使用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

该协议代表了一种功能性体外测定，使用牛单核细胞来源的树突状细胞在体内研究之前测量疫苗免疫原性。因此，填补了畜禽疫苗学的现有空白。它是树突状细胞的产生和应用。

树突状细胞作为最有效的抗原呈递细胞，已成为了解包括疫苗功效在内的细胞内免疫机制的关键研究靶点。该测定可以作为筛选候选疫苗的工具，作为疫苗生产的质量控制状态以及抗原和佐剂选择的工具。展示该程序的将是动物生产和健康实验室的科学家Richard Kangethe。

首先将从小腿颈静脉穿刺获得的血液与肝素化真空管倒置和混合。然后将20毫升肝素化血液转移到无菌的50毫升管中，并用10毫升磷酸盐缓冲盐水或PBS稀释。将15毫升淋巴细胞分离培养基移液到无菌的50毫升管中，并将管倾斜至45度位置。

使用25毫升移液管小心地将30毫升血液PBS培养基分层在淋巴细胞分离的顶部，并在离心前将管子缓慢返回到垂直位置。然后使用巴斯德移液管收集外周血单核细胞或PBMC层的薄白色层，并将其转移到新的50毫升管中。每次洗涤使用40毫升PBS洗涤收获的PBMC两次，并充分混合。

离心后，将沉淀重悬于15毫升氯化铵钾缓冲液或ACK缓冲液中。在室温下孵育10至15分钟后，加入多达40毫升PBS并以最大加速和减速离心管。将沉淀重悬于10毫升完全培养基中。

然后每1000万个细胞加入5微升CD14微珠缓冲液，并使用移液管充分混合。对于流式细胞术分析，向PBMC中加入10微升CD14异硫氰酸荧光素或FITC染色抗体，并在4至8摄氏度下孵育15分钟，然后再进行流式细胞术。向未染色的PBMC中加入一毫升传真缓冲液，并在500g和4摄氏度下离心7分钟。

然后将沉淀重悬于每1亿个细胞的500微升传真缓冲液中。接下来，将免疫磁性细胞分离柱插入分离器中，并在色谱柱出口下方放置50毫升收集管以收集流出物。用一毫升脱气传真缓冲液清洗色谱柱后，用新的管更换用过的15毫升管。

一次在500微升缓冲液中移取一亿个细胞，使细胞悬液通过色谱柱。然后每次用三毫升脱气传真缓冲液冲洗色谱柱三次。收集流出物后，将第一个洗脱的幼稚淋巴细胞部分标记为CD14阴性细胞部分。

从分离器中取出色谱柱，并在色谱柱下方放置一个新的无菌15毫升管，用于收集废水。将五毫升传真缓冲液加入色谱柱中，并立即使用柱塞将其推入。收集并将第二个流通或幼稚单核细胞部分标记为CD14阳性细胞部分。

将完全培养基添加到收获的CD14阳性单核细胞中，以达到每毫升100万个细胞。接下来，向无菌24孔板的每个孔中加入一毫升细胞悬液，然后在每个孔中补充试剂盒中提供的40微升细胞因子混合物。在第二天，使用移液管将每个孔内容物的一半转移到单独的1.5毫升管中。

将1.5毫升管以500g离心7分钟后，弃去上清液并将沉淀重悬于500微升新鲜完全培养基中。将500微升这种重悬的细胞悬液转移回相应的孔中，使孔中的最终体积变为一毫升。用20微升细胞因子混合物丰富每个孔。

为了产生抗原脉冲MoDC，将每毫升狂犬病病毒疫苗或RV悬浮液加入24孔板中的1毫升幼稚MoDC培养物中，并将板在5%二氧化碳和37摄氏度下孵育48小时。在第 7 天，将含有抗原脉冲 MoDC 的 24 孔板在冰上保持 10 分钟，然后每孔加入一毫升冰冷的 PBS 并充分混合。将悬浮液转移到15毫升管中。

用两毫升冰冷的PBS清洗井。收集每个孔内的残留细胞并将洗涤的内容物转移到各自的管中。将细胞悬液以500g离心7分钟。

弃去上清液后，将抗原脉冲的MoDCs细胞沉淀重悬于完整的培养基中，以调节每毫升100， 000个细胞的最终浓度。对于 MoDC-淋巴细胞共培养，在抗原脉冲的第 7 天用 1 毫升幼稚淋巴细胞悬液和 1 毫升抗原脉冲或非抗原脉冲 MoDC 悬浮液播种无菌 24 孔板的孔。孵育两天后，用每毫升20纳克重组白细胞介素-2补充每个孔，并继续孵育120小时。

在第14天，将一毫升共培养物转移到无菌的1.5毫升管中并离心管。然后用一毫升抗原脉冲或非脉冲MoDC重悬细胞沉淀。充分混合并将细胞悬浮液转移到相应的孔中。

在PBMC和幼稚淋巴细胞和单核细胞的细胞表面染色后，使用移液管将一毫升细胞悬液转移到无菌的1.5毫升管中，并以500g离心10分钟。然后将沉淀重悬于一毫升PBS中，并将其转移到15毫升管中。同时使用一毫升PBS收集残留细胞和相应的管。

然后将10毫升PBS加入含有细胞的15毫升管中，并通过移液混合。将试管以850g离心7分钟后，除去上清液，小心地重悬细胞沉淀，倾析上清液后留下残留的悬浮液。将细胞悬液转移到V底部96孔板上并密封孔以避免溢出。

染色完成后，进行流式细胞仪分析。从实时预览中，调整荧光阈值，包括电压和增益以及细胞大小，以最终在所需细胞群周围绘制门，同时排除任何细胞碎片。CD14细胞染色和流式细胞术显示，幼稚单核细胞组分由98%CD14阳性单核细胞组成，并且在功能上具有抗原摄取能力。

通过评估MHC Class 2和共刺激CD86和CD40细胞表面标志物的表达来表征的幼稚MoDC表型验证了树突状细胞或DC样表型。在第九天的MoDC淋巴细胞共培养期间，在向MoDC的RV脉冲中观察到显示树突延伸的形态变化。与非脉冲MoDC淋巴细胞培养相比，在脉冲MoDC淋巴细胞共培养的第16天，CD4阳性和CD8阳性T细胞上的Ki67和CD25活化标志物上调，证明了淋巴细胞增殖的显着增加。

与非特异性组相比，来自成熟RV脉冲MoDC共培养的CD8阳性T细胞表现出Ki67的八倍上调。与对照组相比，同一共培养物中的CD4阳性细胞的Ki67增加了7倍，这表明RV引发的MoDC能够将RV抗原呈递给幼稚淋巴细胞并在体外条件下激活它们。共培养物的qPCR定量显示，在使用GAPDH作为校准品的所有共培养物中，干扰素γ表达增加30%以上，Ki67表达增加5%以上。

与非特异性治疗组相比，在RV脉冲MoDC淋巴细胞共培养中观察到分泌干扰素γ浓度显着更高。非常缓慢和小心地执行分层步骤，确保血液放在淋巴细胞分离培养基的顶部。要格外小心地收集所有PBMC，不要从其他层收集太多材料。

其他方法，如流式细胞术，ELISA和定量PCR等，可以在此程序之后应用来评估免疫标志物的活化。