Name: 通过免疫荧光测定 可视化 患者来源的卵巢癌类器官中的 DNA 损伤修复蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: 了解免疫荧光技术用于卵巢癌类器官中DNA损伤修复蛋白的可视化与定量分析。该方法有助于研究化疗及PARP抑制剂耐药机制，为靶向治疗提供重要依据。

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我们感谢 Pavel Lobachevsky 博士在建立本方案过程中提供的指导。同时，我们谨向圣路易斯华盛顿大学医学院妇产科及妇科肿瘤学部、华盛顿大学院长学者项目、妇科肿瘤学组基金会以及生殖科学家培养项目致以谢意，感谢他们对本项目的支持。

在获得患者知情同意后，采集肿瘤组织和腹水样本，样本来源于圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会（IRB）批准的妇科肿瘤生物样本库。纳入患者均为晚期高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）。除非另有说明，所有操作均在室温下于实验台进行。所有试剂均在室温下配制（另有说明除外），并储存于 4 °C。
1. 类器官生成
<ol>
	<li>按照先前发表的文献报道生成类器官20。</li>
</ol>
2. 类器官的铺板与辐照
<ol>
	<li>在培养物中使用类器官时，通过手动操作移液枪头将类器官从培养皿上分离下来。将类器官收集至15 mL锥形管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1,650 × g离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入1,000 µL无动物来源的重组酶（参见材料表）。混匀溶液，并在37 °C下孵育15分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1,650 × g离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液。</li>
	<li>离心和吸除上清后，将沉淀重悬于1,000 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>取10 µL溶液转移至1.5 mL微量离心管中，并与10 µL台盼蓝混合。</li>
	<li>取10 µL台盼蓝染色的细胞悬液加入细胞计数板载玻片中，然后插入细胞计数仪（参见材料表）进行计数。</li>
	<li>将每20 µL基底膜提取物（BME）中接种40,000个细胞至8孔玻璃腔室载玻片中（参见材料表）。此条件可维持类器官生长3–5天，使细胞形成类器官并生长至合适大小。</li>
	<li>为诱导DNA双链断裂，使用10 Gy的ɣ射线照射已接种的类器官（辐照设备详情参见材料表）。 
	注意：该过程可能需要5–10分钟。</li>
	<li>将类器官置于含培养基的湿润培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育4小时。</li>
</ol>
3. 免疫荧光染色
注意：体积指每孔8孔板的用量（约300 µL）。
<ol>
	<li>照射并孵育类器官后，用移液器吸去培养基，操作时需小心以免破坏3D基质。用300 µL PBS洗涤。</li>
	<li>用300 µL的2%多聚甲醛（PFA）固定类器官10分钟。 
	注意事项：固定时间不宜过长，否则基底膜提取物（BME）可能发生去聚合，导致被吸除。</li>
	<li>用300 µL染色缓冲液（见材料表）洗涤类器官。置于摇床上振荡5分钟。</li>
	<li>进行通透处理时，轻柔加入300 µL通透缓冲液（见材料表），孵育20分钟。随后用300 µL染色缓冲液洗涤，置于摇床上振荡5分钟。</li>
	<li>加入300 µL染色缓冲液以封闭通透步骤。置于摇床上孵育30分钟。用移液器吸去染色缓冲液。</li>
	<li>加入300 µL用染色缓冲液稀释的一抗溶液（兔抗RAD51、鼠抗Geminin、兔抗RPA、鼠抗ɣH2AX、兔抗Geminin、鼠抗53BP1；见材料表），4 °C孵育16小时。 
	注意事项：避免使用同一宿主动物来源的抗体进行共染。孵育时保持盖子打开，防止抗体扩散至邻近孔中。</li>
	<li>移除一抗溶液。在摇床上用300 µL染色缓冲液洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>加入300 µL用染色缓冲液稀释的二抗溶液（山羊抗鼠Alexa Fluor 488和山羊抗兔Alexa Fluor 647；见材料表），避光孵育1小时。 
	注意事项：后续所有步骤均需在避光条件下进行。</li>
	<li>吸除二抗溶液。加入300 µL稀释的DAPI溶液。置于摇床上振荡5分钟。</li>
	<li>在摇床上用300 µL染色缓冲液洗涤三次，每次5分钟。吸去染色缓冲液，并使用腔室载玻片配套的拆卸试剂盒将腔室拆下（见材料表）。 
	注意事项：拆卸时注意不要过度推进，以免破坏3D基质。</li>
	<li>使用剪去尖端的p200移液器吸头，加入封片介质（见材料表），使每孔类器官区域被覆盖（例如，每个类器官区域加20–30 µL）。</li>
	<li>将盖玻片覆盖在样本上，避免产生气泡。</li>
	<li>用透明指甲油沿盖玻片边缘涂抹，密封载玻片。静置1小时使其硬化，然后置于-20 °C保存。 
	&#8203;注意事项：成像后，载玻片可在荧光信号基本不损失的情况下保存至少6个月。</li>
</ol>
4. 成像
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜（见材料表）在63倍油镜下获取图像。 
	注：若成像目标为核蛋白，63倍物镜更优，但40倍物镜也可接受。</li>
	<li>使用DAPI通过目镜定位类器官。根据所用荧光染料选择合适的显微镜滤光片。设置采集z轴层扫图像的参数。 
	注：本研究中使用的荧光染料为DAPI、488和647。开启405、488和638激光器以观察染色情况。 
	注：推荐的z轴层扫范围取决于物镜的分辨能力。</li>
	<li>调整实时图像：设置焦距、激光强度等。 
	注：激光强度越高，样品发生光漂白的可能性越大。因此，应选择最佳激光强度。</li>
	<li>采集z轴层扫图像。 
	注：此过程可能需要5至10分钟。</li>
	<li>从z轴层扫采集的图像中，每个层扫至少截取三张图像。 
	注：应确保在整个层扫范围内获取截图，以避免在定量分析时重复计数细胞核。</li>
	<li>将每个文件保存为TIFF格式，并进入下一步分析（步骤5）。</li>
</ol>
5. 分析
注意：所有图像分析均使用 JCountPro 软件，操作步骤参照先前发表的报告21。如需获取该软件，请参考相关出版物。
<ol>
	<li>在程序顶部的“对象分析”面板中，于程序底部的“文件选择”选项卡内，选择 TIFF 文件。</li>
	<li>点击 添加 将所选文件移至已选文件组，然后选择 显示。</li>
	<li>在“分割”选项卡下，选择 蓝色 作为细胞核的颜色。选择 自动分割 以优化细胞核的阈值。 
	注意：如果自动分割未能准确识别对象，用户可调整精细调节和原始调节参数，或参考用户手册进一步优化分割效果。</li>
	<li>在“对象”面板中，选择 自动分割大对象 并优化细胞核的大小。 
	注意：细胞核的无条件大小通常为 5,000 像素，条件大小为 1,500 像素。请参阅用户手册以进一步优化对象大小。</li>
	<li>选择 识别对象 以测试参数。 
	注意：如果这些参数不准确，可调整大小和调谐参数以及其他设置。请参阅用户手册了解进一步优化的说明。</li>
	<li>在根据图像调整好参数后，选择 在所有图像中识别对象，以在所有选定图像中识别细胞核。</li>
	<li>选择程序顶部的 焦点分析&#160;面板。</li>
	<li>在程序底部的“选择文件”选项卡中，选择用于对象分析的 TIFF 文件，并点击 箭头按钮（>>）将图像移至图像文件组。</li>
	<li>在已移动图像文件下方的目录组中，双击 手动编辑 文件夹，并将 ioc 文件移至对象集合文件组。 
	注意：所有选定的 TIFF 文件必须有对应的 ioc 文件。</li>
	<li>点击 选择 将文件移至已选文件组，然后选择程序底部的 焦点计数 选项卡。</li>
	<li>按照以下步骤优化参数：
	<ol>
		<li>Top hat 设置索引：12。</li>
		<li>焦点通道：选择焦点的颜色（绿色：ɣ-H2AX；红色：RAD51）。</li>
		<li>H dome 设置：穹顶高度 %：30；阈值 %：28 和 28。</li>
		<li>形状/大小设置：最小焦点大小，像素：5。选择 应用形状/大小。最大焦点大小（条件）：32。最小圆度，×100：96。最大焦点，像素：60。</li>
		<li>噪声滤波器：大小 1。 
		注意：若需判断细胞核是否为 geminin 染色阳性，请在第二通道下选择绿色，在分析下选择强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为测试所设参数，请依次选择以下按钮：Top Hat &#62; H-Dome &#62; 焦点计数。 
	注意：如果这些参数无效，可调整大小和调谐参数以及其他设置。请参阅用户手册了解如何进一步优化图像。</li>
	<li>当所选图像的参数已优化后，选择 自动计数 以对每张图像中每个细胞核的焦点进行计数。如需使用第二通道，程序将测定可用于分析的强度值。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

DNA损伤应答在卵巢癌的发生发展以及化疗耐药性中均发挥着关键作用。因此，深入理解DNA修复机制至关重要。本文介绍了一种用于在三维完整类器官中研究DNA损伤修复蛋白的方法。该方法建立了一套可重复且可靠的实验流程，利用标志性抗体来评估DNA损伤、同源重组、非同源末端连接以及复制应激。重要的是，本研究通过基因修饰的对照样本验证了这些方法的特异性和灵敏度。
本方案中最关键的步骤是类器官的铺板和固定。该方案特别要求在固定过程中，将类器官在2%多聚甲醛（PFA）中孵育10分钟，并在固定期间密切监测基底膜提取物（BME）的状态。这与其它类器官免疫荧光染色方案不同，后者通常建议使用4% PFA固定10至60分钟23,24,25。研究发现，如果BME的胶状结构长时间暴露于高浓度PFA中，其结构会解聚，并在后续操作中容易被吸除。值得注意的是，特定BME产品的制造商通常会提供有关固定的建议。另一个需要讨论的重要问题是类...

卵巢癌是导致妇科恶性肿瘤患者死亡的首要原因。大多数患者接受以卡铂为代表的DNA损伤类药物治疗，而同源重组修复（HRR）缺陷型肿瘤患者还可使用聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂1,2。然而，大多数患者会对这些疗法产生耐药性，并在确诊后5年内死亡。DNA损伤应答（DDR）的失调已被证实与卵巢癌的发生发展以及化疗和PARP抑制剂耐药密切相关3。因此，研究DDR对于理解卵巢癌的病理生理机制、潜在生物标志物以及开发新型靶向治疗策略至关重要。
目前评估DNA损伤应答（DDR）的方法主要采用免疫荧光（IF），因为该技术能够准确识别和定位DNA损伤相关蛋白及核苷酸类似物。当DNA发生双链断裂（DSB）时，组蛋白H2AX会迅速被磷酸化，形成DNA损伤修复蛋白聚集的焦点4。这种磷酸化可通过IF轻松检测；事实上，ɣ-H2AX检测已被广泛用于确认DSB的产生5,6,7,8,9。DNA损伤水平升高与铂类药物的敏感性及DNA损伤剂的疗效相关10,11,12，而ɣ-H2AX已被提出作为其他癌症治疗中化疗反应相关的生物标志物13。在发生DSB后，具备同源重组修复（HRR）能力的细胞会启动一系列事件，促使BRCA1和BRCA2招募RAD51，以取代复制蛋白A（RPA）并与DNA结合。HRR利用DNA模板精确修复DSB。然而，当肿瘤细胞HRR功能缺陷时，则依赖于非同源末端连接（NHEJ）等替代修复通路。NHEJ具有较高的错误倾向，会在细胞中造成较大的突变负荷，并以53BP1作为正向调控因子14。这些DNA损伤相关蛋白均可通过IF以焦点形式被准确识别。除了蛋白染色外，IF还可用于研究复制叉保护及单链DNA缺口的形成。复制叉的稳定性已被证实与铂类药物反应相关，而近期缺口检测方法显示出预测PARP抑制剂反应的潜力6,15,16,17。因此，在核苷酸类似物整合入基因组后对其进行染色，是研究DDR的另一种方法。
迄今为止，对卵巢癌中DNA损伤反应（DDR）的评估在很大程度上局限于同质性的二维细胞系，这些细胞系无法再现肿瘤的克隆异质性、微环境或组织结构 体内 肿瘤18,19近期研究表明，在研究DNA损伤应答（DDR）机制等复杂生物学过程时，类器官优于二维细胞系6. 本方法学评估类器官中RAD51、ɣ-H2AX、53BP1、RPA和geminin的表达。这些方法可检测完整类器官，并能够在更接近体内环境的条件下研究DNA损伤应答（DDR）机制 体内 肿瘤微环境。结合共聚焦显微镜和自动焦点计数技术，该方法有助于阐明卵巢癌中的DNA损伤应答通路，并为患者制定个体化治疗方案提供支持。

<table><tbody><tr><td>含钙镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS++）</td><td>Sigma</td><td>14-040-133</td><td></td></tr><tr><td>不含钙镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>Ant-53BP1 抗体&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>612522</td><td>用染色缓冲液按1:500稀释</td></tr><tr><td>Ant-Geminin 抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab104306</td><td>用染色缓冲液按1:200稀释</td></tr><tr><td>Anti-Geminin 抗体&amp;nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10802-1-AP</td><td>用染色缓冲液按1:400稀释</td></tr><tr><td>Anti-RAD51 抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab133534</td><td>用染色缓冲液按1:1000稀释</td></tr><tr><td>Anti-γH2AX 抗体&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-636</td><td>用染色缓冲液按1:500稀释</td></tr><tr><td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) 抗体</td><td>Bethyl Laboratories&amp;nbsp;</td><td>A300-245A-M</td><td>用染色缓冲液按1:200稀释</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP1605 100</td><td></td></tr><tr><td>离心机；Sorvall St 16R 离心机</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜，Leica SP5 共聚焦系统 DMI4000</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>389584</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 FL 全自动细胞计数仪（细胞计数仪）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>AMQAF2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>LA Colors</td><td></td><td>任何透明的指甲油均可使用</td></tr><tr><td>Cultrex&amp;nbsp; RGF 基底膜提取物，2型</td><td>&amp;nbsp;R&amp;D Systems&amp;nbsp;</td><td>3533-010-02</td><td>可能可使用 Matrigel 或其他 BME 基质&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;R37606</td><td>NucBlue 固定细胞即用型试剂，用1× PBS稀释&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甘氨酸&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>NC0756056</td><td></td></tr><tr><td>JCountPro</td><td>JCountPro</td><td></td><td>如需获取软件，请发送电子邮件至：jcountpro@gmail.com&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>07-000-243</td><td></td></tr><tr><td>指甲油&amp;nbsp;</td><td>StatLab</td><td>SL102450</td><td></td></tr><tr><td>2% 多聚甲醛（PFA）&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>157-4</td><td>将4% PFA在PBS++中稀释以获得2% PFA</td></tr><tr><td>通透缓冲液</td><td>实验室自制</td><td></td><td>PBS++中含0.2% Triton X-100&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Rainin&amp;nbsp;</td><td>17014967</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;P36930</td><td></td></tr><tr><td>染色缓冲液&amp;nbsp;</td><td>实验室自制</td><td></td><td>PBS++中含0.5% BSA、0.15% 甘氨酸和0.1% Triton X-100&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II 腔室载玻片系统&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-565-8</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>无动物来源，重组酶</td></tr><tr><td>X-RAD 320 生物辐照仪&amp;nbsp;</td><td>Precision X-Ray Irradiation&amp;nbsp;</td><td>X-RAD320</td><td></td></tr></tbody></table>

可视化患者来源卵巢癌类器官中的dna损伤修复蛋白 通过 免疫荧光检测

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

免疫荧光是一种广泛使用的技术，可用于高灵敏度和高特异性地可视化目标抗原，从而准确鉴定和定位蛋白质、糖类及小分子。尽管该技术在二维（2D）细胞培养中已十分成熟，但其在三维（3D）细胞模型中的应用尚不明确。卵巢癌类器官是一种三维肿瘤模型，能够重现肿瘤细胞的克隆异质性、肿瘤微环境以及细胞间和细胞-基质间的相互作用，因此在评估药物敏感性和功能生物标志物方面优于传统细胞系。因此，能够在原代卵巢癌类器官上应用免疫荧光技术，对于深入理解该癌症的生物学特性具有重要意义。本研究描述了在高级别浆液性患者来源的卵巢癌类器官（PDOs）中检测DNA损伤修复蛋白的免疫荧光技术。在将PDOs暴露于电离辐射后，对完整类器官进行免疫荧光染色，以评估核内蛋白形成的焦点结构。通过共聚焦显微镜的z轴层扫成像采集图像，并利用自动焦点计数软件进行分析。所述方法可实现对DNA损伤修复蛋白在时间和空间上的招募动态分析，以及这些蛋白与细胞周期标志物的共定位研究。

本方案可成功对类器官中的细胞核DNA损伤修复蛋白进行染色、成像和定量。该技术被用于在照射前后对患者来源的类器官（PDO）进行染色和评估。PDO接受10 Gy辐射处理，并检测以下生物标志物：ɣ-H2AX（图1），DNA损伤标志物；RAD51（图2），同源重组修复（HRR）标志物；53BP1，非同源末端连接（NHEJ）标志物；RPA，复制应激标志物（图3）；以及geminin，G2/S期细胞周期标志物14。选择10 Gy剂量是基于先前研究卵巢癌中DNA损伤的已发表文献6,22。采用JCountPro软件识别细胞核，并根据图示参数对细胞核内焦点数量进行定量分析13（图4）。该软件首先识别细胞核（<...

本方案描述了在患者来源的卵巢癌类器官中评估DNA损伤修复蛋白的方法。内容包括全面的铺板和染色方法，以及详细且客观的定量分析流程。

可视化患者来源卵巢癌类器官中的DNA损伤修复蛋白 通过 免疫荧光检测

免疫荧光是一种广泛使用的技术，可高灵敏度、高特异性地可视化目标抗原，从而实现准确的……

研究DNA损伤反应对于理解卵巢癌的病理生理学机制以及潜在生物标志物在新型靶向治疗中的应用至关重要。该技术可保持样本完整性，从而能够在其作用位点对抗原进行检测。本方案快速简便，可适用于任何适合免疫荧光检测的抗原。该方法有助于深入了解卵巢癌以及化疗和PARP抑制剂耐药相关的DNA损伤修复过程。这些方法也可应用于涉及3D培养和类器官研究的其他领域。首先，在不破坏3D基质的前提下，吸除经照射并孵育后的类器官中的培养基。然后用 300 微升 PBS 洗涤。用 300 微升 2% 多聚甲醛固定类器官 10 分钟。固定后，用 300 微升染色缓冲液洗涤类器官，并置于摇床孵育 5 分钟。然后轻轻加入 300 微升通透缓冲液，对类器官进行通透处理。孵育 20 分钟后，移除缓冲液，并用 300 微升染色缓冲液洗涤。将类器官置于摇床中振荡 5 分钟。接下来，加入 300 µL 染色缓冲液以封闭透化步骤。置于摇床孵育 30 分钟，然后用移液器吸除染色缓冲液。随后加入 300 µL 用染色缓冲液稀释的一抗。在4°C孵育16小时。孵育结束后，移除一抗溶液。在摇床中用300微升染色缓冲液洗涤三次，每次五分钟。加入300 µL用染色缓冲液稀释的二抗溶液，在避光条件下孵育1小时。1小时后，吸去二抗溶液，加入300 µL稀释的DAPI溶液。置于摇床孵育5分钟。在摇床上用 300 微升染色缓冲液洗涤三次，每次五分钟。移除染色缓冲液，并使用腔室载玻片配套的拆除试剂盒分离腔室。剪去 P200 移液器吸头的尖端，用其将封片介质加入每个含有类器官贴壁的孔中，确保完全覆盖。将盖玻片覆盖在样本上，注意避免产生气泡。取透明指甲油涂抹于盖玻片四周，以密封玻片。静置一小时使其硬化，然后置于 20 摄氏度环境中。使用63倍油镜的共聚焦显微镜采集图像。根据本实验方案，对患者来源的卵巢癌类器官在辐照前后进行DNA损伤修复蛋白染色，并检测包括γH2AX（DNA损伤标志物）和RAD51（同源重组修复标志物）在内的生物标志物。此外，还利用该技术检测了RPA（复制应激标志物）、53BP1（非同源末端连接标志物）以及Geminin（G2/S期细胞周期标志物）。BME 凝胶容易发生去聚合，因此在固定和吸液后需密切注意。分析抗原以确定类器官的损伤情况以及启动 DNA 损伤应答的能力，有助于评估化疗耐药性。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

通过免疫荧光测定 可视化 患者来源的卵巢癌类器官中的 DNA 损伤修复蛋白

本视频介绍了一种利用免疫荧光染色法在结肠癌细胞系中检测辐射诱导的DNA修复灶的实验方案。DNA修复蛋白会在DNA损伤位点被激活；因此，我们可以使用特异性抗体对其进行检测，并在荧光显微镜下观察其定位。...

评估DNA损伤灶：利用免疫荧光染色法鉴定癌细胞系中辐射诱导的DNA损伤灶

在本视频中，我们介绍了免疫荧光方法，用于观察经辐射处理的细胞核中DNA双链断裂位点处DNA修复蛋白γH2AX和53BP1的定位情况。...

基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

中子混合束在硼中子俘获治疗（BNCT）中的应用所引发的辐射诱导DNA损伤应答尚未完全阐明。本方案提供了一步一步的操作流程，用于在中子混合束辐照后，通过免疫荧光染色法检测人结肠癌细胞系中DNA修复蛋白的辐射诱导焦点（RIF）。...

人结肠癌细胞中DNA损伤与修复灶的免疫荧光成像

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

患者来源的类器官（PDO）是一种三维（3D）培养体系，可在体外模拟肿瘤微环境。in vitro。在高级别浆液性卵巢癌中，PDO...

高级别浆液性卵巢癌患者来源类器官的建立与培养

本文介绍了一种基于免疫荧光的方法，用于定量细胞中单链DNA的水平。该方法高效且可重复，可用于检测复制应激，而复制应激是多种卵巢癌的常见特征。此外，该检测方法可与自动化分析流程兼容，进一步提高其检测效率。...

利用单链DNA免疫荧光法量化卵巢癌细胞中的复制应激

我们介绍了一种可用于利用患者来源的卵巢癌类器官进行药物疗效测试的实验方案。...

用于临床前药物测试的卵巢癌患者来源类器官模型

本方案为从不同疾病阶段建立卵巢癌类器官提供了一个系统性框架，并针对患者个体差异带来的挑战，提高了类器官的得率，实现了稳定且长期的扩增，以满足后续应用需求。方案涵盖了组织处理、接种、培养基条件优化以及免疫荧光染色等详细操作步骤。...

卵巢癌类器官生物样本库构建策略：应对不同组织学亚型及疾病阶段间的患者间异质性

彗星试验是一种检测DNA损伤（包括单链和双链DNA断裂）的有效方法。我们描述了碱性和中性彗星试验，用于检测癌细胞中的DNA损伤，以评估化疗的治疗效果。...

评估 体外 使用彗星试验检测DNA损伤

了解免疫荧光技术用于卵巢癌类器官中DNA损伤修复蛋白的可视化与定量分析。该方法有助于研究化疗及PARP抑制剂耐药机制，为靶向治疗提供重要依据。

可视化患者来源卵巢癌类器官中的DNA损伤修复蛋白通过免疫荧光检测

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