利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

因此，前体细胞通过与环境相互作用来维持组织稳态。利用本方案，我们可以开始理解成纤维细胞如何影响食管前体细胞的行为。该共培养系统采用首先分离的细胞，以模拟正常的食管前体细胞微环境。

成像前对类器官进行透明化处理，可实现对细胞间相互作用及类器官形态的分析。该方法可应用于人食管类器官，例如利用来自健康个体或癌症患者的材料。

通过这一过程，我们可以深入了解与癌症相关的成纤维细胞的特定功能。上皮细胞与间质细胞的分离对于获得可存活的类器官至关重要。消化不足会导致细胞得率低，而消化过度则会降低细胞活力和类器官形成能力。

首先，使用解剖显微镜和镊子机械去除食管的外肌层。用一对镊子夹住已解剖食管的远端，用另一对镊子夹住并从食管的远端向近端方向拉拽肌肉层。去除并弃去肌肉层。

为纵向切开食管，需握住食管一端，并将显微解剖弹簧剪的球状头插入管腔内，以防止组织损伤。在握住食管一端的同时进行剪开操作，随后将其放入1.5毫升微量离心管或24孔板中。将打开的食管浸入含有0.5毫克/毫升嗜热菌蛋白酶（thermolysin）的HBSS溶液中，于37°C在摇床振荡器上孵育15分钟。

从嗜热菌蛋白酶溶液中取出食管后，小心分离食管上皮与间质。将上皮层和间质层分别转移至两个含有 200 微升 HBSS 解离液的 1.5 毫升微量离心管中，并置于冰上。使用锋利的手术刀切碎食管上皮，并用 200 微升解离液从培养皿中收集切碎的组织。

将其转移至1.5毫升微量离心管中。加入800微升新鲜解离液，将含有剪碎上皮层的离心管置于37摄氏度摇床中孵育60分钟。每隔15分钟，使用200微升移液器枪头将溶液上下吹打约20次。

将基质层放入含有 200 微升解离液的 1.5 毫升离心管中，用解剖剪将其剪成细小碎片，再加入 800 微升新鲜解离液。将离心管置于 37 摄氏度的摇床上震荡 30 分钟。基质层溶液孵育 30 分钟后，上皮层溶液孵育 60 分钟后，用移液器将溶液上下吹打 20 次。

将基质层溶液通过70微米细胞滤筛，上皮层溶液通过40微米细胞滤筛，分别收集到新的1.5毫升微量离心管中。在4摄氏度下以300×g离心10分钟，使用1毫升移液器吸除上清液。将沉淀重悬于200微升抗体混合液中。

将混合物转移至流式细胞术检测管后，在4摄氏度下孵育细胞30分钟。加入3毫升1%FBS，再次离心5分钟。然后将细胞重悬于至少200微升的1%FBS中。

在流式分选前五分钟，加入按1至10,000比例稀释的死细胞染料标记物，以分离活细胞。将分选后的上皮细胞和成纤维细胞按1:2的比例在离心管中混合。在300 ×g条件下离心5分钟后，用200微升移液器小心移除上清液。

通过将细胞沉淀重悬于冷的基礎類器官培養基中，清洗細胞一次，並再次離心五分鐘。將細胞置於冰上，用200微升移液器小心吸除上清液。按每拱形結構加入10微升基質混合液重懸細胞，並將離心管放回冰上。

从37摄氏度培养箱中取出预热的48孔板，每孔制备一个基质胶圆顶。使用20微升移液器，向含有类器官共培养物的基质胶圆顶中加入200微升预热的ER低培养基，向仅含有上皮类器官的相应基质胶圆顶中加入ENR培养基。将该培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。

前两天，在培养基中添加10 µM的ROCK抑制剂。移除类器官培养基，并向基质小滴中加入200 µL冰浴PBS。将培养板置于冰上5至10分钟后，用移液器吹打数次，然后将溶液转移至0.6 mL的非黏附性离心管中。

以100 × g离心30至60秒，使类器官沉降至管底。去除上清液后，向管中加入预冷的PBS缓冲液，再次离心30至60秒。参照前述方法去除多余液体，随后在冰上用200 µL冰冷的含4%多聚甲醛的PBS溶液固定类器官，固定时间为30分钟。

将试管直立放置，使类器官沉降，然后去除甲醛。加入500 µL冷的PBS以洗去残留的甲醛。去除多余的PBS后，加入500 µL封闭缓冲液。

将试管置于摇床上，室温孵育60分钟。弃去封闭缓冲液，加入200 µL含一抗的封闭缓冲液重悬类器官。再次将类器官置于摇床上，4°C过夜孵育。

移除一抗混合液，加入 500 微升含 0.02% Triton X-100 的 PBS 溶液，在室温下洗涤类器官 60 分钟。重复此步骤三次。随后移除洗涤缓冲液，加入 200 微升溶于封闭缓冲液中的荧光标记二抗，在 4 摄氏度下孵育过夜。

使用含 0.02% Triton X-100 的 PBS 重悬类器官，随后加入 500 微升 PBS 洗涤。去除所有多余液体后，向类器官中加入 10 微升透明化溶液，在室温下孵育 15 分钟。在显微镜载玻片上放置一个厚度为 0.05 毫米的双面粘性四孔间隔垫。

将含有类器官的10微升透明溶液加入一个孔中，并在间隔层上方放置盖玻片。使用共聚焦显微镜系统采集图像。食管前体细胞根据其高表达的整合素β4和E-钙黏蛋白进行分选。

上图所示为上皮细胞分离的代表性流式细胞术图，显示了所有单细胞中活细胞所占的百分比。此处展示了从所有活细胞中分离出的整合素β4和E-钙黏蛋白前体细胞所占的百分比。此处所示流式细胞术图表示分离得到的DPP4+和血小板源性生长因子受体α阳性成纤维细胞所占的百分比。

与表达Pdgf受体α H2B EGFP阳性的成纤维细胞共培养的类器官的明场图像显示了细胞核的EGFP信号。此处展示了第6天整个基质圆顶的明场图像。该图示化图像展示了类器官的形成效率。

每个点代表一个基质小滴，条形线段表示每种条件下所有点的平均值。此处展示了第6天类器官与血小板源性生长因子受体α阳性成纤维细胞共培养的明场和荧光图像。共培养类器官的全 mount 图像显示了类器官的三维表面，其中波形蛋白阳性的成纤维细胞包裹并紧密接触类器官。

对单培养和共培养的类器官与血小板源性生长因子受体α阳性成纤维细胞进行整体染色，可揭示出不同的基底层和基底上层细胞群体。类器官的形成效率及其大小均受到共培养中所加入成纤维细胞的影响。当使用不同的成纤维细胞亚群时，预期会出现差异和不同结果。

相同的策略可用于表征小鼠和人类中与肿瘤相关的成纤维细胞。