，带裙边，白色/透明</td></tr><tr><td>人CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Bioteck, Germany</td><td>130-050-201</td><td>2 mL微珠，偶联至抗人CD14单克隆抗体（IgG2a同型），用于从PBMC中筛选牛单核细胞</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman Coulter, Germany</td><td>-</td><td>流式细胞术多色数据分析软件</td></tr><tr><td>MACS柱</td><td>Miltenyi Bioteck, Germany</td><td>130-042-401</td><td>磁性激活细胞分选或免疫磁性细胞分离柱，基于细胞表面抗原分离不同CD14细胞群体</td></tr><tr><td>MHC II类DQ DR多态性抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2228F</td><td>小鼠抗羊MHC II类DQ DR多态性抗体：FITC标记，克隆号49.1，同型IgG2a，与牛交叉反应</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4325</td><td>1.5 mL，锥底，带刻度，无菌管</td></tr><tr><td>Microsoft PowerPoint</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>实验设计的图形化展示工具</td></tr><tr><td>小鼠IgG1阴性对照：CD14、CD40抗体用FITC标记</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928F</td><td>CD14和CD40单克隆抗体的同型对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠IgG1阴性对照：CD86抗体用PE标记</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>CD86单克隆抗体的同型对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠IgG1阴性对照：CD25抗体用RPE标记</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>CD25单克隆抗体的同型对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠IgG2a阴性对照：MHC II类抗体用FITC标记</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA929F</td><td>MHC II类单克隆抗体的同型对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nobivac狂犬病疫苗</td><td>MSD Animal Health, UK</td><td>-</td><td>每毫升细胞培养物中含1 &amp;micro;L灭活疫苗，狂犬病毒株含量&gt; 2 I.U./mL</td></tr><tr><td>光学封膜</td><td>Bi0-Rad</td><td>TCS0803</td><td>0.2 mL平头PCR管8联管盖，光学透明，超清晰，适用于qPCR仪</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>pH 7.4，1x浓度</td></tr><tr><td>Prism - GraphPad 5软件&amp;nbsp;</td><td>Dotmatics</td><td>-</td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>纯化抗人Ki-67抗体</td><td>Biolegend, USA</td><td>350501</td><td>单克隆抗体，与牛交叉反应，克隆号ki-67</td></tr><tr><td>纯化小鼠IgG1 k同型对照抗体</td><td>Biolegend</td><td>400101</td><td>Ki-67单克隆抗体的同型对照</td></tr><tr><td>READIDROP碘化丙啶</td><td>BD Bio Sciences</td><td>1351101</td><td>用于流式细胞术的活/死细胞标记物，胺反应性染料</td></tr><tr><td>重组人IL-2蛋白</td><td>R&amp;D System, USA</td><td>202-IL-010/CF</td><td>白细胞介素-2，20 ng/mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>用于总RNA提取的试剂盒；RLT缓冲液 = 裂解缓冲液；RW1缓冲液 = 含强胍盐的洗涤缓冲液；RDD缓冲液 = DNase缓冲液；RPE缓冲液 = 温和洗涤缓冲液；RNaseOUT = RNase抑制剂</td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的细胞培养基</td></tr><tr><td>SMART-servier医学插图&amp;nbsp;</td><td>Les Laboratories Servier</td><td>-</td><td>根据知识共享署名3.0未本地化许可协议授权使用</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5270</td><td>2x qPCR预混液，含dNTPs、Sso7d融合聚合酶、MgCl2、SYBR Green I supermix（预混液）、ROX归一化染料</td></tr><tr><td>SuperScript III第一链合成系统</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td>cDNA合成试剂盒</td></tr><tr><td>组织培养测试板24孔</td><td>TPP, 瑞士</td><td>92024</td><td>24孔板，辐射灭菌，表面促生长处理，容积3.18 mL</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>0.4%，100 mL，用于评估细胞活力的染料</td></tr><tr><td>UltraPure无DNase/RNase蒸馏水</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>经0.1 &amp;micro;m膜过滤的蒸馏水</td></tr><tr><td>VACUETTE肝素采血管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206067</td><td>VACUETTE肝素采血管顶部为绿色，内壁喷涂干燥的锂、钠或铵肝素，用于临床化学、免疫学和血清学检测。抗凝剂肝素可激活抗凝血酶，阻断凝血级联反应，从而获得全血或血浆样本。</td></tr><tr><td>水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W3500-1L</td><td>经无菌过滤，适用于细胞培养的生物试剂级水</td></tr></tbody></table>

利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

树突状细胞（DCs）是免疫系统中最具效力的抗原呈递细胞（APCs）。它们在机体内巡逻，搜寻病原体，并通过连接先天免疫与适应性免疫应答，在免疫系统中发挥独特作用。这些细胞能够吞噬并捕获抗原，随后将抗原呈递给效应免疫细胞，从而触发多种免疫应答。本文展示了一种标准化的方法 体外 从牛外周血单个核细胞（PBMCs）分离牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）的制备及其在评估疫苗免疫原性中的应用
采用磁珠分选法从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离CD14+单核细胞，并通过在完全培养基中添加白细胞介素（IL）-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导CD14+单核细胞分化为初始型MoDCs。通过检测主要组织相容性复合物II类分子（MHC II）、CD86和CD40等细胞表面标志物的表达，确认未成熟MoDCs的成功生成。使用市售狂犬病疫苗刺激未成熟MoDCs，随后将其与初始型淋巴细胞共培养。
抗原刺激的 MoDCs 与淋巴细胞共培养物的流式细胞术分析显示，通过 Ki-67、CD25、CD4 和 CD8 标记物的表达，T 淋巴细胞增殖被激活。利用定量 PCR 分析 IFN-γ 和 Ki-67 的 mRNA 表达水平，结果表明 MoDCs 在该 in vitro 共培养体系中可诱导淋巴细胞产生抗原特异性启动。此外，通过 ELISA 检测 IFN-γ 的分泌水平，在狂犬病疫苗刺激的 MoDC-淋巴细胞共培养组中显著高于无抗原刺激的 MoDC-淋巴细胞共培养组（**p &#60; 0.01）。这些结果验证了该 in vitro MoDC 检测方法在评估疫苗免疫原性方面的有效性，表明该方法可用于在开展 in vivo 试验前筛选潜在的牛用候选疫苗，同时也适用于市售疫苗的免疫原性评估。

本方法描述了 体外 用于在开展实验前评估候选疫苗抗原的牛单核细胞来源树突状细胞的制备 体内 研究。 图1 展示了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）生成的实验方案及该MoDCs的应用 体外 检测。利用基于磁珠的细胞分选技术，可收集约2600万个CD14+ 从50 mL牛血中分离获得的PBMCs中提取的心肌细胞，洗脱后的细胞组分不含CD14+ 单核细胞富含淋巴细胞，被用作初始CD4的来源+ 和 CD8+ T 细胞（CD14− 淋巴细胞组分
经CD14细胞染色和流式细胞术分析显示，初始单核细胞组分中98%为CD14+单核细胞（图2A、B）。将纯化的初始单核细胞在含3%细胞因子混合物（GM-CSF和IL-4）的条件下培养，并继续孵育5天后，可分化为树突...

该方法描述了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）的制备及其应用 体外 在潜在兽用疫苗牛体开发过程中对抗原候选物的评估

树突状细胞（DCs）是免疫系统中功能最强的抗原呈递细胞（APCs）。它们在机体内不断巡逻，寻找病原体并……

本方案介绍了一种利用牛单核细胞来源的树突状细胞进行疫苗免疫原性检测的功能性体外实验方法，可在开展体内研究之前评估疫苗效果，从而填补了家畜疫苗学领域的一项现有空白。该方法涉及树突状细胞的制备与应用。作为功能最强的抗原提呈细胞，树突状细胞已成为研究包括疫苗效力在内的细胞内免疫机制的关键研究对象。该检测方法可作为疫苗候选物筛选的工具、疫苗生产过程中的质量控制手段，以及抗原和佐剂筛选的选择依据。本次实验操作由动物生产与健康实验室的科学家 Richard Kangethe 进行示范。首先将从小牛颈静脉穿刺获取的血液与含肝素的真空采血管颠倒混匀。然后将20毫升抗凝血液转移至无菌的50毫升离心管中，并加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释。用移液器吸取15毫升淋巴细胞分离液加入另一无菌50毫升离心管中，并将该离心管倾斜至45度角位置。使用25毫升移液管将30毫升血液PBS培养基小心地叠加在淋巴细胞分离液上方，然后缓慢将离心管恢复至垂直位置，再进行离心。接着用巴斯德移液管收集浅白色的外周血单个核细胞（PBMC）层，并将其转移至一个新的50毫升离心管中。每次用40毫升PBS洗涤收集的PBMC，共洗涤两次，并充分混匀。离心后，将沉淀重悬于15毫升氯化铵钾缓冲液（ACK缓冲液）中。室温孵育10至15分钟后，加入最多40毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并以最大加速度和减速度离心。将沉淀重悬于10毫升完全培养基中。然后每1000万个细胞加入5 µL CD14 MicroBead缓冲液，使用移液器充分混匀。进行流式细胞术分析时，向PBMCs中加入10 µL CD14异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）或FITC标记抗体，在4至8 °C孵育15分钟，随后进行流式细胞术检测。向未染色的PBMCs中加入1 mL fax缓冲液，在500 ×g、4 °C条件下离心7分钟。然后，每1亿个细胞用500微升脱气的fax缓冲液重悬沉淀。接下来，将免疫磁性细胞分离柱插入分离器中，并在柱出口下方放置一个50毫升收集管，用于收集流穿液。用1毫升脱气的fax缓冲液洗涤柱子后，将已使用的15毫升管更换为新的收集管。每次用500微升缓冲液吸取一亿个细胞，使细胞悬液通过柱子。然后每次用3毫升脱气的fax缓冲液冲洗柱子，共冲洗三次。收集穿流液后，将最先洗脱出的初始淋巴细胞组分标记为CD14阴性细胞组分。从分离装置上取下柱子，并在柱子下方放置一个新的无菌15毫升离心管以收集流出液。向柱子中加入5毫升fax缓冲液，并立即使用推杆将其推过柱子。收集并标记第二次流出液或初始单核细胞组分，作为CD14阳性细胞组分。将完全培养基加入收获的CD14阳性单核细胞中，调整细胞密度至每毫升含100万个细胞。随后，将1毫升细胞悬液加入无菌24孔板的每个孔中，再向每孔补充40微升试剂盒提供的细胞因子混合液。第2天，用移液器将每孔中一半的培养物转移至各自的1.5毫升离心管中。将1.5毫升离心管在500g条件下离心7分钟后，弃去上清液，并将沉淀重悬于500微升新鲜的完全培养基中。取500微升重悬的细胞悬液转移回相应的孔中，使每孔终体积达到1毫升。每孔加入20微升细胞因子混合物进行富集。为制备抗原致敏的MoDCs，向24孔板中每毫升初始MoDC培养物加入一微升狂犬病病毒疫苗或RV悬液，在5%二氧化碳、37摄氏度条件下孵育48小时。第七天，将含有抗原致敏MoDCs的24孔板置于冰上10分钟，随后每孔加入一毫升预冷的PBS，充分混匀。将悬液转移至15毫升离心管中。用两毫升冰冻的PBS洗涤各孔。收集每孔中的残留细胞，并将洗涤后的液体转移至相应的离心管中。在500g条件下离心细胞悬液7分钟。弃去上清液后，将抗原刺激的 MoDCs 细胞沉淀重悬于完全培养基中，调整终浓度为每毫升 100,000 个细胞。进行 MoDC-淋巴细胞共培养时，在抗原刺激后的第七天，向无菌 24 孔板的各孔中加入 1 毫升未致敏淋巴细胞悬液以及 1 毫升抗原刺激或未刺激抗原的 MoDC 悬液。孵育两天后，向每孔补充 20 纳克/毫升重组白细胞介素-2，并继续孵育 120 小时。第14天，取1毫升共培养物转移至无菌的1.5毫升离心管中，并对离心管进行离心。随后用1毫升抗原刺激或未刺激的MoDCs重悬细胞沉淀。充分混匀后，将细胞悬液转移至相应的孔中。在对PBMCs、初始淋巴细胞和单核细胞进行细胞表面染色后，使用移液器将一毫升细胞悬液转移至无菌的1.5毫升离心管中，并在500g条件下离心10分钟。随后将沉淀物重悬于一毫升PBS中，并转移至15毫升离心管中。同时，使用一毫升PBS收集残留细胞及相应的离心管。然后向含有细胞的15毫升离心管中加入10毫升PBS，通过移液混匀。在850×g条件下离心7分钟，弃去上清液，并用倾倒上清液后残留的少量液体小心重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移至V型底96孔板中，并密封各孔以防止溢出。染色完成后，进行流式细胞仪分析。根据实时预览结果，调整荧光阈值（包括电压和增益）以及细胞大小，最终在目标细胞群周围绘制门控，同时排除任何细胞碎片。CD14细胞染色和流式细胞术结果显示，初始单核细胞组分包含98%的CD14阳性单核细胞，并具有抗原摄取功能。通过检测MHC II类分子以及共刺激分子CD86和CD40细胞表面标志物的表达，对初始状态的MoDCs进行表型鉴定，证实其具有树突状细胞或类似树突状细胞的表型。在第9天进行MoDC与淋巴细胞共培养时，观察到经RV脉冲处理的MoDCs出现形态学改变，表现为树突样突起的延伸。与未经脉冲处理的MoDC淋巴细胞培养相比，在第16天，经脉冲处理的MoDC淋巴细胞共培养体系中，CD4阳性及CD8阳性T细胞上活化标志物Ki67和CD25的表达显著上调，表明淋巴细胞增殖明显增强。与非特异性组相比，经RV脉冲的成熟MoDC共培养体系中的CD8阳性T细胞Ki67表达上调了八倍。同一共培养体系中的CD4阳性细胞相比对照组Ki67表达增加了七倍，表明经RV致敏的MoDC能够在体外条件下向初始淋巴细胞呈递RV抗原并激活这些细胞。以GAPDH作为校准基因的共培养体系qPCR定量结果显示，所有共培养体系中干扰素γ的表达量增加了30%以上，Ki67的表达量增加了5%以上。与非特异性处理组相比，在RV脉冲MoDC淋巴细胞共培养中观察到分泌的干扰素γ浓度显著升高。进行分层操作时应极其缓慢且小心，确保将血液轻柔地铺在淋巴细胞分离液上方。收集PBMC时需格外小心，避免从其他层中收集过多物质。在此步骤之后，可应用流式细胞术、ELISA 和定量 PCR 等其他方法来评估免疫标志物的激活情况。

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免疫学与感染

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基于疫苗脉冲树突状细胞的体外诱导淋巴细胞增殖实验方法

本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。...

用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

长期培养的γ干扰素酶联免疫斑点试验用于评估中枢记忆反应，并与保护性抗分枝杆菌疫苗反应相关。在该试验中，外周血单个核细胞经分枝杆菌抗原和白细胞介素-2刺激培养14天，以促进中枢记忆T细胞的分化与扩增。...

应用长期培养的干扰素-γ酶联免疫斑点试验评估牛效应与记忆T细胞应答

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

介绍了一种在细菌表面快速展示抗原的新技术，该技术涉及表面生物素化，随后使目标蛋白与单体亲和素融合后与细菌结合。通过在卡介苗（BCG）表面加载选定的抗原，可有效增强其免疫原性，表明表面修饰有望替代传统的基因工程方法。...

利用亲和素-生物素系统通过非遗传性表面修饰在卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）疫苗中表达外源性抗原

单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）能够感知微量的危险相关分子，因此极易被启动。本文提供了从血液和肿瘤中分离MoDC并利用免疫复合物对其进行激活的详细方案，同时强调了应考虑的关键注意事项，以避免其过早激活。...

小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。...

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

在给予免疫刺激性纳米材料处理后，描述了后续提取淋巴组织以检测淋巴样树突状细胞活化的实验步骤。...

免疫刺激剂评估：淋巴组织提取及依赖注射途径的树突状细胞激活

我们描述了一种将模型抗原卵清蛋白化学偶联至内吞作用受体特异性抗体的方案，用于体内树突状细胞靶向。该方案包括抗体的纯化、抗原的化学偶联、偶联物的纯化以及偶联效率的验证。...

化学偶联靶向DEC-205的纯化抗体与全长蛋白以靶向小鼠树突状细胞 体外 和 在体 内

本文介绍了一种独特的综合性方案，可通过唾液酸酶处理，从分离的外周血单个核细胞（PBMCs）制备去唾液酸化的人单核细胞来源树突状细胞（mo-DCs）。此外，还描述了对mo-DCs进行表型和功能特征分析的方法，并评估唾液酸酶处理如何提高mo-DCs成熟水平的实验流程。...

生成具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源树突状细胞

我们描述了一种评估药物制剂能否将未经处理的单核细胞来源的树突状细胞转化为耐受性树突状细胞的方法 体外...

一种简单高效的人CD14+单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

了解利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性的体外功能检测方法。该技术可筛选疫苗候选物并评估佐剂效果，为兽医疫苗研发提供质量控制工具。

利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

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