Name: 使用基于阻抗的实时细胞分析监测病毒感染后人脐静脉内皮细胞的变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 了解基于阻抗的实时细胞分析技术，用于监测病毒感染后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的形态学变化。该方法可非侵入性地连续检测细胞脱落和血管渗漏等瞬时效应，为研究血管完整性提供重要见解。

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本研究获得了马来西亚高等教育 Ministry 在高等学府卓越中心（HICoE）项目（MO002-2019）下的支持，以及长期研究资助计划（LRGS MRUN 第一阶段：LRGS MRUN/F1/01/2018）的资助。

1. 细胞准备
<ol>
	<li>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的制备
	<ol>
		<li>将7.5 × 105个HUVEC细胞/mL接种于一个75 cm2的细胞培养瓶中（培养瓶预先用20 µg/mL I型胶原蛋白包被），加入12 mL内皮细胞培养基（ECM），培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、0.01%内皮细胞生长补充剂（ECGS，含有培养HUVEC所需的生长因子、激素和蛋白质）以及0.01%青霉素-链霉素（P/S）。将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养孵育箱中培养（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RTCA 实验的设置
<ol>
	<li>在 RTCA 上进行电阻验证运行
	<ol>
		<li>双击桌面上的 RTCA 软件 图标以启动应用程序。登录窗口将出现，输入用户名和密码进行登录。</li>
		<li>将一个&#160;96 孔 RTCA 电阻板（A1 孔朝内）放入细胞培养孵育箱中的 RTCA 站内。</li>
		<li>在 RTCA 软件的 实验备注（Exp Notes） 选项卡中，输入实验名称、设备序列号（SN）和设备类型（QC 板）。</li>
		<li>在 RTCA 软件的 细胞（Cell） 选项卡下的 布局（Layout） 选项卡中，选中所有孔，右键单击所选孔，确保所有孔均已开启（呈灰色）。</li>
		<li>在 RTCA 软件的 时间表（Schedule） 选项卡中，点击 Step_1。输入 扫描次数：10，间隔：30 秒。点击 应用（Apply）。点击软件左上角的 开始/继续（Start/Continue） 以启动验证运行。 
		注意：通过观察页面底部是否显示&#34;板已扫描。连接正常&#34;，确认各孔与 RTCA 站的连接正常。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于数据分析的电阻验证运行
	<ol>
		<li>在 细胞指数（Cell Index） 选项卡中，运行完成后检查数据。所有 CI 值应小于 0.063。</li>
		<li>在 细胞指数（Cell Index） 选项卡的下半部分，检查原始扫描数据。原始扫描数据应呈现以下重复数值模式：40.0 ± 2.0（A 和 H 行）、67.5 ± 2.5（B 和 G 行）、93.6 ± 2.9（C 和 F 行）、117.6 ± 3.2（D 和 E 行）。</li>
		<li>要停止验证运行，请点击 板（Plate）&#62; 释放板（Release Plate）。此时，96 孔 RTCA 电阻板可从 RTCA 站中取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 RTCA 上获取背景读数
	<ol>
		<li>用 60 µL/孔的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS；含碳酸氢钠，不含氯化钙和硫酸镁）清洗经 I 型胶原蛋白包被的特制金微电极板（以 20 µg/mL I 型胶原蛋白包被）2 次。</li>
		<li>弃去残留的 HBSS，每孔加入 50 µL ECM。将含有 ECM 的特制金微电极板（A1 孔朝内）放入细胞培养孵育箱中的 RTCA 站内。</li>
		<li>在 RTCA 软件的 实验备注（Exp Notes） 选项卡中，输入实验名称、设备序列号（SN）和设备类型（96 孔板格式）。</li>
		<li>在 RTCA 软件的 细胞（Cell） 选项卡下的 布局（Layout） 选项卡中，选中将要使用的孔，右键单击所选孔，确保所有孔均已开启（呈灰色）。</li>
		<li>在 RTCA 软件的 时间表（Schedule） 选项卡中，点击 Step_1，然后点击软件左上角的 开始/继续（Start/Continue） 以获取背景读数。 
		&#8203;注意：通过观察页面底部是否显示&#34;板已扫描。连接正常&#34;，确认各孔连接正确。</li>
		<li>获取背景读数后，特制金微电极板即可用于接种细胞，并可从 RTCA 站中取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在特制金微电极板中准备 HUVEC 细胞
	<ol>
		<li>在特制金微电极板中，每孔加入 50 µL 条件培养基，接种 HUVEC 细胞（1 × 104 个细胞/孔）（条件培养基：ECM 添加 10% FBS、0.01% ECGS 和 0.01% P/S）。将板放回 RTCA 站中（A1 孔朝内），在 37 °C、5% CO2 的细胞培养孵育箱中过夜培养。 
		注意：使用血细胞计数板对细胞悬液进行细胞计数，稀释倍数为 2。</li>
		<li>在 时间表（Schedule） 选项卡中，点击左上角的 添加步骤（Add a Step）。点击 Step_2，将扫描次数（Sweeps）改为 601，间隔（Interval）改为 2 分钟。点击 应用（Apply）。再次点击 Step_2，然后点击软件左上角的 开始/继续（Start/Continue）。</li>
		<li>培养 20 小时后，当 孔图（Well Graph） 选项卡中的 CI 值趋于平稳，表明板已准备好进行感染。在 RTCA 软件的 时间表（Schedule） 选项卡中，点击 中止步骤（Abort Step）。</li>
		<li>此时，特制金微电极板可从 RTCA 站中取出，用于后续步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. HUVECs 中的病毒感染
<ol>
	<li>病毒稀释
	<ol>
		<li>将ZIKV病毒原液保存在-80 °C条件下。本研究中，取出冻存于冻存管中的病毒原液，在1.5 mL离心管中用无血清ECM培养基稀释，以获得0.1和1的感染复数（MOI）。 
		注：ZIKV病毒原液此前已在Vero细胞中扩增，并收集ZIKV上清液制备而成34。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞单层感染
	<ol>
		<li>移除并弃去每孔中的条件培养基（含10% FBS、0.01% ECGS和0.01% P/S的ECM培养基）。每孔用60 µL HBSS洗涤两次。加样时沿孔壁加入HBSS，避免直接冲击细胞单层。</li>
		<li>按照从高浓度到低浓度的顺序，将40 µL稀释后的病毒样品加入各孔中。每个稀释度设三个复孔，并保留六个未感染孔（阴性对照和凝血酶阳性对照）。加样时避免直接冲击细胞单层，应沿孔壁加入稀释后的病毒液。每次加样均使用新的移液器吸头。 
		&#8203;注：选择凝血酶作为阳性对照，因其可快速增加HUVEC的内皮通透性。</li>
		<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育，以促进病毒吸附。每隔15分钟轻轻晃动培养板5次，确保病毒在整个细胞单层中均匀吸附。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>覆盖细胞培养基的添加
	<ol>
		<li>孵育1小时后，从最低浓度到最高浓度依次移除并弃去病毒悬液。</li>
		<li>用60 µL HBSS洗涤感染细胞两次。向各孔中加入含2% FBS的ECM培养基作为覆盖层。对于阳性对照孔，将凝血酶用含2% FBS的ECM培养基稀释至20 U/mL，并将含凝血酶的ECM培养基覆盖于孔中。加样时避免直接冲击细胞单层，应沿孔壁加入覆盖培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将感染后的特制金微电极板重新放回RTCA仪器
	<ol>
		<li>在计划选项卡中，点击左上角的添加步骤。点击Step_3，并将扫描次数（Sweeps）设置为&#160;3,601，时间间隔（Interval）设置为&#160;2分钟，然后点击应用。</li>
		<li>在弹出的窗口中点击确定。将感染后的特制金微电极板（A1孔朝内）放入位于细胞培养箱内的RTCA仪器中。</li>
		<li>点击Step_3，然后点击软件左上角的开始/继续。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析与数据导出
<ol>
	<li>添加每个孔的实验信息
	<ol>
		<li>在 布局 选项卡中，点击 细胞 选项卡（图 2A）。为输入目标细胞信息并确定每个孔的孔类型，请先选中该孔，然后在软件底部输入目标细胞名称、编号和颜色。点击 应用（图 2B）。</li>
		<li>在 细胞 选项卡中，为选择并确定每个孔的孔类型，请先选中该孔，选择 孔类型（样本、阳性对照或阴性对照），然后点击 设置。</li>
		<li>在 布局 选项卡中，点击 处理 选项卡（图 2C）。为输入处理信息，请先选中该孔，然后输入处理名称、处理浓度、单位和颜色。点击 应用（图 2D）。</li>
		<li>在 处理 选项卡中，为选择并确定每个孔的孔类型，请先选中该孔，选择 孔类型（样本、阳性对照或阴性对照），然后点击 设置。 
		注意：对于每次选择，可同时选中多个孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CI 值的归一化
	<ol>
		<li>在 数据分析 选项卡右侧单击右键，从 Y 轴 下拉框中选择 归一化细胞指数（图 3A）。在底部的 X 轴 区域，选择归一化时间作为取出专用金微电极板进行感染前的最后一个测量时间点（图 3B）。 
		注意：只要所选的归一化时间点位于病毒和/或处理添加之前，软件执行的归一化过程即可消除由于不同孔之间接种和贴壁差异带来的大部分变异性。因此，最佳归一化时间点应为添加病毒和/或处理之前的最后一个时间点。可在 步骤_2 下的 时间表 选项卡中查看用于归一化的时间点。所显示的总时间即为归一化的时间点（图 3C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 RTCA 软件绘制获得的数据
	<ol>
		<li>在 数据分析 选项卡中，通过选中目标孔并点击 << 添加，将所需孔添加至图表中。此时，归一化的细胞指数随时间变化的曲线图已准备就绪，可进行复制和导出。请确保勾选 平均值 复选框。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 RTCA 软件导出数据
	<ol>
		<li>在 RTCA 软件的左上角，点击 平板 &#62; 导出实验信息…。勾选要导出的数据。点击 确定。 
		注意：当勾选 细胞指数 &#62; 全部 时，可导出原始数据（原始 CI 值）。</li>
		<li>选择保存导出文件的文件夹。点击 保存。将弹出一个窗口，提示正在导出实验信息。导出完成后，另一个窗口将提示导出的实验信息已准备就绪，可供查看。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

容许性细胞中的杀细胞病毒感染通常伴随着细胞形态和生物合成的显著变化36。病毒诱导的细胞形态学改变，例如细胞皱缩、细胞肿大和/或合胞体形成，也被称为细胞病变效应（CPEs），是某些病毒感染的特征性表现37。在内皮细胞（ECs）中，CPE表现为细胞破坏以及相邻内皮细胞之间紧密连接的断裂，从而导致内皮屏障功能的破坏38,39。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，CPE可表现为单层细胞从培养容器表面脱离并漂浮。感染引起的细胞形态变化，例如贴壁细胞的脱离和漂浮，可通过实时细胞分析（RTCA）方法持续检测。该技术基于电学阻抗原理，可实现对细胞的实时监测，频率可达每数秒一次。该方法可用于定量分析细胞增殖和形态变化，对于HUVECs而言，还可用于监测刺激后内皮完整性及细胞屏障功能的变化40。
在本研究中，关键步骤是实验设置，其中使用了96...

内皮细胞（ECs）排列在所有血管和淋巴管的内表面，通过黏附连接、紧密连接和间隙连接相互连接，形成血液或淋巴液与周围组织之间的半透性屏障。1,2完整的内皮细胞间连接对于调控大分子、溶质和液体的转运至关重要，而这种调控对相应组织和器官的生理活动具有重要作用。3内皮屏障具有动态性，并受特定刺激的调节4内皮屏障功能的破坏或丧失是多种疾病在急性和慢性炎症发生发展过程中疾病病理生理学的显著特征。5,6,7，包括病毒感染8,9,10,11对于黄病毒而言，研究发现非结构蛋白NS1能够改变内皮细胞的通透性，例如 通过 由于组织蛋白酶L、唾液酸酶和内源性肝素酶的表达增加及其活化，导致内皮糖萼样层遭到破坏9在疾病状态下，内皮单层结构的完整性受到破坏，细胞间连接发生紊乱，可能导致内皮损伤和功能障碍12 最终导致多个器官系统的广泛病理性表现13,14病毒感染内皮细胞（ECs）可导致细胞信号通路和细胞基因表达谱的改变，进而可能影响液体屏障功能，引起内皮细胞层破坏，并诱导血管渗漏。10,15. 发现寨卡病毒（ZIKV）感染内皮细胞（ECs）会破坏连接完整性，导致血管通透性改变并引起内皮屏障功能障碍，从而造成血管渗漏10,15研究表明，寨卡病毒（ZIKV）与严重的出生缺陷相关；然而，目前对该病毒导致这些缺陷的具体机制尚不清楚16,17因此，了解感染过程中内皮屏障的变化对于理解疾病机制至关重要。
内皮细胞目前被用作重要的实验模型 体外 用于多种生理和病理过程的血管模型系统18,19,20,21人脐静脉内皮细胞（HUVECs）被广泛用作一种原代、非永生化的细胞体系，用于研究血管内皮及血管生物学 体外22,23,24,25人脐静脉内皮细胞（HUVECs）首先被分离出来用于 体外 20世纪70年代初从人脐带脐静脉中进行的培养26人脐静脉内皮细胞（HUVECs）具有类似鹅卵石的形态，在实验室中易于增殖。当细胞长期维持在汇合状态时，由于受到剪切应力的影响，可观察到细胞形态发生伸长。HUVECs的特征包括存在魏贝尔-帕拉德小体（Weibel-Palade bodies, WPB）、吞饮小泡、核周少量纤丝、呈管状且极少分支的线粒体、椭圆形细胞核，其内染色质呈细颗粒状凝集，以及每个细胞核中含有1至3个核仁。27尽管人脐静脉内皮细胞（HUVECs）具有多种形态学特征，仅通过光学显微镜观察仍无法确切鉴定HUVECs。通常采用血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）免疫荧光染色等检测方法，用于监测HUVECs中的血管完整性28,29,30,31.
本研究描述了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）感染的实时细胞分析（RTCA）方案。RTCA系统采用特殊镀金微孔板，其内含微电极，可为细胞附着提供导电表面。当细胞附着于微电极表面时，会形成阻碍电子通过微电极的屏障。通过测量微电极产生的阻抗，可以获得有关某些细胞过程的信息，包括细胞附着、增殖和迁移32。所报道的检测方法是一种基于阻抗的细胞检测技术，结合实时细胞分析仪，能够以非侵入性和无标记的方式连续监测活细胞的增殖、形态变化（如细胞收缩）以及细胞附着质量。在本研究中，实时细胞分析仪用于监测寨卡病毒（ZIKV）感染期间HUVECs的内皮完整性和形态学变化。简而言之，该仪器通过测量在培养基（导电溶液）存在下，特制镀金微电极微孔板中传输的电子流来工作。细胞黏附或细胞数量及形态的变化会干扰电子流，引起阻抗变化，这些变化可被仪器捕获（补充图1）。HUVECs在ZIKV感染前后生长、增殖和黏附的差异通过电信号阻抗实时记录，并转化为细胞指数（CI）值。感染前的CI值用作CI值归一化的基线。CI值的变化反映了感染引起的细胞形态改变或细胞黏附能力的丧失33。研究结果表明，与终点检测方法（如VE-钙黏蛋白免疫荧光染色）相比，RTCA方案能够检测病毒感染过程中短暂的效应或细胞形态变化。RTCA方法可用于分析其他病毒感染引起的HUVEC血管完整性变化。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>巢</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;37°C 培养箱，含 5% CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>抗生素溶液 青霉素-链霉素（P/S）</td><td>Sciencell</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂（ECGS）</td><td>Sciencell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞培养基（ECM）</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>安捷伦科技公司</td><td>05232368001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sciencell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Laboroptik LTD</td><td>纽鲍尔改进</td><td></td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVECs）</td><td>Sciencell</td><td>8000</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>ZEISS</td><td>TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Latitude 3520 笔记本电脑</td><td>戴尔&amp;nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（10 - 100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（30 - 300 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>塔森斯</td><td>T38-524090</td><td></td></tr><tr><td>RTCA 96孔电阻板</td><td>安捷伦科技公司</td><td>05232350001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Software Pro（版本 2.6.1）</td><td>安捷伦科技有限公司</td><td>5454433001</td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（10 - 100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（100 - 1000） &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器（20 - 200 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence 实时细胞分析仪 SP（型号：W380）</td><td>安捷伦科技有限公司</td><td>00380601030</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232</td></tr></tbody></table>

利用基于阻抗的实时细胞分析技术监测病毒感染下人脐静脉内皮细胞的变化

Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis

内皮细胞排列在所有血管和淋巴管的内表面，形成一种半透性屏障，调节血液或淋巴液与其周围组织之间的液体和溶质交换。病毒穿越内皮屏障的能力是促进其在人体内播散的重要机制之一。已有许多研究表明，多种病毒在感染过程中会改变内皮通透性，和/或导致内皮细胞屏障功能破坏，从而引发血管渗漏。本研究描述了一种实时细胞分析（RTCA）方案，利用商用的实时细胞分析仪，监测寨卡病毒（ZIKV）感染人脐静脉内皮细胞（HUVECs）过程中内皮完整性和通透性的变化。ZIKV感染前后记录的阻抗信号被转化为细胞指数（CI）值并进行分析。该RTCA方案能够检测病毒感染期间以细胞形态变化形式出现的瞬时效应。该检测方法也可用于其他实验条件下HUVECs血管完整性的研究。

在感染寨卡病毒（ZIKV）之前，培养于特殊金微电极包被的微量培养板上的 HUVEC 单层细胞所记录的细胞指数（CI）高于 8，表明细胞具有较强的黏附特性。细胞指数低于 8 的培养板或孔应予以弃用。随后，将 HUVECs 以 0.1 和 1 的感染复数（MOI）感染 ZIKV，并连续记录 7 天的细胞阻抗。以 MOI 为 0.1 感染 ZIKV P6-740 的 HUVECs（浅蓝色线）的 CI 值在感染后 15 小时（HPI）开始下降，相较于阴性感染对照组（棕色线；图 4）。而对于以较高剂量 ZIKV P6-740（MOI = 1，蓝色线）感染的 HUVECs，CI 值早在 11 HPI 即开始下降。在 24 HPI 时，当内皮细胞以 MOI 0.1 和 1 感染 ZIKV 时，归一化 CI 值分别下降了 5% 和 7%（0.949，0.929）。在 MOI 为 0.1 和 1 时，分别于 96 HPI 和 66.75 HPI 记录到归一化 CI 值下降 50%。归一化 CI 值在 107 HPI 达到最低点，此时在 MOI 为 0.1 和 1 的 ZIKV 感染下，分别下降了...

本研究描述了一种利用实时细胞分析（RTCA）系统监测人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在病毒感染过程中变化的实验方案。

内皮细胞衬于所有血管和淋巴管的内表面，形成一种半透性屏障，调控液体和溶质的交换……

该方案能够持续检测病毒感染过程中以某些形态学变化形式出现的瞬时效应，例如贴壁细胞的脱落和漂浮。该方案提供了一种无创且劳动强度低的方法，用于连续监测细胞形态学变化，并捕捉终点检测法可能遗漏的瞬时效应，如血管渗漏。如果细胞为贴壁细胞，该方案可用于不同实验条件下其他细胞系的血管完整性变化分析。制备好 HUVECs 后，通过双击桌面上的图标启动 RTCA 软件程序。在登录窗口中输入用户名和密码。将一个 96 孔 RTCA 电阻板放入细胞培养孵育箱内的 RTCA 仪器中，确保 A1 孔朝向内侧。然后进入 RTCA 软件的实验记录选项卡，输入实验名称、设备序列号和设备类型。在 RTCA 软件的细胞选项卡下的布局选项卡中，选中所有孔，右键单击所选孔，确保所有孔均已启用。接下来，打开 RTCA 软件的程序设置选项卡。单击步骤_1，将扫描次数设置为10，间隔设置为30秒。然后单击软件左上角的“开始连续”以启动验证运行。运行结束后，打开细胞索引选项卡以检查数据。所有细胞指数值均应小于 0.063。然后按照文中的描述，在细胞指数标签页的下半部分检查原始扫描数据中是否存在重复数值的模式。要完成验证运行，请单击“plate”（平板），然后选择“release plate”（释放平板）。从RTCA工作站中取出96孔RTCA电阻板。为获得RTCA的背景读数，用每孔60 µL的HBSS将涂有I型胶原的特制金微电极板洗涤两次。弃去残留的HBSS，每孔加入50 µL细胞外基质。然后将培养板放入细胞培养孵育箱中的RTCA仪器内，A1孔朝向内侧。在RTCA软件的实验备注（exp notes）标签页中，输入实验名称、设备序列号和设备类型。进入RTCA软件的细胞（cell）标签页，选择布局（layout）标签。选中要使用的孔，并右键单击已选中的孔，确保所有孔均已启用。然后转到 RTCA 软件的实验计划选项卡。单击 Step_1，然后单击左上角的“开始”或“继续”，以获取背景读数。现在，该培养板已准备好用于细胞接种并从RTCA工作站中取出。随后，在金微电极板中每孔加入50微升预处理培养基，接种1×10⁴个HUVEC细胞。将培养板放回位于细胞培养孵育箱中的RTCA工作站内，使A1孔朝向内侧。然后在软件的“时间表”选项卡中，单击左上角的“添加步骤”。单击 Step_2，将扫描次数更改为 601，间隔更改为两分钟，然后单击应用。单击步骤_2，然后单击软件左上角的“开始”或“继续”。孵育20小时后，当孔图选项卡中的细胞指数值呈现平台期时，即可进行感染。在RTCA软件的计划选项卡中，单击中止步骤。现在可以将培养板从RTCA仪器中取出。为感染HUVECs，从-80摄氏度冰箱中取出Zika病毒储备液。在1.5毫升离心管中，用无血清的细胞外基质稀释Zika病毒储备液，以获得0.1和1的感染复数。接下来，弃去每个孔中的条件培养基，用60微升HBSS沿孔壁冲洗每个孔。从最高稀释度到最低稀释度，沿孔壁向孔中加入40微升稀释后的病毒样本。将培养板置于含5%二氧化碳的37摄氏度细胞培养孵箱中孵育，以使病毒吸附。每15分钟轻轻旋转培养板五次，以使病毒在整个细胞单层中充分吸附。孵育1小时后，从最低浓度到最高浓度依次移除并弃去病毒悬液。用60毫升HBSS洗涤感染的细胞两次。用添加了2%胎牛血清（FBS）的细胞外基质覆盖各孔。对于阳性对照孔，将凝血酶用添加了2% FBS的细胞外基质稀释至20单位/毫升，并使用孔的侧壁加入含凝血酶的细胞外基质培养基覆盖各孔。现在点击“计划”标签，并在左上角添加一个步骤。转至步骤_3，将扫描次数修改为 3、601，间隔修改为两分钟。单击应用，然后在弹出的窗口中单击确定。将感染的专用金微电极板以 A1 孔朝内的方式放入位于培养孵育箱中的 RTCA 仪器中。最后，单击 Step_3，然后单击软件左上角的“开始继续”。与阴性感染对照相比，以0.1感染复数（MOI）感染寨卡病毒P6-740的HUVECs细胞指数值在感染后15小时开始下降。以较高剂量的寨卡病毒P6-740（MOI为1）感染的HUVECs细胞指数在感染后11小时即出现下降。感染后24小时，当内皮细胞的感染复数分别为0.1和1时，标准化细胞指数值分别下降了5%和7%。感染后96小时和66.75小时，当感染复数分别为0.1和1时，标准化细胞指数值分别降低了50%。标准化细胞指数值在感染后107小时达到最低点，当感染复数分别为0.1和1时，其值分别减少了51%和60%。归一化的细胞指数值从感染后107小时开始直至感染后168小时实验结束，分别增加了4%和13%。每次RTCA实验前，必须使用96孔RTCA板进行电阻验证运行，以确保每个生物传感器均能正常工作，从而产生可靠的细胞指数值。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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基于细胞阻抗的病毒存活动力学检测方法

本方案综述了电细胞基底阻抗传感技术，该方法用于记录和分析贴壁细胞的阻抗谱，以定量检测细胞黏附、增殖、运动性以及细胞对药理和毒性刺激的反应。重点强调内皮细胞通透性的检测以及细胞间和细胞-基底相互作用的评估。...

用于定量分析内皮细胞增殖、屏障功能及迁移活性的细胞电阻传感技术

将原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在微流控网络装置中培养至融合状态。展示了内皮细胞连接和F-肌动蛋白的分布，并在单细胞水平实时定量了对三磷酸腺苷（ATP）刺激响应的细胞内钙离子浓度变化和一氧化氮生成情况。...

发育与表征 体外 微血管网络及内皮细胞[Ca2+]i 和一氧化氮的产生

详细介绍了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养、微管生长荧光标记物的瞬时转染、活细胞成像以及间期微管生长动态的自动化分析方案。...

活体人脐静脉内皮细胞中微管动态的高分辨率延时成像与自动分析

本文报告了一种利用实时监测感染细胞的电学阻抗来定量具有感染性的病毒颗粒的实验方案。通过在模拟环境条件的不同理化参数下定量甲型流感病毒的衰减，展示了该方法的一个实际应用。...

利用实时细胞分析监测流感病毒在宿主外的存活情况

本文展示了细胞电学阻抗（CEI）技术作为一种极为简便直接的方法，用于实时研究寨卡病毒在人细胞中的感染与复制过程。此外，CEI检测法还可用于抗病毒化合物的评估。...

基于细胞的电学阻抗平台实时评估寨卡病毒抑制剂

本文报道的 TCID50 检测利用无标记实时阻抗测量技术及系统的病毒学模块，以客观、实时地监测病毒诱导的细胞病变效应（CPE）。该简化检测方法显著减少了人工操作时间，同时支持高通量、定量的动力学 CPE 测量，并实现 TCID50...

一种基于阻抗的简化、无标记实时组织培养半数感染剂量（TCID50）检测法用于病毒滴度自动化定量

了解基于阻抗的实时细胞分析技术，用于监测病毒感染后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的形态学变化。该方法可非侵入性地连续检测细胞脱落和血管渗漏等瞬时效应，为研究血管完整性提供重要见解。

利用基于阻抗的实时细胞分析技术监测病毒感染下人脐静脉内皮细胞的变化

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