利用基于阻抗的实时细胞分析技术监测病毒感染下人脐静脉内皮细胞的变化

该方案能够持续检测病毒感染过程中以某些形态学变化形式出现的瞬时效应，例如贴壁细胞的脱落和漂浮。该方案提供了一种无创且劳动强度低的方法，用于连续监测细胞形态学变化，并捕捉终点检测法可能遗漏的瞬时效应，如血管渗漏。如果细胞为贴壁细胞，该方案可用于不同实验条件下其他细胞系的血管完整性变化分析。

制备好 HUVECs 后，通过双击桌面上的图标启动 RTCA 软件程序。在登录窗口中输入用户名和密码。将一个 96 孔 RTCA 电阻板放入细胞培养孵育箱内的 RTCA 仪器中，确保 A1 孔朝向内侧。

然后进入 RTCA 软件的实验记录选项卡，输入实验名称、设备序列号和设备类型。在 RTCA 软件的细胞选项卡下的布局选项卡中，选中所有孔，右键单击所选孔，确保所有孔均已启用。接下来，打开 RTCA 软件的程序设置选项卡。

单击步骤_1，将扫描次数设置为10，间隔设置为30秒。然后单击软件左上角的“开始连续”以启动验证运行。运行结束后，打开细胞索引选项卡以检查数据。

所有细胞指数值均应小于 0.063。然后按照文中的描述，在细胞指数标签页的下半部分检查原始扫描数据中是否存在重复数值的模式。要完成验证运行，请单击“plate”（平板），然后选择“release plate”（释放平板）。

从RTCA工作站中取出96孔RTCA电阻板。为获得RTCA的背景读数，用每孔60 µL的HBSS将涂有I型胶原的特制金微电极板洗涤两次。弃去残留的HBSS，每孔加入50 µL细胞外基质。

然后将培养板放入细胞培养孵育箱中的RTCA仪器内，A1孔朝向内侧。在RTCA软件的实验备注（exp notes）标签页中，输入实验名称、设备序列号和设备类型。进入RTCA软件的细胞（cell）标签页，选择布局（layout）标签。

选中要使用的孔，并右键单击已选中的孔，确保所有孔均已启用。然后转到 RTCA 软件的实验计划选项卡。单击 Step_1，然后单击左上角的“开始”或“继续”，以获取背景读数。

现在，该培养板已准备好用于细胞接种并从RTCA工作站中取出。随后，在金微电极板中每孔加入50微升预处理培养基，接种1×10⁴个HUVEC细胞。将培养板放回位于细胞培养孵育箱中的RTCA工作站内，使A1孔朝向内侧。

然后在软件的“时间表”选项卡中，单击左上角的“添加步骤”。单击 Step_2，将扫描次数更改为 601，间隔更改为两分钟，然后单击应用。

单击步骤_2，然后单击软件左上角的“开始”或“继续”。孵育20小时后，当孔图选项卡中的细胞指数值呈现平台期时，即可进行感染。在RTCA软件的计划选项卡中，单击中止步骤。

现在可以将培养板从RTCA仪器中取出。为感染HUVECs，从-80摄氏度冰箱中取出Zika病毒储备液。在1.5毫升离心管中，用无血清的细胞外基质稀释Zika病毒储备液，以获得0.1和1的感染复数。

接下来，弃去每个孔中的条件培养基，用60微升HBSS沿孔壁冲洗每个孔。从最高稀释度到最低稀释度，沿孔壁向孔中加入40微升稀释后的病毒样本。将培养板置于含5%二氧化碳的37摄氏度细胞培养孵箱中孵育，以使病毒吸附。

每15分钟轻轻旋转培养板五次，以使病毒在整个细胞单层中充分吸附。孵育1小时后，从最低浓度到最高浓度依次移除并弃去病毒悬液。用60毫升HBSS洗涤感染的细胞两次。

用添加了2%胎牛血清（FBS）的细胞外基质覆盖各孔。对于阳性对照孔，将凝血酶用添加了2% FBS的细胞外基质稀释至20单位/毫升，并使用孔的侧壁加入含凝血酶的细胞外基质培养基覆盖各孔。现在点击“计划”标签，并在左上角添加一个步骤。

转至步骤_3，将扫描次数修改为 3、601，间隔修改为两分钟。单击应用，然后在弹出的窗口中单击确定。将感染的专用金微电极板以 A1 孔朝内的方式放入位于培养孵育箱中的 RTCA 仪器中。

最后，单击 Step_3，然后单击软件左上角的“开始继续”。与阴性感染对照相比，以0.1感染复数（MOI）感染寨卡病毒P6-740的HUVECs细胞指数值在感染后15小时开始下降。以较高剂量的寨卡病毒P6-740（MOI为1）感染的HUVECs细胞指数在感染后11小时即出现下降。

感染后24小时，当内皮细胞的感染复数分别为0.1和1时，标准化细胞指数值分别下降了5%和7%。感染后96小时和66.75小时，当感染复数分别为0.1和1时，标准化细胞指数值分别降低了50%。标准化细胞指数值在感染后107小时达到最低点，当感染复数分别为0.1和1时，其值分别减少了51%和60%。

归一化的细胞指数值从感染后107小时开始直至感染后168小时实验结束，分别增加了4%和13%。每次RTCA实验前，必须使用96孔RTCA板进行电阻验证运行，以确保每个生物传感器均能正常工作，从而产生可靠的细胞指数值。