Name: 使用完整的心脏小梁机械控制松弛 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 了解心脏小梁机械控制松弛的测量方法，用于研究舒张功能障碍。该技术通过应变依赖性分析帮助识别新型治疗靶点，为心脏疾病研究提供可靠的实验方案。

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本工作由美国国立卫生研究院（1R01HL151738）和美国心脏协会（18TPA34170169）资助。

以下方案已获得韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。本方案描述了使用啮齿类实验动物的步骤，但也可根据需要调整用于其他模式生物。
1. 准备
<ol>
	<li>获取实验动物，并使其适应实验室环境。</li>
	<li>准备 250 mL 灌注液和 250 mL 改良 Tyrode 溶液（表 1），用氧气将每种溶液氧合至 O2 浓度为 10–20 ppm，pH 值为 7.3。</li>
	<li>准备一支 5 mL 注射器并连接套管针。用灌注液充满注射器。小鼠使用 23 G 套管针，小型或大型大鼠分别使用 18 G 或 16 G 套管针。在钝头针末端套上一段 1 mm 长的聚乙烯（PE）导管（材料表），以帮助防止结扎后主动脉从套管针上滑脱。</li>
	<li>完成解剖与插管区域的准备工作（图 1）
	<ol>
		<li>将两个洁净的称量皿至少半满地装入灌注液。将套管针尖端浸入灌注液中，并在套管针周围放置至少一个双环缝合线。使用夹具固定注射器位置。</li>
		<li>准备好手术剪、止血钳、虹膜镊、小型弯剪以及两把 #3 镊子，以便取用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在实验系统中预充并循环改良 Tyrode 溶液，完成实验系统的准备（图 2）。确保灌流室完全充满且状态稳定。</li>
	<li>开启所有数据采集设备，包括力传感器、长度电机、起搏系统、温度控制系统以及数据采集计算机。</li>
	<li>复制并重命名一个包含所需 *.dap 和指针文件的模板文件夹，以对应当前实验。打开数据采集软件。</li>
	<li>将用于心室小梁肌分离的工具（Vannas 剪、#5 或 #55 镊子、玻璃探针）的尖端浸入含 10%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的超纯水或灌注液中，使金属表面被蛋白质包被（图 2B）。 
	&#8203;注意：整个实验系统必须在解剖操作开始前完成准备。</li>
</ol>
2. 大体解剖与插管
<ol>
	<li>记录实验动物的编号、体重及其他相关信息。</li>
	<li>可选：向啮齿类动物注射1,000 U/kg肝素无菌生理盐水 通过 安乐死前至少10分钟进行腹腔注射，以尽量减少冠状动脉灌注前的凝血风险。</li>
	<li>将动物放入诱导室，按照标准操作程序，使用100%氧气雾化3%-5%异氟烷诱导全身麻醉。 
	注意：开启任何用于减少异氟烷暴露的外部排风装置、下吸式实验台或通风橱。</li>
	<li>一旦啮齿动物失去翻正反射且呼吸频率减慢：
	<ol>
		<li>（对于大鼠）将动物从麻醉诱导舱中取出，仰卧置于解剖垫上，并通过鼻罩持续给予麻醉。</li>
		<li>（对于小鼠）将动物从诱导室中取出后立即行颈椎脱位处死。无需使用鼻罩。将异氟烷挥发罐调至0%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如有需要，使用由图钉固定的胶带将啮齿类动物的上肢固定在解剖板上，远离胸壁，注意避免刺入动物体内。在开始解剖前，检查麻醉深度是否合适（无足趾夹捏反应）。</li>
	<li>使用手术剪（大鼠用Mayo剪，小鼠用Metzenbaum剪），在剑突下方沿腹壁横向全宽切开皮肤，进入腹腔。</li>
	<li>使用手术剪，在胸部两侧的横切口基础上，沿胸壁两侧做两个纵行的旁矢状切口。然后横断膈肌，连接两侧的旁矢状切口，以充分暴露胸腔空间。</li>
	<li>使用止血钳夹住并向上提起啮齿类动物剑突，朝向其头部方向，以抬高胸骨和胸壁，暴露胸腔空间和心脏。必要时，迅速将旁矢状切口延伸至接近第二椎间隙，以充分暴露心脏，和/或撕裂心包膜。</li>
	<li>使用弯头虹膜镊，小心抬起心脏以暴露大血管。将镊子置于心肌与啮齿类动物脊柱之间，夹住大血管并抬起心脏，注意避免夹住心房或心室部分。
	<ol>
		<li>在轻轻抬起心脏的同时，迅速将弯头虹膜剪（凹面朝上）置于弯头虹膜镊与啮齿类动物脊柱之间，剪断大血管和肺组织，使心脏分离。&#160;迅速将心脏移入含有新鲜灌注液的称量皿或烧杯中，并轻轻振荡以帮助清除心脏上的血液。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将异氟烷蒸发器调至0%，如果尚未完成此操作。如果心脏上仍附着较大片的肺组织、心包组织或其他组织，请在此时小心剪除并弃去，以尽量减少对插管操作的干扰。</li>
	<li>使用弯头虹膜镊将心脏转移至一个洁净的称量皿或烧杯中，确保已准备好的套管浸没其中。将主动脉插管，通过收紧环形丝线结扎固定主动脉，并用最多5 mL灌注液进行冲洗。</li>
	<li>将心脏从套管中取出，放入涂有硅胶弹性体的称量皿中，以备进行小梁肌分离。</li>
</ol>
3. 小梁的分离与平衡
<ol>
	<li>将心脏置于体视显微镜下的硅胶弹性体包被培养皿中并进行照明。</li>
	<li>定位右心室流出道。将左心房和心室心尖固定于培养皿中的硅胶弹性体上。</li>
	<li>使用长型Vannas剪刀，从右心室流出道沿室间隔剪至心尖。从右心室流出道沿靠近主动脉处剪至右心房，然后剪开右心房（图3B).</li>
	<li>用镊子小心地从流出道处撑开右心室（RV）游离壁，注意不要拉伸组织。 
	注意：实验者可能会发现细的白色结缔组织条索，可放心剪断。较粗的粉红色（组织）条索应谨慎评估，因其可能是可分离的小梁结构。</li>
	<li>将右心室三角的游离壁固定在培养皿上，以暴露右心室图3C).</li>
	<li>使用已熔化并拉制成细尖端的玻璃移液管（&#60;500 µm 直径），但不要使用尖端，寻找暴露的心内膜上的游离小梁（图3C). 
	注意：游离小梁是一条肌肉条，其下方可完全探入。应选用侧边平行（宽度恒定）的小梁，避免使用三角形的乳头肌。在本操作及后续解剖过程中需格外小心，因对小梁施加牵拉可能导致组织损伤，从而降低其产生的收缩力。</li>
	<li>使用小型Vannas剪刀解剖心室小梁。在小梁的每一端保留一个边长不小于1毫米的组织块，以便固定。应尽可能避免拉伸小梁组织，并尽量减少金属器械的接触，因为两者均可能对肌肉造成损伤。根据需要调整固定心脏的针的位置，以减小小梁周围肌肉所受的张力。</li>
	<li>从7 mL移液管末端剪下约2英寸长度，缓慢将小梁肌吸入移液管中，并转移至一个新的称重皿内，该称重皿中含有50%灌流液和50%改良Tyrode's溶液。让肌肉在混合溶液中平衡数分钟，以适应细胞外钙浓度的升高。
	<ol>
		<li>重复步骤 3.7–3.8，以在此时解剖额外的小梁，获取备用的小梁组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭向实验腔室供应灌流和/或吸引的泵。使用大口径移液管，将小梁组织转移至盛有台氏液的实验腔室中。</li>
	<li>固定针一 &#62;将心室乳头肌末端的1 mm³组织块固定在力传感器的钩子上，然后将第二个组织块固定在电机上。 
	注意：安装第一侧时，将马达和力传感器分开，以便更好地接触传感器；安装第二块组织时，在保持小梁松弛的同时，将钩子尽可能靠近放置。</li>
	<li>重新开始灌流，并对肌肉进行起搏以确定阈值电压。以高于阈值电压20%的条件起搏约1小时，使心室小梁组织达到平衡状态。</li>
	<li>在该平衡期结束时，通过连接至电机的千分尺缓慢拉伸肌肉，同时观察所产生的张力（从最低到峰值），直至达到最佳的主动应力产生。当被动舒张期张力的上升速度超过峰值张力时，即表明已超过最佳长度，此时应停止增加肌肉长度。</li>
	<li>关闭透射式显微镜照明，使用鹅颈灯以较陡的角度照射心室小梁。通过已校准的、连接至显微镜光学系统的相机，将舒张期的心室小梁图像采集至实验文件夹中。若心室小梁宽度超过相机视野范围，需在肌肉不同位置采集多幅图像。</li>
	<li>在能够报告像素距离的图像软件中打开图像。
	<ol>
		<li>沿肌肉长度方向测量其直径的像素距离，共测量四次。测量肌肉（小梁）长度（以像素为单位），不包括大块组织。</li>
		<li>如果肌肉长度超过视野范围，可利用肌肉上的参考点分段测量全长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用实验文件夹中的模板对直径测量值进行平均，并利用先前获得的校准参数将直径和长度从像素转换为毫米。根据公式 π×直径²/4 计算横截面积2/4 毫米2，以及肌肉长度（单位：µm）。</li>
</ol>
4. 数据采集
<ol>
	<li>肌肉达到平衡后，打开数据采集软件，选择 实验 | 长度控制，并在校准框中输入校准后的肌小梁长度（FL）和横截面积（面积 [m2]）。</li>
	<li>从模板文件夹（步骤 1.7）中，确保 freeform_file.txt 指向正确的文件夹，并在文本编辑器中打开 freeform.dap 文件。在 *.dap 文件中将等张水平（isoton）设置为 32,000。</li>
	<li>在“长度控制”框中，选择 自由形态 选项卡，并浏览至相应的自由形态列表文件。确保数据存储路径也指向用于保存数据的正确文件夹。先按下 运行实验 开始采集完全等长收缩的数据，然后使用带有比例增益和积分增益参数的反馈控制来采集负载钳制数据。</li>
	<li>通过在 *.dap 文件中定义后负荷（isoton）来采集负载钳制数据，并在文本编辑器中保存文件时，迭代调整比例增益（propgain）和积分（Ki）参数的数值。在数据采集软件界面中点击 运行实验。
	<ol>
		<li>确保在该迭代过程中，钳制包含肌肉重新延长至原始长度的过程（有时称为舒张期加载5），以获得最大范围的应变率，方法是将模式（flswitch）从 1 设置为 1，并将结束负载钳制的阈值（flthreshold）从零开始提高。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将模式（flswitch）从 1 更改为 0 来控制负载钳制的结束。重复采集过程，同时改变负载钳制结束时的重新延长程度，从无重新延长逐步过渡到完全恢复至起始长度。
	<ol>
		<li>如需增加长度，可逐步提高结束负载钳制的阈值（flthreshold），直至肌肉几乎完全重新延长至其原始长度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重置模式（flswitch = 1）和阈值（flthreshold = 0），并进行最后一次数据采集。</li>
	<li>如有需要，可通过重复步骤 4.4–4.6 修改研究中的后负荷。该采集可立即进行。</li>
	<li>如有需要，可通过拉伸或缩短肌肉来改变前负荷，或通过向台氏液中添加化合物处理肌肉。若改变前负荷或添加化合物，需至少等待 20 分钟，以确保慢速力响应9,15 已稳定和/或化合物已充分渗透肌肉组织。</li>
	<li>数据采集完成后，取出肌小梁。如需进一步分析，可将其冷冻或固定，用于生化或组织学分析。</li>
	<li>清洁工作区域和实验系统，用水冲洗所有管路，并关闭所有组件。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>通过将定量分析程序指向相应的文件路径，打开数据文件。</li>
	<li>通过确保数据分析程序分析夹持的心跳周期，并正确获取负载钳制的起始点，来量化舒张过程。
	<ol>
		<li>确保识别出负载钳制的终点，以便从等长舒张期间应力的峰值负导数中量化舒张速率（1/τ）。</li>
		<li>采用 Glantz 方法16 确定该指数时间常数，或其他适当的舒张量化方法（应力的最小导数、logistic 时间常数17 或运动学模型18）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保数据分析程序通过对应变对时间求导来计算应变率，其中应变定义为长度随时间变化的函数除以最佳收缩时的长度。</li>
	<li>对给定条件下所有记录曲线重复上述步骤。</li>
	<li>绘制舒张速率与应变率之间的关系图，将最大数据限制在生理应变率小于 1 s-1 的范围内。排除低应变率下的数据（图 4C），因为此时舒张阶段可能不反映指数衰减过程17,18。</li>
	<li>获取舒张速率与应变率之间关系直线的斜率，并将该斜率记录为心肌舒张协调性指数（MCR）。</li>
	<li>对每个被检测的条件重复上述分析。</li>
</ol>

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</ol>

机械性控制舒张（MCR）用于量化心肌舒张速率对肌肉在舒张前发生的应变率的依赖性8,9。应变率是调节舒张速率的充分且必要因素，而非后负荷8。由于目前尚无有效干预钙瞬变速率的方法可显著改善心脏舒张功能，机械性干预可能为舒张功能障碍的机制提供新的认识，并带来新的治疗策略。
本文所述的心肌应变率调节方案采用等张负荷钳制技术8,9。等张负荷钳制的优势在于能够对后负荷应力进行定量控制。类似Windkessel的实验方案可用于进一步探究后负荷、前负荷及心脏做功的变化2,6,7。此外，也可使用非负荷钳制控制的斜坡刺激，以更有效地分离应变与应变率的变化。然而，后负荷本身似乎对舒张速率并无显著影响8。
该方案也可进行调整，以接近生理状态下的温度和起搏频率。当前方案的细节用于证明MCR的存在。通常建议根据具体的实验问题，在生理条件下进行实验。然而，在37 °C或高起搏频率下进行实验可能会更快地导致肌肉功能衰退（损伤）。此时可能需要使用携氧能力更优的溶液。此外，数据采集系统必须能够以足够快的采样速率记录长度和力的变化，以分辨快速的肌肉收缩，并实现反馈控制。
本方案未描述钙浓度的测量，也未涉及肌节长度的测量与控制。钙浓度的测量已在其他方案中有所阐述。11，而使用适当的设备可增加肌节长度的测量。目前的MCR研究中未采用肌节长度控制，因为肌肉长度是与临床状况相关性最强的参数19进一步控制肌节长度（而非肌肉长度）可为动力学问题提供特定答案，但由于肌节间的变异性和对肌节长度变化的了解有限，这种方法不太可能增加转化医学知识。 体内.
此处强调了三个实验注意事项，以提高数据的可重复性。
首先，在某些动物中可能难以找到游离的心室小梁（未发表结果及通信）。尽管在大多数大鼠中可以找到具有收缩功能的肌肉，但从大鼠小梁中成功获取数据的合理成功率约为三分之一。使用布朗-挪威与刘易斯杂交F1代大鼠（Brown Norway x Lewis F1 rats）的成功率可能更高，该品系在历史上已被使用20，并据报告具有更多的小梁结构（未发表通信）。对于小鼠而言，成功率可能更低，BL/6背景的小鼠成功率预计低于十分之一；然而，FVBN背景的小鼠预计成功率更高（未发表通信及观察结果）。
其次，肌肉损伤会降低输出力。若在25 °C、0.5 Hz起搏条件下，肌肉产生的力低于10 mN mm-2，研究者可能需要进行故障排查，以评估是否存在意外拉伸或金属镊子与肌肉接触的情况，灌注液是否配制正确，或起搏及实验设备是否正常工作。其他使用完整小梁肌的实验方案曾建议采用鲁尔锁扣注射器作为转移容器11。尽管这是可行的，尤其是在控制极慢流速或使用较小肌肉片段的情况下，但本方案采用内径更大的转移移液管，以尽量减少可能的损伤。另一个可能发生缺血性损伤的步骤是在解剖过程中。应在首次腹部切口（大鼠）或颈椎脱位（小鼠）后3分钟内完成主动脉插管并用灌注液冲洗，这与心肌细胞分离方案中列出的时间限制相似21,22。此举可最大限度缩短心脏组织未接触类似停跳液的灌注液的时间。此外，解剖时间超过30分钟通常无法获得能够收缩的小梁肌。因此，操作者应练习快速而细致的解剖技术，以减少损伤。横截面积超过0.2 mm2（2 × 10-7 m2）的肌肉可能因核心缺血而受损20。
第三，应考虑肌肉与电机和力传感器的连接方式。本方案目前主要采用钩子固定和独立的肌小梁。在松弛前的拉伸过程中，应变速率有时较快，如果固定不当，可能导致肌肉滑脱，因此本方案不使用&#34;篮状结构&#34;来固定肌小梁23,24。也可考虑并验证其他固定方法（如胶粘剂、夹具等）25,26。此处描述的方案使用肌小梁而非乳头肌。乳头肌的腱索会引入额外的串联弹性成分，可能抑制肌节收缩性的变化9。然而，固定点在肌肉上的具体位置不太可能影响测量结果，因为肌小梁的长度（和直径）存在显著差异。
用钩子刺穿肌肉末端的一个局限性在于，固定点本身也可能受到损伤。由于频繁收缩（取决于收缩强度），附着的肌肉组织可能发生撕裂，从而改变肌肉的长度或串联弹性。这种撕裂的发生率难以控制。类似地，在拉伸过程中，组织和钩子的损伤可能进一步加剧，也有可能引发问题。应通过肉眼检查，并结合所产生的力量值是否持续保持在平衡后等长收缩力的&#62;80%，来评估标本是否受损，进而决定是否应将其排除。
另一个局限性或需考虑的因素是该方法能够回答的实验问题。例如，灌注液中使用2,3-丁二酮单肟（BDM）的情况。BDM是一种磷酸酶，可能改变肌肉的功能。此外，长时间的去负荷以及缺乏起搏意味着潜在的磷酸化状态很可能已经发生变化。因此，如果试图直接评估动物肌肉的收缩力（而非不同基因型或处理之间的差异），应谨慎对待，因为收缩状态可能已经改变。然而，可通过向通路中添加激动剂或拮抗剂，以药理学方法评估磷酸化的影响。
总之，心肌弛豫率（MCR）揭示了肌肉运动（应变率）对弛豫过程的调控机制。MCR 可有助于更深入地理解舒张功能障碍的诊断与监测，并为药物干预提供潜在靶点，例如调节肌球蛋白动力学。本文所述的实验方案与建议基于多年试验积累的经验，应可适用于其他系统及心脏疾病模型。

在几乎所有类型的心力衰竭（包括射血分数降低的心力衰竭）以及多种心血管疾病中，心脏舒张功能均受到损害。除了大量用于评估透化心肌组织心脏功能的方法外，对完整心脏肌肉的评估正日益受到关注。这类组织可在无负荷（两端自由收缩）或有负荷（长度或力控制）条件下进行评估。传统上，完整分离的心肌细胞通常在无负荷条件下进行评估，即细胞体在收缩过程中可自由缩短。而完整的心肌小梁则常在等长条件下进行评估，即其长度保持不变，但可产生应力（单位横截面积上的力）。目前，完整心肌细胞和心肌小梁的评估方法正通过负荷条件的调整逐渐趋于一致1,2。
用于肌肉负荷钳制（即控制肌肉产生的应力至特定值，以模拟生理后负荷）的实验方案已在数十年间逐步建立3,4,5在完整的心脏组织中，负载钳技术使研究人员能够更精确地模拟 体内 使用等张或类似Windkessel后负荷的心动周期6,7,8,9本实验方案的目的是获取用于量化MCR（即应力松弛率对应变率的依赖性）的数据。8,9.
尽管MCR方案借鉴了先前的研究工作，但本方案的重点（与使用完整心脏组织的类似方案相比）在于调节舒张过程的生物力学机制。目前已有一些方案采用负荷钳制技术3,4,5,7,10&#160;，也有方案专注于Windkessel模型1,2,11，而本方案则具体描述了在舒张前施加牵拉如何改变舒张速率。我们已证明，这种调控发生在原发舒张期8，该时期最初由Wiggers提出12。在正常健康的心脏中，心肌在主动脉瓣关闭之前（即等容舒张之前）的射血阶段会经历一次伸长应变13。本实验通过延长后负荷控制的持续时间，直至肌肉开始伸长，来模拟这一过程。临床证据表明，在疾病状态下，这种伸长可能减弱甚至消失14，而收缩末期应变率改变的意义及其机制尚未完全阐明。鉴于目前针对舒张功能障碍及射血分数保留型心力衰竭的治疗手段十分有限，我们认为MCR可能有助于揭示导致舒张功能受损的新机制。
尽管此处描述的大体解剖主要针对啮齿类动物，但小梁肌的分离可从任何完整的心脏中进行，并且此前已成功应用于人类心脏小梁肌8。同样，数据采集与分析方法也可适用于心肌细胞或其他类型的分离肌肉组织1,10。本文讨论部分包含了对该方法可能进行的修改与调整建议，以及相关局限性，例如由于腱索的力学特性，应谨慎避免使用乳头肌9。

<table><tbody><tr><td>18 或 16 号钝头针/套管</td><td></td><td></td><td>用于大鼠主动脉插管，使用 1mm 长的 PE160 或 PE205 管作为限位止挡</td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-25G</td><td></td></tr><tr><td>23 号钝头针/套管</td><td></td><td></td><td>用于小鼠主动脉插管，使用 1mm 长的 PE50 管作为限位止挡</td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD Luer-Lock</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>95% 氧气/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>AirGas</td><td>Z02OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>EZ Systems</td><td>EZ-SA800</td><td>可使用任何合适的麻醉方法/系统</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP-1600</td><td>用于涂覆精细镊子、剪刀的尖端</td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>容器/解剖皿</td><td>FisherBrand</td><td>08-732-113</td><td>用于制作解剖板的称量皿</td></tr><tr><td>Crile 止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13005-14</td><td>用于小鼠大体解剖</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>数据采集软件</td><td>SLControl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据采集系统</td><td>MicrostarLabs</td><td>DAP5216a</td><td>可使用任意数据采集系统（DAQ）。&amp;nbsp; 此为基于 PCI 的数据采集系统，配合 SLControl 使用；需配备具有 PCI 插槽的计算机</td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Mathworks</td><td>Matlab</td><td>自定义脚本</td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>2 把，用于主动脉插管</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>2 把，用于心室条分离</td></tr><tr><td>实验系统</td><td>Aurora Scientific</td><td>801C</td><td>可使用任何具备力和长度控制功能的合适实验腔室</td></tr><tr><td>精细弯剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>用于心脏摘除</td></tr><tr><td>鹅颈式双头照明灯</td><td>AmScope</td><td>LED-6WA</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>成像软件</td><td>IrfanView</td><td></td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td>用于心脏摘除</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>VetOne</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁六水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td>用于大鼠大体解剖</td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14116-14</td><td>用于小鼠大体解剖</td></tr><tr><td>显微镜连接相机</td><td>Flir</td><td>BFS-U3-27S5M-C</td><td>包含采集软件</td></tr><tr><td>显微镜/数字成像系统</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td>可使用任何合适的显微镜。&amp;nbsp; 用于测量肌肉长度和横截面积</td></tr><tr><td>固定针/针头</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305136</td><td>用于将心脏固定在皿中。&amp;nbsp; 27 G × 1-1/4 英寸</td></tr><tr><td>固定针/针头</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td>用于将心脏固定在皿中。直径 0.4 mm 的昆虫针（可替代 27G 针头）</td></tr><tr><td>氧气（O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>AirGas</td><td>OX USP300</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Rainin</td><td>Rabbit</td><td>可使用任何可在实验腔室中产生流动的方法</td></tr><tr><td>pH 和氧气传感器</td><td>Mettler Toledo</td><td>SevenGo pH 和 DO</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237205-100G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488-500G</td><td></td></tr><tr><td>罗彻斯特-皮恩止血钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>501708</td><td>用于大鼠大体解剖</td></tr><tr><td>丝线缝合线，规格：4/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td>剪成约 1.5 英寸长的段，用水浸泡</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907-100G</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>AmScope</td><td>SM-1TX</td><td></td></tr><tr><td>学生型 Vannas 弹簧剪&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>用于打开右心室</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅胶弹性体基料</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>用于制作解剖板</td></tr><tr><td>注射器固定架</td><td>Harbor Frieght</td><td>Helping Hands 60501</td><td>可作为铁架台的替代品</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625-1KG</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>FisherBrand</td><td>13-711-7M</td><td>从尖端剪去约 1&quot; 以扩大孔径</td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>用于心室条分离</td></tr></tbody></table>

利用完整心脏小梁进行松弛的机械控制

Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae

舒张功能障碍是心血管疾病表现中常见的表型。除了心肌僵硬度增加（左心室舒张末期压力升高）外，心肌舒张功能受损也是诊断舒张功能障碍的关键指标。尽管心肌舒张依赖于胞质钙离子的清除以及肌小节细肌丝的去激活，但针对这些机制的治疗至今尚未提供有效的临床干预手段。机械性因素（例如血压，即后负荷）被认为可能影响心肌舒张。近期，我们的研究表明，改变拉伸过程中的应变率（而非后负荷）是调节心肌组织后续舒张速率的必要且充分条件。这种舒张对应变率的依赖性被称为舒张的机械调控（mechanical control of relaxation, MCR），可通过完整的心肌小梁进行评估。本实验方案详细描述了小型动物模型的准备、实验系统与实验腔室的构建、心脏的分离以及小梁的获取、实验腔室的准备，以及实验操作与数据分析流程。在完整心脏中已发现存在延长性应变的证据，提示MCR可能为药物治疗的更精确表征提供新的研究方向，同时也为在完整肌肉中评估肌丝动力学提供一种新方法。因此，对MCR的研究可能揭示治疗心力衰竭的新途径与前沿方向。

代表性数据集如图4所示，更多结果可参见先前发表的文献8,9。简而言之，应变率是通过在等长舒张前的应变对时间的导数计算得到。应变定义为肌肉长度随时间变化的函数除以肌肉在最适长度时的长度。舒张速率计算为1/τ，其中τ为指数时间常数16。为确定舒张的机械调控（MCR），需要多个应变率及其对应的舒张速率。这些数据被绘制在舒张速率相对于应变率的图中。直线的斜率即为MCR指数。
请注意，收缩末期和舒张期的应变率不太可能超过 1 s-1因此，斜率应仅包含应变率 &lt; 1 s-1低应变率下的应力松弛速率可能受到应力最小时间导数（dStress/dt）变化的干扰。分钟），在这些情况下，数据来自持续时间小于约0.15秒的拉伸段-1 可忽略。
<img alt="用于医学实验分析的手术准备装置，包括工具、通风和解剖设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：大体解剖与心脏插管区域的设置。 从右至左：a. 动物麻醉诱导舱位于解剖区域附近。b. 可选的挥发性气体收集用通气管（snorkel）。c. 解剖垫，用于仰卧位固定动物，其周围顺时针依次为：d. 鼻罩，用于持续向啮齿类动物供给麻醉气体；e. 止血钳；f. 手术剪；g. 弯头精细剪刀，放置位置便于惯用手（操作剪切动作的手）取用；h. 弯头虹膜镊，放置位置便于非惯用手取用。啮齿类动物的上肢可用胶带固定于解剖垫上；i. 附近应放置一个解剖皿（或小烧杯），内盛灌流液，用于冲洗心脏。j. 插管操作区域应设置在附近，环形架上安装有配备合适插管针头的注射器。k. （插图）16 G插管针头的特写图像，其上连接有1 mm长的PE205导管，并以缝线松散打结固定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于光学激发和分析的显微镜装置；包括样本制备所需的工具、托盘和移液器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：实验区域与工具。（A）实验区域。实验腔室和数据采集系统设置在一台倒置显微镜旁（左侧）。小梁肌的分离与固定在体视显微镜下进行（右侧）。（B）两把镊子的尖端、大号和小号Vannas剪刀以及一根定制的玻璃探针，均通过浸泡于10% BSA溶液中进行预处理。（C）其他解剖工具。表面涂覆硅胶弹性体的培养皿可用于精细解剖过程中心脏的固定。培养皿下方展示了一支末端被剪除的7 mL转移移液管。转移移液管的剪切尖端被丢弃，使用扩大的孔径来转移肌肉组织，从而最大程度降低拉伸或脱水的风险。（D）玻璃移液管末端的放大图像，其长度约为2 mm，直径为0.25–0.5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="大鼠心脏解剖步骤；标注的解剖结构；手术操作；实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：解剖操作示意图。（A）大体解剖应从剑突下方的皮肤开始，作一横向切口（1. 绿色），切开至腹膜腔（下部肋骨与剑突由一条细灰线标示）。随后沿肋骨向上作两侧偏矢状切口（2. 青绿色线和 3. 蓝色线），之后切断膈肌。然后可用止血钳夹住剑突并向上提起胸壁，使其朝向头部方向抬起。（B）完整的大鼠心脏被固定于硅胶弹性皿中，视角显示右心室流出道（RVOT）、右心房（RA）、主动脉（Ao）和左心房（LA）。第一组切口应从 RVOT 沿室间隔至心尖（1. 黄色线）。第二组切口应从 RVOT 沿心脏基底部延伸，再横跨右心房（2. 橙色线）。（C）可小心将 RVOT 从主动脉分离，以打开心脏并向后固定。黄色与橙色线对应于 B 中所述的切口位置。致密小梁常出现在右心室游离壁基底部及室间隔附近，但也可能出现在其他任何位置（红线标示常见分布区域）。（D）玻璃探针位于小梁下方的放大视图（黄色箭头指示小梁与探针的交界处）。（E）一条小梁（红色箭头）被安装在实验系统中，连接于力传感器（左侧）与电机（中右侧）之间，并在小梁上下两侧配有两条起搏电极（水平方向位于小梁上方和下方）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="静息平衡与力学弛豫；应力-应变图与应变率数据分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：代表性记录与结果。（A）使用鹅颈式 LED 灯以与显微镜镜头轴线呈较大角度（约 75°）照射单根心室肌小梁，从而增强其对比度。本示例中，通过拼接两张图像以显示肌小梁的完整长度。（B）同一肌小梁的应力-时间（上图）和应变-时间（下图）曲线。图中显示了一次等长收缩，以及在逐渐增加的收缩末期应变率下的三次负荷钳制收缩。（C）代表性 MCR 计算示意图。MCR 定义为弛豫速率与应变速率之间关系直线的斜率。如讨论部分所述，可限定应变速率范围以获得定量且可重复的 MCR 值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：溶液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879_Table1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

快速的心肌和心脏舒张对于正常生理功能至关重要。目前已知机械舒张机制依赖于应变率。本方案概述了实验数据的采集与分析方法，以进一步研究舒张过程的机械调控机制。

舒张功能障碍是心血管疾病表现中常见的表型。除了心肌僵硬度增加（左室...）

本方案描述了一种用于测量心肌小梁中肌肉舒张的力学控制或应变依赖性舒张的方法。该技术的主要优势在于其专注于心脏舒张功能。鉴于目前对舒张期疾病缺乏有效的治疗手段，该技术可能被用于发现与心脏舒张相关的新指标及药物靶点。本方法将以啮齿类动物心脏进行演示，但也可应用于任何完整肌肉。本次实验操作将由我本人以及实验室的本科研究助理Anita Abbo共同示范。首先，将粗略解剖后的小型动物模型心脏从灌流管中取出，放入涂有硅胶弹性体的称重皿中，以准备进行小梁肌的分离。然后将心脏置于体视显微镜下并进行照明。找到右心室流出道后，用针将左心房和心室心尖固定在培养皿中的硅胶弹性体上。使用长柄Vannas剪刀，沿室间隔从右心室流出道剪至心尖。接下来，从右心室流出道沿主动脉附近切至右心房，然后切开右心房。用镊子小心地从流出道处将右心室游离壁轻轻拉开，注意不要拉伸组织。若见到细小的白色结缔组织条索，可将其剪断，但不要剪断较粗的粉红色组织条索，因其可能是小梁结构。将右心室三角的游离壁固定在培养皿中，以暴露右心室。使用一根细的钝端熔融玻璃移液管，在暴露的心内膜上寻找无支撑的肉柱，操作时避免施加压力。避开三角形的乳头肌，选择侧壁平行的肉柱，这类肉柱通常位于右心室游离壁基底部附近以及室间隔沿线。使用小型Vannas剪刀解剖小梁，在小梁两端各留下一立方毫米的组织，以便固定。接着，从7毫升移液管末端剪下约两英寸长度，缓慢将小梁吸入移液管中，并转移至一个新的称重皿内，该称重皿中含有50%灌流液和50%改良Tyrode溶液。让肌肉在混合溶液中适应细胞外钙浓度的升高，持续数分钟。关闭向实验腔室供应灌流或吸引的泵。使用大口径移液管，将心室肌条转移至盛有台氏液的实验腔室中。将肌条一端的立方体组织固定在力传感器的挂钩上，再将另一端的立方体组织固定在电机上。重新开始灌流，并对肌肉进行电刺激以确定阈值电压。以高于阈值电压 20% 的参数刺激肌肉，持续约一小时。在此平衡期结束时，通过连接至电机的千分尺缓慢拉伸肌肉，同时观察主动张力的变化，直至达到最佳的主动应力产生状态。当被动舒张期张力上升速度超过峰值张力时，停止增加肌肉长度，表明已超过最适长度。关闭透射显微镜照明，使用鹅颈灯以较陡的角度照射心肌小梁。通过先前校准过的、经显微镜光路连接的相机，采集舒张期心肌小梁图像并保存至实验文件夹中。对直径测量值取平均，并使用先前获得的校准参数将直径和长度从像素转换为毫米。计算横截面积和以微米为单位的肌肉长度。在数据采集软件中，通过在 dap 文件中定义后负荷来获取恒定负荷数据，并在文本编辑器中保存文件后，迭代调整比例增益和积分参数的数值，然后在界面中点击“Run Experiment”。通过改变模式来控制负载钳的结束点。在将负载钳的结束点从零逐渐调整至完全的过程中，重复采集数据，并重新拉长至起始长度。为增加长度，需逐步提高负载钳结束的阈值，从零开始，直至肌肉几乎重新拉长至其原始长度。如有需要，可调整后负荷并立即重复数据采集。如有需要，可通过拉伸或缩短肌肉来改变前负荷，或通过向台氏液中添加化合物处理肌肉，但需至少等待 20 分钟，以确保慢速力反应已稳定，且化合物已充分渗透肌肉。数据采集完成后，移除心室小梁并清洁实验系统。通过确保数据分析程序分析被钳制的心跳周期，并正确获取负载钳制的起始点，来量化舒张过程。在量化完给定条件下所有轨迹后，绘制舒张速率与应变速率之间的关系图，将最大数据限制在生理应变速率（小于每秒一次）范围内。排除低应变速率下的数据，因为此时舒张阶段可能不反映指数衰减特征。获取松弛速率与应变速率之间直线的斜率，并将该斜率记录为松弛机械控制的指标。图中显示的是使用鹅颈式LED灯以与显微镜镜头轴线成75度的陡峭角度照射下的单根心室小梁。同一小梁的应力-时间曲线和应变-时间曲线显示了一次等长收缩以及三次在递增的收缩期应变速率下的负荷钳制收缩。应变率由等长舒张前瞬间应变的导数计算得出。数据绘制在舒张速率与应变率关系图上，其中直线的斜率提供了舒张的力学控制值，即 MCR 指数。本方案中最困难的部分是心脏小梁的精细分离。该方案可与其他肌肉测量方法结合使用，包括细胞内钙离子浓度、收缩力和肌节长度的测定。此外，该方法正被用于鉴定分子机制，并更深入地理解心肌舒张功能障碍的病理生理学。

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细胞内钙离子循环在心肌细胞收缩和舒张功能的调控中起着关键作用。本文介绍了一种利用钙成像系统评估心肌细胞肌浆网Ca2+储备能力及舒张期钙离子清除功能的实验方案。...

离体心室心肌细胞肌浆网钙储备及细胞内舒张期钙清除的评估

介绍了一种通过快速起搏联合左束支消融建立慢性非同步性心力衰竭（HF）模型的方法。采用二维斑点追踪成像和主动脉速度时间积分来验证该稳定的心力衰竭模型，该模型具有左心室非同步性，并可用于评估心脏再同步化治疗的益处。...

左束支消融与快速起搏诱导的非同步性心力衰竭模型中心脏再同步化治疗的益处

本文介绍了一种在斑马鱼中以四维（4-D）方式可视化心脏发育的实验方案。通过光片荧光显微镜（LSFM）进行的4-D成像，可在时间序列上获取三维（3-D）图像，从而重建发育中心脏的动态过程。我们通过定性和定量分析表明，剪切应力在心腔发育过程中可激活心内膜的Notch信号通路，进而促进心脏小梁化。...

利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像

本方案包括对房室瓣叶进行力控制、位移控制和应力松弛双向力学测试的表征。通过本方案获得的结果可用于构建本构模型，以在有限元模拟框架下仿真功能性瓣膜的力学行为。...

房室心瓣的双轴力学表征

我们提出了一种评估GtACR1激活在兔心肌细胞中机电效应的实验方案。本文详细介绍了细胞分离、培养与腺病毒转导，以及采用膜片钳和碳纤维技术进行的功能实验。...

光遗传学调控心肌细胞活性的机电评估

本方案介绍了一组关于肌节、钙离子及宏观几何结构的 来自主动收缩的心室小梁的数据...

离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

我们提出了一种实验方案 离体 人室心肌组织的培养。它允许对收缩力和收缩动力学进行详细分析，并可施加前负荷和后负荷以模拟 在体 更接近生理环境。...

人源心肌组织长期培养的制备

本方案介绍了如何使用MyoBLAZER系统测量供体心脏来源的成人原代心肌细胞的收缩力。MyoBLAZER是一种可靠的平台，可用于临床前药物研发阶段评估药物诱导的收缩力变化。...

分离的成年成人原代心肌细胞中心肌收缩力的测量

了解心脏小梁机械控制松弛的测量方法，用于研究舒张功能障碍。该技术通过应变依赖性分析帮助识别新型治疗靶点，为心脏疾病研究提供可靠的实验方案。

利用完整心脏小梁进行松弛的机械控制

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