肺源性样本中微血管和大血管内皮细胞的分离与纯化

本方案适用于从组织样本或极小的血管片段中分离内皮细胞。该技术的主要优势在于其可在任何研究实验室中重复操作，并且即使从非常小的样本中也能获得较高纯度的内皮细胞。首先准备肺实质样本，将收集的样本置于含有不含氯化钙和氯化镁的磷酸盐缓冲液（即无钙无镁 PBS）的 50 毫升离心管中进行洗涤。

将样本转移至无菌培养皿中，使用手术剪手动剪切成约三到四毫米的小片段。对于动脉段，先将收集的样本在含有无钙镁 PBS 的 50 毫升离心管中清洗，然后转移至无菌培养皿中，无需剪切。为去除大部分残留血液，用无钙镁 PBS 对剪碎的肺实质或肺动脉段清洗两次。

接下来，将样品放入15毫升离心管中，加入5毫升II型胶原酶，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10分钟。为去除大块碎片，将孔径为1毫米的无菌滤网置于50毫升收集管上方，然后将15毫升管中的全部内容物倒入滤网中。随后，用刮勺轻轻揉搓消化后的组织，再用不含钙镁离子的PBS冲洗样品，直至收集管充满液体。

为了去除非血管内皮细胞，先用70微米孔径的细胞筛网将消化后的细胞悬液过滤至一个新的50毫升离心管中。然后使用40微米孔径的细胞筛网，将滤液收集到另一个标记为1号管的新50毫升离心管中。在室温下以30 ×g离心5分钟，使细胞团沉淀。

使用无菌移液管将上清液转移至新标记为2号管的50毫升离心管中。重悬1号管中的沉淀，并用无钙镁的PBS补至50毫升。同样，用无钙镁的PBS将2号管补至50毫升。

完成后，在室温下以 300 G 离心样品 5 分钟。用 2 毫升培养基重悬沉淀，并将悬液接种至预编码的 6 孔板中的两个独立孔中。观察发现，部分处理后的细胞聚集体（包括平滑肌细胞或 SMCs 以及成纤维细胞）与长纤维结合。

此外，SMC 构成了非血细胞单细胞中的主要部分。这些细胞形成小而致密的细胞簇，直径不超过 10 至 20 微米，且不含可归因于间质组织碎片的成分。获得了约 70% 纯度的人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）单细胞。

在获得纯化的HLMVEC细胞时，分选后的细胞呈现出典型的内皮样形态。通过焦点显微镜观察显示，脂肪组织中纯化出的细胞几乎100%表达内皮细胞抗原，即CD31以及更具特异性的血管性血友病因子（von Willebrand factor）。当这些细胞接种于Matrigel中时，能够形成管状结构，其表现与HUVECs一致，证实了其内皮细胞表型。

由于酶消化过程中的孵育时间较短，因此预先加热胶原酶非常重要。另一个要点是在细胞簇沉降过程中，应小心地移除上清液，避免触碰到沉淀中的细胞聚集体。该操作基于离心和过滤技术，因此可能为根据细胞的特性（如大小和聚集状态）分离其他类型细胞提供新的思路。