气孔发育相关基因的鉴定 通过 表皮表型评分

本文介绍的两种表型分析方法可提供高质量图像，足以用于进行定量表型分析，并展示肽处理引起的表型响应及表皮细节。因此，这两种方法可用于研究表皮细胞的排列模式与发育过程。这两种方法操作相对简便且可靠，无需使用任何有毒化学试剂或广泛用于表皮表型分析的表皮组织片段。

然而，这些技术较为复杂，需要经过专门培训。首先，从培养皿中生长均匀的幼苗中，用镊子仔细选择并切下其中一片子叶，以减少实验变异。将每片子叶放入含有1 mL固定液的微量离心管中，并在室温下固定过夜。

移除固定液，加入1毫升70%乙醇。倒置离心管数次，将含有样本的离心管在室温下放置约30分钟。随后分别使用1毫升50%乙醇和20%乙醇重复此步骤。

将1 mL 20%乙醇替换为1 mL蒸馏水，轻轻倒置含有子叶样品的离心管数次，静置约30分钟。移除管中所有蒸馏水，立即加入约200 µL甲苯胺蓝O（Toluidine Blue O）或TBO染色液，染色约2分钟。尽可能彻底地去除TBO染色液，然后立即加入1 mL新鲜蒸馏水洗涤样品数次。

在超净工作台中，小心地将两个已准备好的培养皿中各自10至12株一天龄的拟南芥幼苗移植到一个24孔板中，每孔含有1.5毫升的½ MS液体培养基。向每孔幼苗中加入50毫摩尔的Tris-HCl缓冲液，或两种不同浓度的多肽溶液，这些幼苗均在½ MS琼脂平板上萌发而成。使用移液器将幼苗与缓冲液或含多肽的溶液轻轻混匀，并用微孔胶带密封培养板。

将检测板在长日照条件下于 22 摄氏度孵育 5 至 7 天。从盖玻片的孔中取出幼苗，解剖幼苗的子叶。用镊子将子叶的远轴面朝上放置，并将其切成小块。

取另一张干净的载玻片，在其上滴加一滴碘化丙啶溶液。用镊子将一片子叶小块放入液滴中，轻轻盖上盖玻片。在盖玻片边缘追加碘化丙啶溶液，以去除形成的气泡。

使用共聚焦显微镜观察子叶的远轴面，并将图像与在仅含缓冲液的1/2 MS培养基中生长的幼苗图像进行比较。此处展示了三种拟南芥基因型（野生型、STOMAGEN沉默系以及epf1 epf2突变体）10日龄幼苗的子叶远轴面图像。其中，STOMAGEN沉默系代表气孔数量较少的基因型，而epf1 epf2突变体代表气孔数量较多的基因型。

用于表皮表型定量分析的代表性子叶表皮图像来自10日龄野生型、tmm突变体以及携带雌二醇诱导型epf2或epf1过表达构建体的转基因株系。本图展示了在缓冲溶液中培养六至七天的野生型和epf2子叶表皮的代表性共聚焦图像，以及使用两批不同epf2多肽处理的epf2子叶表皮的共聚焦图像。进行此操作时，应确保从已与其他幼苗生长一致的单株幼苗上切下一枚子叶。

同时选择不接触MS培养基的幼苗，以减少变异。还需注意，每个微量离心管中放置的子叶不得超过五片。此外，应轻轻弹击离心管，使TBO染料在子叶周围均匀分布，从而实现良好染色。

考虑到肽溶液中存在多种结构肽，该生物测定方法对于鉴定肽的正确折叠形式及其生物活性形式和生物学功能将非常有用。