Name: 通过模拟监督学习分析线粒体形态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T12:05:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 了解模拟监督机器学习方法，用于分析固定心肌母细胞荧光显微镜图像中的线粒体形态。该方法无需人工标注即可实现高精度分割，适用于自动化细胞生物学研究。

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作者感谢 Arif Ahmed Sekh 的讨论交流。感谢 Zambarlal Bhujabal 在构建稳定的 H9c2 细胞系方面提供的帮助。我们感谢以下资助项目：欧洲研究委员会启动资助项目编号 804233（资助对象：K.A.），科研人员科学振兴项目资助编号 325741（资助对象：D.K.P.），北挪威地区卫生当局资助项目编号 HNF1449-19（资助对象：Å.B.B.），以及挪威北极大学（UiT）主题资助项目 VirtualStain（Cristin 项目编号 2061348，资助对象：D.K.P.、Å.B.B.、K.A. 和 A.H.）。

注意：如果使用已知实验条件的现有线粒体显微图像，则可省略第1至第4节。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>将 H9c2 细胞培养于添加了 2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、10 mM 半乳糖、10% FBS、1% 链霉素/青霉素和 1 µg/mL 嘌呤霉素的无葡萄糖 DMEM 培养基中。实验前，让细胞在含半乳糖的培养基中适应至少 7 天。 
	注意：此处使用的 H9c2 细胞经过基因改造，可表达荧光标记的线粒体，并携带嘌呤霉素抗性基因。添加该抗生素可确保仅具有抗性基因（因而具有荧光线粒体）的细胞能够生长。</li>
	<li>当细胞融合度达到约 80% 时（通过明场显微镜评估 T75 培养瓶），将 H9c2 细胞用于接种实验。操作前，将培养基和胰蛋白酶预热至 37°C 至少 15 分钟。 
	注意：可同时在两种或多种不同细胞培养条件下平行开展实验。H9c2 细胞融合度不应超过 80%，以防止成肌细胞丢失。当融合度达到 100% 时，细胞会形成肌管并开始分化。</li>
	<li>在无菌超净工作台中进行细胞接种准备：为每种实验条件在 12 孔板的每个孔中放置一片 #1.5 玻璃盖玻片。在 12 孔板上标记各实验条件及相关细节。</li>
	<li>将细胞培养瓶从培养箱转移至超净台工作面。使用抽吸系统或电子移液器吸除培养基，随后用 5 mL PBS（室温）清洗两次。</li>
	<li>将预热的胰蛋白酶移至工作面，吸除最后一次 PBS 清洗液，然后加入预热的胰蛋白酶以消化细胞（T75 培养瓶加 1 mL）。将培养瓶放回 37°C 培养箱孵育 2–3 分钟。</li>
	<li>在孵育接近结束时，将预热的培养基移至工作面。使用明场显微镜检查细胞是否已脱落。
	<ol>
		<li>若仍有部分细胞未脱落，可轻而有力地敲击培养瓶侧面数次，使剩余细胞脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养瓶移回工作面。使用电子移液器向瓶中加入 4 mL 细胞培养基以终止胰蛋白酶作用。加液时，用移液器反复吹打液体，使其在瓶内表面充分分散，从而将细胞吹打成单细胞悬液。</li>
	<li>用移液器将 5 mL 细胞悬液从培养瓶转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在 200 x g 条件下离心 5 分钟。在超净台中打开离心管，吸除上清液，然后用 5 mL 细胞培养基轻柔重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪分析少量细胞悬液，测定细胞数量，并记录每毫升培养基中的活细胞数。</li>
	<li>根据接种密度约为 2 x 104 细胞/cm2 的要求，计算所需细胞悬液的体积（例如每孔 150 µL），移入已预先标记的 15 mL 离心管中。根据孔数，按预先计算的体积向离心管中加入预热的细胞培养基。对于 12 孔板，每孔总培养体积为 1 mL。</li>
	<li>在将细胞悬液分配至各孔前，通过反复吹打离心管内容物数次，确保稀释后的细胞悬液充分混匀。细胞悬液加入各孔后，以可控方式轻轻摇动培养板，使细胞在孔内均匀分布。将 12 孔板置于 37°C 培养箱中孵育至次日。</li>
	<li>使用明场显微镜观察细胞生长情况。若细胞已生长至约 80% 融合度，可进行后续步骤；否则需每日重复观察，直至达到足够生长密度。</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>根据库存溶液的浓度，计算实验所需的各种材料用量。将冷冻材料（30 mM CCCP 储存液）在 37 °C 下解冻，并将细胞培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>解冻后，通过将储存液按 1:3,000 比例稀释于细胞培养基中，配制 10 µM CCCP 工作液。 
	注意：不要用移液器吸取小于 1 µL 的体积。</li>
	<li>当所有必需材料准备并预热完成后，开始实验处理。吸除 12 孔板各孔中的细胞培养基，随后迅速向对照孔加入新鲜预热的培养基，向实验处理孔加入含 10 µM CCCP 溶液的预热培养基。</li>
	<li>将 12 孔板放入 37°C 细胞培养箱中孵育 2 小时。在孵育期间，准备固定液。</li>
	<li>配制固定液时，使用预先配好的 4% 多聚甲醛（PFA）将 25% 戊二醛（GA）储存液稀释至 0.2%（1:125）。将该溶液在 37°C 下预热。对于 12 孔板，每孔 500 µL 即可。 
	警告：PFA 和 GA 为有毒化学品，须在通风橱内佩戴防护装备操作。具体信息请参阅各自的化学品安全技术说明书（SDS）。</li>
	<li>孵育结束后，从培养箱中取出 12 孔板，放置于工作台面上。 
	注意：此步骤之后不再需要无菌环境。</li>
	<li>吸除各孔中的细胞培养基，加入预热的固定液。将 12 孔板重新放回 37°C 培养箱中孵育 20 分钟。</li>
	<li>孵育结束后吸除固定液，每孔用室温 PBS 洗涤两次。可在本步骤暂停实验，后续继续进行。
	<ol>
		<li>若暂停实验，每孔加入 1 mL PBS，用塑料封口膜（parafilm）密封 12 孔板，并在 4°C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 盖玻片上细胞的染色与封片
<ol>
	<li>解冻DAPI（细胞核染色剂）储备液，使用小型离心机离心后打开。用PBS稀释DAPI储备液（1:1,000），配制DAPI染色液。</li>
	<li>吸除12孔板中的PBS，每孔加入1 mL DAPI染色液，在室温避光条件下孵育5分钟。</li>
	<li>吸除DAPI染色液，每孔用2 mL PBS洗涤两次。</li>
	<li>用70%乙醇清洗磨砂玻璃显微镜载玻片（玻璃载玻片），随后用PBS洗涤三次。使用无绒纸巾小心擦干载玻片，并将其朝向光源检查是否有灰尘或油脂残留。 
	注意：此步骤需佩戴手套。</li>
	<li>用实验信息标记载玻片。将封片剂转移至微量离心管中，并用小型离心机离心。</li>
	<li>准备封片操作的工作区域。准备好含有盖玻片的12孔板、已标记的载玻片、封片剂、移液器、10 µL吸头、无绒纸巾和镊子。</li>
	<li>在已准备好的载玻片上滴加10 µL封片剂（ProLong Glass），用于固定盖玻片。</li>
	<li>用镊子从12孔板中取出盖玻片，通过轻轻接触盖玻片边缘和背面于已准备好的无绒纸巾上，吸除多余液体。然后缓慢将盖玻片轻轻放下，覆盖在封片剂液滴上。</li>
	<li>对每个盖玻片重复上述两个步骤。在载玻片上合理布置封片剂液滴，使每张载玻片可容纳1至4个盖玻片。</li>
	<li>确保载玻片置于平坦表面上，以防止已固定的盖玻片移动。将载玻片置于室温避光处过夜，使封片剂充分固化。样品现在可用于成像。本实验可在本步骤暂停，并在后续继续进行。</li>
	<li>若在此阶段暂停实验，则在室温静置过夜后，用铝箔包裹样品以避光，并在4°C下保存。</li>
</ol>
4. 显微镜与成像
<ol>
	<li>用铝箔覆盖样品以进行运输（如果尚未完成）。</li>
	<li>到达显微镜实验室后，使用双蒸水2用显微镜滤纸轻轻擦拭载玻片上的盖玻片，以去除残留的 PBS。将载玻片朝向明亮光源，检查盖玻片表面是否无斑点。</li>
	<li>按照显微镜的启动程序进行操作。选择合适的物镜（Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27），并添加浸油介质。</li>
	<li>将样品放入样品 holder 中。在显微镜软件中，使用 &#34;定位&#34; 按标签激活 EGFP 荧光照明，使用目镜手动调节 z 轴水平以使样本聚焦。找到焦点后关闭荧光照明。</li>
	<li>切换到 &#34;获取&#34; 显微镜软件中的标签。使用 &#34;智能设置&#34; 选择用于成像的荧光通道。本实验中选择了EGFP和DAPI通道预设。</li>
	<li>根据强度直方图调整各通道强度，以初始设置为参考，优化信号强度。现在可开始成像。</li>
	<li>成像时，使用软件的阵列功能将成像位置排列成阵列，并将阵列中心置于盖玻片中央，共设置12个成像位置。检查阵列中每个位置是否均含有细胞，若无细胞，则调整位置至有细胞的区域。</li>
	<li>使用显微镜软件的自动对焦功能调节阵列中每个位置的焦距，随后进行手动微调，以确保尽可能多的线粒体处于焦点范围内。 
	注意：这些手动调整使用 EGFP 通道。</li>
	<li>使用此方法获取每张盖玻片的图像。保存图像文件，然后进行形态学分析步骤。</li>
</ol>
5. 生成模拟训练数据
<ol>
	<li>下载代码10，并解压其中内容。按照 README.md 中的说明设置所需的环境。</li>
	<li>导航至名为 &#34;src&#34;，即本项目的主文件夹。内部的编号文件夹包含与使用该工具不同步骤相对应的特定代码。 
	注意：使用命令 &#34;cd &#60;&#60;路径&#62;&#62;&#34; 导航至代码的任意子文件夹。要运行任何 Python 文件，请使用命令， &#34;python &#60;&#60;文件名&#62;&#62;.py&#34;. 名为 &#34;教程.pptx&#34; 包含使用分割模型的完整操作指南。</li>
	<li>复制文件夹或使用该文件夹 &#34;2. 线粒体模拟艾里光斑&#34;，并重命名（此处使用 Airy，因为它是与所用共聚焦显微镜最接近的点扩散函数（PSF）形式，当前显微镜即为共聚焦显微镜）。进入名为 &#34;模拟器&#34;. 
	注意：此文件夹包含与训练数据模拟相关的所有文件。模拟过程中需设置三组参数。</li>
	<li>首先，针对批次配置文件中的模拟器 &#34;模拟器/批次/bxx.csv&#34;设置与样品相关的参数，包括线粒体数量、结构直径和长度的范围、结构在 z 轴上的分布范围以及荧光分子的密度。</li>
	<li>接下来，设置与光学系统相关的参数。
	<ol>
		<li>该集合包括显微镜类型（决定所选点扩散函数模型）、数值孔径（N.A.）、放大倍数（M）以及像素尺寸（单位为 &#181;m）、荧光团的发射波长以及背景噪声参数等。</li>
		<li>在文件中设置数值孔径（N.A.）、放大倍数和数据集的最小波长 &#34;模拟器/microscPSFmod.py&#34;.</li>
		<li>设置所需的像素大小，并将数据集的发射波长作为参数输入 &#34;process_matrix_all_z&#34; 文件中的函数 &#34;模拟器/生成批量并行.py&#34;.</li>
		<li>设置该函数的最后三个参数 &#34;保存物理地面实况&#34; 文件中 &#34;模拟器/生成批量并行.py&#34;参数包括像素大小（单位：nm）、输出图像的尺寸和 max_xy。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在文件中设置关于输出数据集的第三组参数，例如输出图像的尺寸、每幅图像中的图块数量以及图像总数 &#34;模拟器/生成批量并行.py&#34;.</li>
	<li>运行该文件 &#34;模拟器/生成批量并行.py&#34; 开始模拟。</li>
	<li>为获得最终尺寸的图像，复制名为 &#34;5. 数据准备与训练/数据准备&#34; 在主文件夹中，然后进入该文件夹。 
	注：合成数据集中的每幅图像由4幅128像素 × 128像素的模拟图像拼接而成，形成最终大小为256像素 × 256像素的图像。该过程首先为显微镜图像（在 &#34;输出&#34; 文件夹）和真实分割结果（在 &#34;输出/物理地面实况&#34; 文件夹）
	<ol>
		<li>设置批次数量、每批次图像数量以及噪声范围的参数 &#34;data_generator.py&#34;.</li>
		<li>运行该文件 &#34;data_generator.py&#34; 用于创建拼接图像。</li>
		<li>复制名为 &#34;图像&#34; 和 &#34;分割&#34; 到 &#34;5. 数据准备与训练/datatrain/train&#34; 文件夹中的文件夹 &#34;5. 数据准备与训练/数据准备/数据&#34;.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 基于深度学习的分割
<ol>
	<li>按照以下步骤在模拟图像上训练分割模型：
	<ol>
		<li>若要为新显微镜训练分割模型，请进入“5. 数据准备与训练/train”文件夹，并在文件“train_UNet.py”中设置批量大小、分割任务的主干模型、训练的轮数以及学习率。</li>
		<li>运行“train_UNet.py”以启动训练。训练过程中将显示模型在模拟验证集上分割性能的评估指标。 
		注意：训练完成后，模型将保存为“best_model.h5”文件，位于“5. 数据准备与训练/train”文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过以下步骤，对被分割为适合已训练模型尺寸的真实显微镜图像进行模型测试。
	<ol>
		<li>进入“6. 准备测试数据”文件夹，将数据的“.png”格式文件复制到“png”文件夹中。</li>
		<li>运行文件“split_1024_256.py”，将图像分割为适合已训练模型的尺寸。该操作将在“data”文件夹中生成大小为256像素 × 256像素的图像子块。</li>
		<li>将生成的“data”文件夹复制到“7. 测试分割”文件夹中。</li>
		<li>进入“7. 测试分割”文件夹，并设置要使用的已保存模型的名称。</li>
		<li>运行文件“segment.py”以对图像子块进行分割。分割后的图像将保存至“output”文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 形态学分析：对“葡萄糖”和“CCCP”两个数据组的线粒体形态进行分析
<ol>
	<li>整理待分析的数据（每个图像对应一个文件夹，每个文件夹包含该图像的分割输出结果裁剪图）。</li>
	<li>下载并把名为“make_montage.py”的补充文件放入名为“7. Test Segmentation”的文件夹中。</li>
	<li>运行文件“make_montage.py”，将分割输出结果重新拼接为原始图像尺寸。</li>
	<li>在“src”文件夹内创建一个新文件夹，命名为“9. Morphological Analysis”。</li>
	<li>使用命令“pip install seaborn[stats] skan”在环境中安装 Skan16 和 Seaborn Python 软件包。 
	注意：使用名为 Skan 的库对分割掩膜进行骨架化，以&#160;实现对单个线粒体拓扑结构的分析。</li>
	<li>将补充文件“analyze_mitochondria.py”放入“9. Morphological Analysis”文件夹中。</li>
	<li>将实验中不同组别的图像分别放入“7. Test Segmentation”文件夹内的不同子文件夹中。</li>
	<li>在文件“analyze_mitochondria.py”中设置“pixel size”（像素大小）和“input path”（输入路径）参数。</li>
	<li>运行文件“analyze_mitochondria.py”，执行代码以进行骨架化并生成分析结果图表。</li>
</ol>

<ol><li>Sekh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics-based+machine+learning+for+subcellular+segmentation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Physics-based machine learning for subcellular segmentation in living cells.</a> Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).</li>
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</ol>

作者声明本文不存在任何利益冲突。

我们在“&#34;几何结构生成&#34;和“&#34;模拟器参数&#34;部分中讨论了与实验方案关键步骤相关的注意事项。题为“&#34;迁移学习&#34;的段落讨论了在适配多种显微镜时实现更高通量的改进方法。关于“&#34;颗粒分析&#34;和“&#34;生成其他亚细胞结构&#34;的段落涉及本方法未来的应用方向。关于“&#34;与生物学真实情况的差异&#34;的段落探讨了模拟结果可能偏离真实数据的不同原因，以及这些因素是否会影响我们的应用。最后，我们在“&#34;密集排列的结构&#34;段落中讨论了本方法面临的一个具有挑战性的场景。
几何结构生成 
为了生成线粒体的三维几何结构，使用基于B样条曲线构建的简单二维结构作为骨架，可有效用于合成数据集的创建。这些合成形状能够高度模拟在二维细胞培养中观察到的线粒体形态。然而，对于心脏组织等三维组织而言，线粒体的形态和排列方式存在显著差异。在此类情况下，通过在模拟图像中引入方向性特征，可能有助于提升分割模型的性能。
模拟器参数 
设置模拟器参数时应谨慎，确保这些参数与用于推理的实际数据参数相匹配，否则可能导致分割性能下降。其中一个关键参数是信噪比（SNR）范围。待测试数据的信噪比范围应与模拟数据集所使用的值一致。此外，所使用的点扩散函数（PSF）也应与目标测试数据的PSF相匹配。例如，使用共聚焦显微镜PSF训练的模型不应直接用于测试落射荧光显微镜获取的图像。另一个需要注意的参数是测试数据中是否使用了额外的放大倍数。如果测试数据中应用了额外放大，模拟器也应相应地进行设置。
迁移学习 
迁移学习是指利用在一个任务上训练得到的模型来服务于另一个任务的现象。这一现象同样适用于我们所面对的不同类型的显微镜数据问题。在一种显微成像数据上训练得到的分割模型（随源代码提供）的权重，可用于初始化适用于另一种光学显微镜数据的分割模型。这使得我们能够在训练数据集的一个显著更小的子集上进行训练（3,000 张图像对比 10,000 张），从而降低仿真的计算成本。
颗粒分析 
也可对分割后的掩膜进行颗粒分析。该分析可提供单个线粒体的面积、曲率等信息。这些信息还可作为线粒体定量比较的指标（本实验未使用）。例如，目前我们通过线粒体长度的阈值来定义点状形态。在某些情况下，结合椭圆率可能有助于更好地区分小型棒状线粒体与点状或颗粒状线粒体。此外，若特定生物学条件导致线粒体发生卷曲，则曲率的量化分析可能对线粒体群体的研究具有重要意义。
生成其他亚细胞结构 
基于物理特性的亚细胞结构分割方法已在对线粒体和囊泡的研究中得到验证1。尽管囊泡具有多样的形态，但其尺寸较小，在荧光显微镜下通常呈现为简单的球形。因此，囊泡的几何结构可通过适当直径范围的球形结构进行模拟。这意味着生成结构几何形状的函数需相应调整（在线粒体情况下为圆柱体，在囊泡情况下为球体），并调整相关参数（见方案部分的步骤5.4）。从几何角度而言，内质网和微管也已被模拟为管状结构17。将内质网建模为直径150 nm的管状结构，微管建模为平均外径25 nm、内腔直径15 nm的中空管状结构，可近似反映这些结构的形态。另一个在各类亚细胞结构之间存在差异的参数是荧光染料密度。该参数根据荧光染料所结合的生物分子分布情况及其结合概率进行计算。
与生物学真实情况的差异 
用于深度学习模型模拟监督训练的模拟数据在许多方面与真实数据存在差异。（i）模拟数据中不存在非特异性标记，而真实数据中通常存在游离的荧光团，因此真实图像的平均背景值更高。这一差异通过匹配信噪比（SNR）并设置背景值以使其与观测到的真实值一致而得以缓解。（ii）亚细胞结构的运动和光动力学是系统中动态变化的两个来源。活细胞中移动的结构（运动时间尺度为几毫秒）会导致运动模糊。在真实数据采集过程中，通过缩短曝光时间以避免模糊效应。另一方面，我们并未模拟时间序列图像，而是假设结构静止；当真实数据的曝光时间较短时，该假设成立。然而，若真实数据的曝光时间足够长以致引入运动模糊，则该假设可能导致输出结果出现误差。而光动力学的时间尺度为纳秒至微秒级，由于实验通常的曝光时间足够长（毫秒级），足以平均化光动力学效应，因此在模拟中可忽略光动力学的影响。（iii）显微镜图像中的噪声具有多种来源，且这些来源具有不同的概率密度函数。我们并未对各类噪声来源进行单独建模，而是将其近似为在恒定背景上的高斯噪声。在低信背比条件（约为2–4）以及处理荧光团宏观密度时，这种近似不会显著改变数据分布1。（iv）成像伪影可能来源于像差、漂移和系统性模糊。我们假设显微镜系统已良好校准，并且真实数据中用于分析的区域不包含这些伪影。此外，也可在点扩散函数（PSF）中对部分此类伪影进行建模18，19，20。
紧密排列的结构 
在二维显微图像分割中，无法区分重叠的棒状结构与网络状结构是一个长期存在的问题。图5展示了一种极具挑战性的情况：线粒体高度密集排列，导致分割模型及后续分析结果不理想。尽管存在这一挑战，在此类情况下使用形态学算子对骨架进行细化，有助于打破过度连接的网络，同时仍能检测到线粒体形态各类别的显著变化。此外，采用共聚焦显微镜而非宽场显微镜成像，可通过消除离焦光信号在一定程度上缓解该问题。未来，进行三维分割将有助于区分真正相交（即物理上形成网络）的线粒体与在单个投影平面中影像重叠的棒状线粒体。
深度学习分割是一种前景广阔的技术工具，可拓展显微镜使用者的分析能力，从而实现对复杂数据和大规模定量数据集的自动化分析，而这些数据在以往是难以处理的。

本文展示了基于物理的机器学习工具在表达荧光线粒体标记物的固定心肌母细胞荧光显微图像中进行亚细胞分割1的应用价值。
线粒体是哺乳动物细胞中主要的能量生成细胞器。具体而言，线粒体是高度动态的细胞器，常以网络形式存在，其长度和分支结构持续发生变化。线粒体的形态影响其功能，细胞能够快速改变线粒体的形态以适应环境变化2。为了理解这一现象，将线粒体的形态分类为点状、杆状或网络状具有重要的参考价值3。
线粒体的分割对于分析细胞中线粒体的形态至关重要。目前用于分割和分析线粒体荧光显微图像的方法主要依赖于手动分割或传统的图像处理技术。基于阈值的方法（如Otsu4）由于显微图像中噪声水平较高，准确性较低。通常，用于线粒体形态分析的图像包含大量线粒体，使得手动分割极为繁琐。数学方法（如MorphoLibJ5）以及半监督机器学习方法（如Weka6）虽然可用，但操作复杂且需要专业知识。对线粒体图像分析技术的一项综述7表明，基于深度学习的技术可能适用于该任务。事实上，基于深度学习的模型已在日常图像的分割中（如自动驾驶等应用）带来了革命性进展。
深度学习是机器学习的一个子集，它提供能够从大量数据中进行学习的算法。有监督的深度学习算法通过学习带有真实标签（GT）的大规模图像数据集中的关系来实现训练。在荧光显微图像中对线粒体进行分割时，使用有监督深度学习面临两方面的挑战。首先，有监督深度学习需要大规模的训练图像数据集，而在荧光显微成像的情况下，获取如此大规模数据集的工作量远大于使用更易获得的传统相机图像。其次，荧光显微图像需要对训练图像中的目标对象进行真实标签（GT）标注，这是一项繁琐且需要专家知识的任务。对于一张标记了荧光亚细胞结构的细胞图像，专家完成标注可能需要数小时甚至数天时间。此外，不同标注者之间的标注差异也会带来问题。为了消除对手动标注的依赖，并充分利用深度学习技术的优越性能，本研究采用了一种基于深度学习的分割模型，该模型在模拟图像上进行训练。基于物理的模拟器能够模拟并控制显微镜中的图像形成过程，从而生成具有已知形状的图像。通过使用基于物理的模拟器，本研究为此目的构建了一个包含大量模拟荧光显微图像的线粒体数据集。
模拟从使用参数曲线生成几何形状开始。发射源以均匀分布的方式随机放置在形状表面，使其密度与实验值相匹配。显微镜的三维点扩散函数（PSF）通过Gibson-Lanni模型的一种计算高效的近似方法89进行计算。为了使模拟图像与实验图像高度一致，系统同时模拟了暗电流和散粒噪声，以实现照片级真实感。物理真值（GT）以二值图的形式生成。生成该数据集并训练模拟模型的代码已公开10，创建此模拟数据集的具体步骤如图1所示。
我们通过分析固定的心肌母细胞的共聚焦显微镜图像，展示了完全基于模拟数据集训练的深度学习分割方法的应用价值。这些心肌母细胞在外膜表达了一种荧光标记物，从而可在荧光显微图像中实现线粒体的可视化。在进行本示例实验之前，细胞在培养中被剥夺葡萄糖并适应半乳糖培养基达7天。用半乳糖替代培养基中的葡萄糖可迫使培养细胞转向更依赖氧化代谢的状态，因而更加依赖线粒体产生能量11,12。此外，这种处理使细胞对线粒体损伤更为敏感。通过向细胞培养基中添加线粒体解偶联剂（如羰基氰化物间氯苯腙，CCCP），可实验性地诱导线粒体形态的变化13。CCCP会导致线粒体膜电位（ΔΨm）的丧失，从而使线粒体形态由较管状（杆状）转变为更球状（点状）14。此外，在CCCP处理过程中，线粒体往往出现肿胀15。我们展示了经半乳糖适应的心肌母细胞在使用线粒体解偶联剂CCCP处理后，其线粒体形态分布的变化情况。利用深度学习对线粒体进行分割，使我们能够将它们分类为点状、杆状或网络状结构。随后，我们提取了定量指标，用于评估不同线粒体表型的分支长度及其丰度。分析步骤如图2所示，下文将详细介绍细胞培养、成像、用于深度学习分割的数据集构建，以及线粒体定量分析的具体方法。

<table><tbody><tr><td>12孔板</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>水性电镜级25%戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>明场显微镜</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>必须运行Linux/Windows操作系统，并配备至少4GB显存的NVIDIA GPU</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（染色剂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（磨砂边）</td><td>epredia</td><td>AA00000112E01MNZ10</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 mCherry-EGFP-OMP25</td><td></td><td></td><td>由购买的细胞系构建的本实验室稳定细胞系</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>封片剂（玻璃用）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>4%多聚甲醛PBS溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x油镜（M27），数值孔径1.4</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>无菌超净工作台</td><td>Labogene</td><td></td><td>SCANLAF MARS</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Vacusafe抽吸系统</td><td>VACUUBRAND</td><td>20727400</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过模拟监督学习分析线粒体形态

Analyzing Mitochondrial Morphology Through Simulation Supervised Learning

在细胞荧光显微图像中对线粒体等亚细胞器进行定量分析是一项具有挑战性的任务，原因在于这些结构体积微小且形态多样，分割过程存在固有困难。本文展示了一种基于机器学习辅助的分割与分析流程，用于对固定细胞的荧光显微图像中线粒体形态进行量化分析。该基于深度学习的分割工具在模拟图像上进行训练，无需为监督式深度学习提供真实标注数据。我们在稳定表达荧光线粒体标记物的固定心肌母细胞的荧光显微图像上验证了该工具的有效性，并采用特定的细胞培养条件诱导线粒体形态发生变化。

利用表达荧光线粒体标记物的固定心肌母细胞的共聚焦图像，通过深度学习对线粒体进行分割的结果展示了该方法的实用性。该方法适用于其他细胞类型和显微镜系统，仅需重新训练即可。
经半乳糖适应的H9c2心肌成纤维细胞（其线粒体带有荧光标记）经CCCP处理或未处理2小时。随后将细胞固定，用核染料染色，并接种于载玻片上进行荧光显微镜分析。使用共聚焦显微镜获取对照组和CCCP处理组细胞的图像。我们共分析了12张共聚焦图像，每种条件下约60个细胞。随后确定并量化每张图像中线粒体的形态状态。本实验中，由训练模型获得的分割掩膜经过骨架化处理，以实现对单个线粒体拓扑结构的分析。单个线粒体的分支长度被用作分类参数。根据以下规则将单个线粒体划分为不同的形态类别：具体而言，任何骨架长度小于1,500 nm的线粒体被归类为点状（dot），而较长的线粒体则进一步分为网络状（network）或杆状（rod）。如果存在至少一个两个或多个分支交汇的节点，则定义为网络状；否则，该线粒体被归类为杆状。带有线粒体骨架及其形态类别标注的示例图像见图3。
线粒体形态分类在 图 4A 表明在使用CCCP处理2小时后，可以检测到显著变化；经CCCP处理的细胞中斑点数量的增加最为明显。
图4B中的平均分支长度是展示形态学上可检测且显著变化的另一种途径。如预期所示，当细胞经CCCP处理后，与对照组相比，线粒体棒状结构和网络结构均显著减少。由于线粒体在暴露于CCCP时会发生肿胀，因此点状结构的平均分支长度显著增加也符合预期。
<img alt="静态平衡示意图；光动力学、点扩散函数卷积、噪声、二值化过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：荧光显微镜图像模拟流程图。 该流程包括（i）三维几何结构生成，（ii）发射体与光动力学模拟，（iii）三维点扩散函数卷积，（iv）噪声添加，以及（v）二值化处理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="形态学分析的图像处理工作流程；分割、机器学习模型、骨架化示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：基于机器学习的线粒体形态分析步骤。 （1）首先将待分割的图像裁剪为适合分割模型处理的尺寸。（2）对裁剪后的图像区域应用基于深度学习的分割方法。（3）将分割结果重新拼接回原始图像尺寸。（4）对拼接后的分割图像进行骨架化处理。（6）基于骨架化所得的拓扑结构进行形态学分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分割过程；左侧：分割结果，右侧：骨架叠加；显微镜分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：线粒体骨架叠加在显微镜图像的分割结果上。（A）分割结果。（B）直线骨架（分支起点与终点之间的欧几里得距离）叠加在分割结果之上。骨架的颜色编码表示线粒体的类别：网络状结构为红色，杆状结构为绿色，点状结构为紫色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体长度分布；柱状图；对照组与CCCP处理组；标示统计学显著性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：线粒体形态学分析。（A）基于总线粒体长度的不同形态类别的相对百分比概览。（B）实验条件下及不同形态类别之间的平均线粒体分支长度比较。横轴显示形态学分类，纵轴显示以纳米（nm）为单位的线粒体平均分支长度。统计学显著性以p值表示，即 * p &lt; 0.05，** p &lt; 0.01，*** p &lt; 0.001，以及 **** p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构分析，高对比度显微图像，突出显示详细的细胞模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：分割失败案例。 线粒体密度过高是分割模型面临的一种挑战性情况。彩色骨架表示在图像中检测到的最长单个线粒体。通过分析长度测量结果，可以识别此类情况，并利用形态学腐蚀操作符（可使检测到的骨架变细）进一步优化分割效果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig05laregv2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/supplementary_files.zip" target="_blank">请点击此处下载文件。</a>

本文介绍了如何使用基于模拟监督的机器学习方法，分析固定细胞荧光显微镜图像中线粒体的形态。

细胞荧光显微图像中线粒体等亚细胞器的定量分析是一项具有挑战性的任务，原因是……

我们展示了一种在固定细胞的荧光显微镜图像中分析线粒体的基于模拟监督的机器学习工具。目前对显微镜图像中的线粒体进行分割的方法包括基于自动阈值的方法（如Ostu法）或手动分割。当信噪比较低时，基于阈值的技术表现较差。通常，用于形态学分析的图像包含大量线粒体，使得手动分割十分繁琐。有监督的深度学习方法虽能实现高精度分割，但需要大量输入的真值配对数据用于训练。该方法采用基于物理的模拟器生成显微图像及其对应的二维真值形状掩膜配对，从而消除了对人工标注的需求。使用模拟图像训练的模型随后被用于在真实显微镜图像中分割线粒体。我们采用一种基于深度学习的分割工具，可高精度地实现该任务的自动化，且无需标注的真实数据集进行训练。模拟过程首先通过参数化曲线生成形状，以完成几何结构的构建。发射源在生成的形状表面上均匀分布且随机放置，使其密度与实验值相匹配。使用 Gibson-Lanni 模型计算显微镜的三维点扩散函数（PSF）。为了在模拟图像与实验图像之间实现光度真实感，我们同时模拟了暗噪声和散粒噪声。物理学真实值以二值图的形式生成。我们评估了使用共聚焦显微镜成像的经CCCP处理对固定心肌母细胞线粒体形态的影响。细胞培养。在无菌超净工作台中进行操作，为细胞接种做准备：将每个实验条件的盖玻片放入12孔板的各孔中。在向各孔加入适当体积的细胞悬液前，通过反复吹打离心管中的内容物数次，确保稀释后的细胞悬液充分混匀。实验步骤。从12孔板的各孔中吸除细胞培养基，然后迅速向对照孔加入新鲜的预热培养基，并向实验组孔中加入含有10微摩尔CCCP溶液的预热培养基。在37摄氏度细胞培养箱中孵育两小时。吸除各孔中的细胞培养基，加入预热的固定液。在盖玻片上进行细胞染色与封片。向准备好的载玻片上加入10微升封片介质，用于封固盖玻片。使用镊子从12孔板中取出盖玻片，并通过轻轻触碰盖玻片边缘及其背面至预先准备好的无绒纸巾，以吸除多余水分。将盖玻片轻轻放下，覆盖在已滴加封片剂的液滴上。使用显微镜进行观察和成像。通过目镜手动调节Z轴高度，使样本聚焦清晰。在软件中切换到“已获取”选项卡。使用智能设置选择用于成像的荧光通道。以盖玻片中心为阵列中心，共设置12个成像位置。将RA定位在盖玻片中心。可通过自动化方式对多个位置进行成像。生成模拟训练数据。下载代码并解压文件内容。按照说明和自述文件设置环境。导航至名为 src 的文件夹，复制一份或使用文件夹 2。线粒体模拟 airy”并重命名。该文件夹包含与训练数据模拟相关的所有文件。模拟需要设置三组参数。首先，在批处理配置文件中设置模拟器的线粒体数量、直径范围、Z轴范围以及荧光分子密度参数。接着，在 microscopePSFmode.py 文件中设置数据集的数值孔径、放大倍数和最小波长等光学参数。然后，在 fire generate_batch_parallel 中设置所需的像素尺寸和发射波长值。在 generate_batch_parallel.py 文件中设置第三组关于输出数据集的参数，例如输出图像的尺寸、每幅图像中的图块数量以及文件中生成图像的总数。运行 generate_batch_parallel.py 文件以启动模拟。为获得最终尺寸的图像，复制名为“5. 数据准备和训练/数据准备”的文件夹并进入该文件夹。在 Data_generator 文件中设置批次数量、每批次图像数量以及要添加的噪声范围等参数。运行文件 Data_generator.py 以生成拼接图像。将名为 image 和 segment 的文件夹复制到 data/train/train 文件夹中。基于深度学习的分割。为了在新的显微镜图像设置下训练分割模型，请进入名为 train 的文件夹，并在名为 train_unet.py 的文件中设置用于训练的批量大小、分割的骨干模型、训练轮数以及学习率。运行 train_unet 文件。py”以启动训练。训练过程将显示在模拟验证集上评估分割模型的指标。训练完成后，模型将被保存为 best_model。为了在显微镜图像上测试模型，必须将图像分割为训练模型所需的理想尺寸。为此，请进入名为“6. Prepare test data”的文件夹，将数据的PNG格式文件复制到“PNG”文件夹中，然后运行文件split_1024_256。这将生成数据文件夹中图像的 256 × 256 尺寸裁剪。要对图像裁剪进行分割，请进入名为“7. Test segmentation”的文件夹并运行名为 segment 的文件。py”，然后设置要使用的已保存模型的名称。分割后的图像将保存到输出文件夹中。形态学分析。将名为 make_montage.py 的文件放入名为 7. Test segmentation 的文件夹中，并运行该文件，以将分割后的输出结果拼接回图像的原始尺寸。在源文件夹中创建一个名为“9. 形态学分析”的新文件夹，然后进入该文件夹。使用命令 pip install seaborn skan 安装 skan 和 seaborn 库。使用名为 skan 的库对分割掩膜进行骨架化，以实现对单个线粒体拓扑结构的分析。将文件放入文件夹“9. 形态学分析”中，将实验中不同组别的图像分别整理到文件夹“7. 测试分割”内的不同子文件夹中，然后运行该文件以生成用于分析的结果图表。要进行的定量分析取决于研究问题或假设。在本实验中，我们关注线粒体的三种不同形态，即点状“小型线粒体片段”、杆状“纤维状或串状线粒体”以及多分支网络状“多分支网络”。为识别这些形态，我们首先对分割结果进行骨架化处理，然后分析不同类别中的分支连接情况。我们展示了半乳糖适应细胞两组样本的分析结果，分别为对照组和CCCP处理组。我们观察到点状线粒体的平均分支长度显著增加，这符合预期，因为线粒体在暴露于CCCP时会发生肿胀。当细胞经CCCP处理后，棒状和网络状两类线粒体在各个长度区间所占的百分比均显著低于对照组，从而验证了我们的假设。本方法面临的一个挑战性情况是图像中线粒体密集排列时。粉红色表示图像中检测到的最长的单个线粒体，这是由于分割结果中的误差增大所致。这些失败情况可以通过控制线粒体长度并结合形态学操作来识别。尽管我们的应用仅展示了线粒体形态分析的一种实现方式，但我们认为，围绕线粒体自噬及相关生物学实验的各个方面，均可建立类似的分析方法和研究问题。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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