Name: 使用类器官共培养物对食管成纤维细胞进行功能表征和可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 了解食管类器官与成纤维细胞共培养技术，用于研究干细胞微环境相互作用及肿瘤相关成纤维细胞功能。该方法结合整体成像技术，为食管癌生物学研究提供重要模型。

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本研究由欧洲研究理事会启动基金（ERC StG TroyCAN，编号851241）资助。E.E. 是瑞典癌症基金会博士后研究员。M.G. 是拉格纳·瑟德贝里研究员及瑞典癌症基金会青年研究者。我们感谢卡罗林斯卡学院各核心设施提供的技术支持，包括生物医学中心流式细胞术核心设施、生物医学中心影像核心设施（BIC）以及比较医学生物医学中心（KMB）动物实验中心。我们感谢Genander实验室成员对本实验方案的仔细审阅和评论。

本研究的动物实验已获得斯德哥尔摩北部动物实验伦理委员会批准（伦理许可编号 14051-2019）。动物饲养条件符合欧洲实验动物科学协会联合会的建议，保持无病原体环境。
1. 准备
<ol>
	<li>将用于解离的酶解储存液（参见材料表）置于冰上解冻。将一份生长因子减少型（GFR）基底膜基质（基质）在 4 °C 条件下解冻。</li>
	<li>配制培养基。使用表1中所述的培养基用于类器官培养和共培养，并在开始本方案前预先配制好。</li>
</ol>
2. 食管上皮与间质的分离与解剖
注意：确保用于解剖和组织处理的所有器械均为无菌状态。每三段食管使用 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）配制 2 mL 消化液（见材料表）。
<ol>
	<li>选用合适的小鼠品系，例如 C57BL/6J 小鼠。小鼠食管的发育在出生后第 70 天（p70）后完成，因此建议使用年龄大于 p70 的小鼠。13使用四到五只小鼠，因其可提供足够的材料以建立8-10个类器官共培养体系。 
	注意：类器官形成效率随小鼠年龄增长而降低。如果关注特定的成纤维细胞亚群，较低的成纤维细胞得率可能会限制可建立的类器官共培养体系的数量。</li>
	<li>使用基因修饰的（例如，PdgfrαH2BeGFP）或野生型（WT）小鼠以分离成纤维细胞群体。使用野生型小鼠时，需进行抗体染色以从间质中分离特定的成纤维细胞亚群 通过 FACS</li>
	<li>通过 CO 处死小鼠2 窒息处死。使用镊子和解剖剪解剖食管。为完整取出食管，需在胃上方直接切断食管远端，并在气管起始处切断近端。将食管浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于冰上。</li>
	<li>使用解剖显微镜（总放大倍数范围为8x-40x）和镊子机械去除肌层。用一对镊子夹住已解剖食管的远端，用另一对镊子夹住并从远端向近端拉动肌肉层，将其从食管上剥离。去除并丢弃肌肉层。</li>
	<li>纵向切开食管。建议使用带球头的显微解剖弹簧剪，以避免组织损伤。固定食管一端，将弹簧剪的球头插入食管管腔，固定该端的同时沿食管纵向剪开。</li>
	<li>将食管置于1.5 mL微量离心管或24孔板中。在摇床中，于37 °C条件下，用含有0.5 mg/mL嗜热菌蛋白酶的HBSS溶液孵育打开的食管15分钟。确保食管完全浸没在嗜热菌蛋白酶溶液中。 
	注意：所用嗜热菌蛋白酶溶液的体积取决于孔或管的尺寸。多个食管可置于同一孔或管中并完全浸没。</li>
	<li>从嗜热菌蛋白酶溶液中取出食管。在解剖显微镜下小心地将食管上皮与间质分离。用精细镊子夹住组织的上皮侧和间质侧，缓慢地将其拉开，以分离两层。 
	注意：基质呈白色不透明状，与透明的上皮组织形成对比。基质包含固有层和黏膜下层。</li>
	<li>将上皮层和间质层分别转移至两个含有200 µL HBSS消化液的1.5 mL微量离心管中，置于冰上。</li>
</ol>
3. 食管前体细胞的分离
注意：食管前体细胞的分离（步骤2）和成纤维细胞的分离（步骤3）可同时进行。准备一管含有1% FBS的HBSS溶液（1% FBS），容量为50 mL。
<ol>
	<li>将分离的食管上皮组织从1.5 mL微量离心管（步骤2.8）转移至洁净的培养皿中，使用锋利的手术刀进行切碎。用200 µL解离液收集培养皿中的切碎组织，并将其重新转移回1.5 mL微量离心管中。 
	注意：当组织碎片能够使用200 µL移液枪头重新吸入1.5 mL微量离心管时，表明上皮组织已充分切碎。</li>
	<li>向1.5 mL微量离心管中加入800 µL新鲜解离液，使总体积达到1 mL。 
	注意：加入足量的解离液至关重要。每处理一至三条食管，建议使用1 mL解离液。若同时处理更多食管，应按比例增加体积。</li>
	<li>将装有切碎上皮层的离心管置于37 °C摇床上振荡60分钟。每隔15分钟，使用200 µL移液枪头将溶液上下吹打约20次，以促进消化。</li>
	<li>60分钟后，再次使用200 µL移液枪头将溶液上下吹打20次。将溶液通过40 µm细胞筛滤入新的1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以300 × g离心10分钟。 
	注意：在过滤前，先用1% FBS润湿细胞筛，以减少细胞在滤膜上的黏附。此时上皮组织不会完全消化，仍可见组织碎片。延长孵育时间会降低细胞存活率，且不会提高活细胞的得率。</li>
	<li>用1 mL移液枪吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL 1% FBS中，在4 °C下以300 × g离心10分钟。
	<ol>
		<li>离心过程中，准备用于食管前体细胞FACS&#160;的偶联抗体混合液。</li>
		<li>每一百万个细胞，将1 μL&#160;CD324-PE-Cy7（ECADHERIN）和CD104-A647（INTEGRIN-β4）加入200 μL 1% FBS中混匀。 
		注意：1 µL抗体（终体积200 µL）足以处理一至两条食管。若同时处理更多食管，应相应增加抗体染色液的体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于200 µL抗体混合液中，并转移至流式管中。加入荧光抗体后，将细胞悬液避光保存，以防荧光信号淬灭。在4 °C孵育30分钟。加入3 mL 1% FBS，在4 °C下以300 × g离心10分钟，然后将细胞重悬于至少200 µL 1% FBS中。 
	注意：处理四至五条食管时，可使用500 µL 1% FBS。若同时处理更多食管，应增加体积，以达到100–300个事件/秒的FACS流速。过高的事件数/秒会降低分选效率，而流速增加则会降低细胞存活率。</li>
	<li>在FACS分选前5分钟，加入死细胞染料标记物，使其终浓度为1:10,000，以分离活细胞。使用FACS仪器对前体细胞进行分选（参见图1中的设门策略）。将分选出的细胞收集至装有200 µL基础类器官培养基（表1）的1.5 mL微量离心管中。</li>
</ol>
4. 从基质层中分离成纤维细胞
<ol>
	<li>使用解剖剪在含有200 µL消化液（步骤2.8）的1.5 mL离心管中将黏膜下层组织剪成细小碎片。当溶液可用200 µL移液枪头反复吹打时，表明组织已充分剪碎。</li>
	<li>向1.5 mL微量离心管中加入800 µL新鲜消化液，使总体积达到1 mL。 
	注意：加入足量的消化液非常重要。每处理一至三条食管建议使用1 mL消化液。若同时处理更多食管，应按比例增加体积。</li>
	<li>将离心管置于37 °C摇床上振荡30分钟。15分钟后，使用200 µL移液枪头将溶液上下吹打约20次，以促进组织消化。</li>
	<li>酶消化30分钟后，再次使用200 µL移液枪头将溶液上下吹打20次。通过70 µm细胞滤网将液体过滤至新的1.5 mL微量离心管中，在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。 
	注意：过滤前用1% FBS润湿细胞滤网，以减少细胞在滤膜上的黏附。</li>
	<li>用1 mL移液枪吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL 1% FBS中，在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。 
	注意：若使用携带荧光标记成纤维细胞的基因修饰小鼠品系，则抗体染色为可选步骤。如无需抗体染色，可直接进行步骤3.7，并将样本转移至流式管中。
	<ol>
		<li>在离心过程中，准备用于FACS分离成纤维细胞的偶联抗体混合液。每一百万个细胞，在200 µL 1% FBS中加入1 µL CD26-APC（DPP4）。 
		注意：1 µL抗体足以处理一至两条食管。若同时处理更多食管，应相应增加抗体染色液的体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将沉淀重悬于200 µL含偶联抗体的1% FBS混合液中，并转移至流式管。在4 °C条件下孵育30分钟。</li>
	<li>加入3 mL 1% FBS，在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。将细胞重悬于至少200 µL 1% FBS中。 
	注意：对于四至五条食管，使用500 µL 1% FBS。若同时处理更多食管，应增加体积，以达到每秒100–300个事件的流速。过高的事件速率会降低分选效率，而提高流速则会降低细胞存活率。加入荧光抗体后，细胞悬液应避光保存，以防信号淬灭。</li>
	<li>在FACS分选前5分钟加入死细胞染料标记物，终浓度为1:10,000，以分离活细胞。使用FACS仪器进行细胞分选（参见图1中的设门策略）。将分选出的细胞收集至含有200 µL基础类器官培养基（表1）的1.5 mL微量离心管中。</li>
</ol>
5. 食管类器官的建立与培养
注意：提前将ERlow（类器官共培养）、ENR（类器官）培养基（培养基描述见表1）以及48孔板置于37 °C预热。将步骤1中制备的解冻基质分装后置于冰上。建议&#160;在小鼠食管类器官培养中使用此处提供的基质（见材料表），因为其他品牌的基质会对类器官形成效率产生不利影响。
<ol>
	<li>进行类器官共培养时，在离心管中按1:2的比例混合分选后的上皮细胞和成纤维细胞。每个基质滴使用5,000个上皮细胞和10,000个成纤维细胞。若需制备多个基质滴，则在同一个离心管中加入5,000个上皮细胞和10,000个成纤维细胞的倍数。对于不含成纤维细胞的类器官培养，每个基质滴使用5,000个上皮细胞。</li>
	<li>将混合细胞以300 × g 离心5分钟。用200 µL移液器小心吸弃上清液。</li>
	<li>用预冷的基础类器官培养基重悬细胞沉淀进行一次洗涤，然后以300 × g 离心5分钟。将细胞置于冰上。</li>
	<li>配制由80%基质和20%预冷的基础类器官培养基组成的混合液。将所有试剂置于冰上，因为基质在室温（RT）下会凝固。</li>
	<li>离心后，用200 µL移液器小心吸弃上清液。将细胞重悬于10 µL基质混合液/基质滴中，并放回冰上。</li>
	<li>从37 °C培养箱中取出预热的48孔板，使用20 µL移液器在每孔中加入一个基质滴。每个基质滴包含10 µL的80%基质、5,000个上皮细胞和10,000个成纤维细胞。将培养板倒置后转移至培养箱，在37 °C下继续孵育20–30分钟，使基质滴完全凝固。 
	注意：基质滴体积减少和/或细胞数量增加会影响类器官形成效率。</li>
	<li>向含有类器官共培养物的基质滴中加入200 µL预热的ERlow培养基（表1），向仅含上皮类器官的相应基质滴中加入ENR培养基（表1），然后将培养板放入培养箱中。</li>
	<li>在37 °C和5% CO2条件下培养类器官。前2天，在培养基中添加10 µM的Rho激酶抑制剂（Y-27623）。Rho激酶抑制剂可防止应激诱导的细胞死亡，提高类器官培养成功建立的概率。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基。确保培养基预热，以防止温度敏感性基质发生解离。</li>
	<li>接种后6至8天进行实验分析。类器官可在培养中维持长达14天。大约第14天时，可观察到基质滴完整性的丧失。</li>
</ol>
6. 类器官传代
注意：共培养中生长的类器官在传代过程中会导致成纤维细胞丢失。因此，建议在传代时对所有类器官使用 ENR 培养基。将 ENR、PBS 和 48 孔板在 37 °C 下预热。
<ol>
	<li>移除培养基，并用预热的 PBS 洗涤含有基质半球的孔。加入 200 µL 冷的 0.25% 胰蛋白酶溶液，上下吹打以破坏基质半球。 
	注意：推荐使用冷的 0.25% 胰蛋白酶，因为该基质对温度敏感，低温有助于分解基质半球。</li>
	<li>将类器官与胰蛋白酶在 37 °C 下孵育约 20 分钟。孵育 10 分钟后上下吹打，以促进类器官解离。每 5–10 分钟在显微镜下观察解离过程。由于胰蛋白酶会降低细胞活力，此步骤有助于确定最佳解离时间。</li>
	<li>20 分钟后，使用 200 µL 移液枪上下吹打类器官以实现解离。将细胞收集至 1.5 mL 微量离心管中，加入 1 mL 基础类器官培养基，于室温下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>可选步骤：为确保最佳类器官生长条件，并使新形成的类器官来源于单个细胞，可通过预先润湿的 40 µm 细胞筛过滤细胞。过滤细胞悬液可去除难以解离的类器官核心和细胞团块。</li>
	<li>配制含有 80% 基质和 20% 冷的基础类器官培养基的基质混合液。将所有试剂置于冰上，因为该基质在室温下会凝固。</li>
	<li>用 200 µL 移液枪小心吸弃上清液，将细胞重悬于 10 µL 基质混合液/半球中，并将混合物放回冰上。 
	注意：可根据半球密度将类器官以 1:5 至 1:10 的比例传代。上皮细胞也可计数后以每半球 5,000 个细胞重新接种。</li>
	<li>从 37 °C 培养箱中取出预热的 48 孔板，每孔制作一个半球。将板倒置放入培养箱中，在 37 °C 下继续孵育 20–30 分钟，使半球完全凝固。</li>
	<li>向相应的类器官半球中加入 200 µL 预热的 ENR 培养基。前 2 天需在培养基中添加 10 µM 的 Rock 抑制剂（Y-27623）。</li>
	<li>每 2–3 天更换一次培养基。确保培养基处于预热状态，以防止温度敏感的基质发生解离。</li>
</ol>
7. 类器官整体染色的处理
注意：使用前需用含10% FBS的PBS溶液润洗枪头和离心管，以防止类器官黏附于塑料器皿表面。对于移液枪头，使用前在10% FBS/PBS溶液中上下吹吸一至两次即可；对于离心管，先用10% FBS/PBS溶液充满管体，随后弃去溶液。
<ol>
	<li>移除类器官培养基，向基质圆顶中加入 200 µL 冰冷的 PBS。将培养板置于冰上孵育 5–10 分钟。</li>
	<li>用移液器轻轻吹打数次，将溶液转移至 0.6 mL 非黏附性微量离心管中。短暂离心（30–60 秒，100 × g），使类器官沉降至管底。 
	注意：过度吹打或长时间离心会破坏类器官，干扰成纤维细胞与类器官之间的相互作用。</li>
	<li>吸除多余液体，加入冰冷的 PBS。短暂离心（30–60 秒，100 × g），使类器官沉降至管底。</li>
	<li>吸除多余液体，加入 200 µL 冰冷的含 4% 甲醛的 PBS 溶液，在冰上固定类器官 30 分钟。 
	警告：甲醛具有毒性，必须始终在化学通风橱中操作。操作时必须佩戴腈类手套、护目镜和实验服。</li>
	<li>固定后类器官会自然下沉，无需再进行离心。将离心管直立放置，静置 2–3 分钟使类器官沉降，吸除甲醛溶液，加入 500 µL 冷 PBS 洗去残留甲醛。</li>
	<li>让类器官沉降，吸除多余 PBS，加入 500 µL 新鲜冷 PBS。再次让类器官沉降，吸除多余 PBS，加入 500 µL 封闭缓冲液（含 5% 正常驴血清、1% BSA 和 0.5% Triton X-100 的 PBS 溶液）。将离心管置于摇床上，室温孵育 60 分钟。 
	注意：封闭也可在 4 °C 下过夜（O/N）进行。</li>
	<li>让类器官沉降，吸除封闭缓冲液，将类器官重悬于 200 µL 含一抗的封闭缓冲液中（见材料表）。将样品置于摇床上，4 °C 过夜孵育。 
	注意：为改善核蛋白、低表达蛋白或出现非特异性染色抗体的染色效果，可在 4 °C 延长孵育时间至 1–2 天。将类器官置于摇床上至关重要，可防止其聚集并提高染色效率。</li>
	<li>让类器官沉降，吸除一抗混合液，使用 500 µL 含 0.02% Triton X-100 的 PBS（0.02% Tx）在室温下洗涤 60 分钟。重复三次。 
	注意：若需延长一抗孵育时间，可在 4 °C 下用含 0.02% Tx 的 PBS 过夜洗涤一步。</li>
	<li>让类器官沉降，吸除二抗混合液，加入 200 µL 含荧光标记二抗的封闭缓冲液，4 °C 过夜孵育。加入荧光二抗后，需将样品避光保存，以防荧光信号淬灭。</li>
	<li>让类器官沉降，吸除二抗混合液，使用 500 µL 0.02% Tx 在室温下洗涤 60 分钟。重复三次。</li>
	<li>如需进行核染色，加入 200 µL DAPI 溶液（0.25 µg/mL）对类器官进行复染。将样品置于摇床上，室温孵育 60 分钟。</li>
	<li>让类器官沉降，吸除 DAPI 溶液，加入 500 µL PBS 在室温下洗涤 15 分钟。重复三次。</li>
	<li>让类器官沉降，吸除所有多余液体。向类器官中加入 10 µL 透明化溶液，室温孵育 15 分钟。 
	注意：透明化溶液黏稠，移取前应剪去 20 µL 移液枪头外端。若成像时使用较厚间隔垫片，可适量增加透明化溶液用量。若无需透明化处理，可用封片液替代透明化溶液。透明化溶液可降低成像背景并提高成像深度。</li>
	<li>在载玻片上放置一个 0.05 mm 双面黏附的 4 孔间隔垫片。将含类器官的 10 µL 透明化溶液加入其中一个孔内，然后在垫片上方盖上盖玻片。 
	注意：类器官也可不使用间隔垫片直接封片。使用垫片可保持类器官原有形态，防止其被压扁。</li>
	<li>将载玻片于室温下静置过夜以完成透明化。如需长期保存，应将载玻片存放于 4 °C。使用共聚焦显微镜系统进行成像。</li>
</ol>

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<li>Ohlund, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+inflammatory+fibroblasts+and+myofibroblasts+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).</li>
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<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案建立了一种 体外 用于研究食管上皮细胞与成纤维细胞功能相互作用的模型。
上皮层与间质分离，使得上皮和间质两个区室均可采用优化的解离方案。尽管上皮解离方案已优化，组织团块仍较明显。每15分钟剧烈吹打混悬液，可显著减少团块的数量和大小。其他方案使用胰蛋白酶进一步解离上皮层5,6。此处不建议使用胰蛋白酶或进一步延长解离时间，因为这通常会导致上皮细胞活力下降以及类器官形成效率降低。与上皮组织不同，间质组织易于解离，解离液中孵育30分钟即可获得单细胞悬液，成纤维细胞活力约为90%（图1E）。若在方案中省略上皮-间质分离步骤，将显著延长解离时间，导致成纤维细胞活力下降以及上皮细胞得率降低。此外，在共培养体系建立过程中，将上皮与间质分离可便于分别测定各细胞群体的数量，并可混合来自不同小鼠品系的上皮细胞与成纤维细胞。
研究成纤维细胞在类器官生长中的功能是干细胞生物学中常用的方法 9,10,11,15,16已建立的共培养培养基为添加10%胎牛血清（FCS）的DMEM9,15 或生长因子减少型培养基10,16在本方案中，使用生长因子减少的培养基以模拟体内的条件 体内 干细胞微环境，其中成纤维细胞大多处于静息状态。FCS 是一种富含生长因子的血清，可导致共培养体系中成纤维细胞的活化与增殖，这种状态可能对应于一种不同于 体内 状态。通过去除FCS并减少生长因子，使培养基本身（ER低) 不支持类器官生长，也不促进成纤维细胞增殖，因此可以在该培养基中分离出成纤维细胞对类器官生长的影响。在此培养基中，NOGGIN被去除，RSPO减少至最低水平（10% RPSO）。已有研究证实，NOGGIN和RSPO均对食管类器官的生长至关重要。6EGF 在共培养体系中被保留，因为它本身不能支持类器官生长。然而，成纤维细胞也能够在 EGF 减量的培养基（E低R低; 图2B，D).
类器官共培养物无法通过传代维持，因为在胰酶消化过程中成纤维细胞会丢失。然而，本方案中仍包含了类器官传代步骤，因为食管类器官可作为单层培养物进行维持、扩增，并用于后续实验。来自单层培养物的传代类器官可用于与新分离的成纤维细胞建立共培养体系。使用原代细胞的一个缺点是建立多个类器官共培养体系需要较多数量的小鼠。当研究目标为成纤维细胞中的少数亚群时，所能获得的共培养体系数量将受到限制。在其他方案中，通常先将成纤维细胞在体外扩增后再用于建立类器官共培养体系。10然而，成纤维细胞在传代过程中会发生形态和身份的改变，这一点已通过原代皮肤和心脏成纤维细胞的研究得到证实。17,18传统的食管成纤维细胞二维传代会导致细胞形态和表型的改变，表明 体外 成纤维细胞的富集不适用于旨在模拟内源性干细胞微环境的共培养体系。
整体染色法可用来维持并可视化成纤维细胞与类器官之间的相互作用。需要注意的是，并非所有类器官都会直接附着成纤维细胞，但大多数类器官均与成纤维细胞存在接触（见图2C）。为了维持上皮细胞与成纤维细胞之间的相互作用，在操作类器官时应格外小心，避免剧烈吹打、涡旋振荡以及高速离心。适当的固定对于保持三维组织结构以及内源性荧光信号至关重要。30分钟的固定时间足以保留H2BeGFP信号，并且适用于本实验方案中所使用的抗体；然而，不同荧光染料和抗体的最佳固定条件可能有所差异。类器官的透明化处理可减少光散射，显著改善其完整三维结构的观察效果。由于类器官体积较小，透明化过程简便且快速；但使用激光扫描共聚焦显微镜对整个类器官进行成像可能较为耗时，需要采集多个Z轴堆叠图像。可采用共聚焦显微镜（如转盘式共聚焦显微镜）以缩短成像时间。
总体而言，在成纤维细胞存在条件下培养的食管类器官为研究食管干细胞微环境的某些方面提供了有价值的工具。此外，整体组织透明化技术提供了一种便捷的方法，用于可视化成纤维细胞与类器官之间的相互作用。

类器官被用作三维模型 体外 用于表征干细胞与祖细胞的检测方法，以及用于理解干细胞微环境中的细胞组分所释放的信号提示1,2,3,4小鼠食管类器官最初于2014年被描述，此后多篇研究论文鉴定出维持和传代食管类器官所需的生长因子，如R-Spondin（RSPO）、NOGGIN和表皮生长因子（EGF）。5,6,7，认为类似的信号提示对于 体内 前体细胞的自我更新。然而，生长因子通常以非生理浓度添加，导致类器官的生长条件未必能反映 体内 信号环境.
成纤维细胞是一类异质性的间质细胞群体，在多种干细胞微环境中支持前体细胞特性的维持8将上皮祖细胞与成纤维细胞在相同的类器官培养体系中共同培养，可在较低浓度的外源添加生长因子条件下促进类器官的形成。源自肠道和肝胆上皮的类器官共培养系统是&#160;已有相关描述，但建立食管类器官-成纤维细胞共培养体系的实验方案仍待完善9,10,11.
本方案概述了两种从食管中分离成纤维细胞的荧光激活细胞分选（FACS）策略，分别使用转基因 PdgfrαH2BeGFP 小鼠12 或通过经典抗体染色的野生型小鼠。可通过选择不同的细胞表面标志物分离成纤维细胞的不同亚群，从而为该方案提供了灵活性。此外，采用一种可保持类器官形态的三维荧光成像技术，用于表征成纤维细胞与类器官之间的相互作用。类器官透明化技术可快速增加光在类器官中的穿透深度，改善类器官与成纤维细胞连接的可视化效果，并实现对类器官整体结构的完整再现。本方案结合了食管类器官共培养与整体成像策略，能够对成纤维细胞与类器官的相互作用进行功能表征。

<table><tbody><tr><td>B-27 补充剂（50X），无血清</td><td>赛默飞世尔科技（吉比科）</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>康宁&amp;nbsp;Matrigel&amp;nbsp;生长因子减少型（GFR）基底膜基质</td><td>费舍尔科学</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>赛默飞世尔科技（吉布科）</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技（吉比科）</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙，无镁，无酚红</td><td>赛默飞世尔科技（吉比科）</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>杰克逊免疫</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>赛默飞世尔科技（吉比科）</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 溶液</td><td>默克</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红</td><td>赛默飞世尔科技（吉伯科）</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品、多肽和重组蛋白&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI 溶液</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>消化液：HBSS 中含 0.25 mg/ml Liberase TM 和 0.25 mg/ml Dnase</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>甲醛，37%，含10-15%甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin 小鼠</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td><td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 EGF 蛋白，CF</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin-1 小鼠</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue 死细胞染色</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>嗜热菌蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;塑料 &amp;amp; 玻璃器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>康宁无菌细胞筛，40 μm</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 μm 无菌细胞过滤器</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>门策尔·德克格尔&amp;auml;丝/盖玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal反应管，1.5 mL，聚丙烯</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>低吸附带盖微量离心管 0.6 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost 载玻片</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05 mm 4 圆孔 iSpacer</td><td>SunJin Lab</td><td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子，生物学提示</td><td>F.S.T</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪 侧向倾斜 球头尖端 8 mm 刃口</td><td>F.S.T</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 Stellaris 5&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜 ZEISS Stemi 305</td><td>蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于流式细胞术的偶联抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 抗体&lt;br/&gt; 克隆：346-11A</td><td>123608</td><td>123608</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD26（DPP-4）抗体</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗小鼠/人 CD324（E-钙黏蛋白）抗体</td><td>147310</td><td>147310</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫荧光抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD104&amp;szlig;-integrin 4&lt;br/&gt; 克隆：346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>细胞角蛋白14</td><td>Acris抗体（AbD Serotec）</td><td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>细胞角蛋白13&lt;br/&gt; 克隆：EPR3671</td><td>abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白（CD324）&lt;br/&gt; 克隆：2.40E+11</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>角蛋白5多克隆鸡抗体，纯化&lt;br/&gt; 克隆：Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63&lt;br/&gt; 克隆：4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>重组抗KLF4抗体&lt;br/&gt; 克隆：EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>选择合适荧光标记的驴抗物种*抗体</td><td>杰克逊免疫</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

上皮干细胞和前体细胞在个体一生中参与上皮屏障的形成与维持。大多数干细胞和前体细胞群体位于解剖结构明确的特定微环境中，使其能够与维持干性的小生境信号进行特异性相互作用。尽管上皮类器官培养技术的发展为研究干细胞和前体细胞在稳态与疾病中的作用提供了有力工具，但类器官系统中缺乏完整的小生境微环境，从而限制了对影响干细胞行为因素的鉴定。成纤维细胞在调控上皮干细胞和前体细胞命运中发挥关键作用。本文介绍了一种全面的类器官-成纤维细胞共培养方案，可用于解析成纤维细胞亚群在食管前体细胞更新与分化中的作用。该方案描述了从食管组织中平行分离上皮细胞和成纤维细胞的方法，并详细说明了利用荧光激活细胞分选技术，从转基因报告小鼠或野生型小鼠中分别分离食管前体细胞及成纤维细胞亚群的具体策略。本方案具有良好的可拓展性，可根据需要调整以适应特定成纤维细胞亚群的分离。方案中还包括食管上皮类器官单层培养的建立与传代步骤，便于与共培养系统进行直接比较。此外，还介绍了一种三维透明化方法，可用于对上皮细胞-成纤维细胞相互作用进行精细的成像分析。总体而言，该方案提供了一种可比较且相对高通量的方法，用于鉴定和理解食管干细胞小生境的组成成分

关键词：上皮干细胞，前体细胞，类器官，成纤维细胞，共培养，食管，小生境，细胞分选，三维透明化，荧光激活细胞分选 体外.

食管分为不同的层次：上皮层、固有层、黏膜下层和外肌层（图1A）。成纤维细胞位于黏膜下层和固有层中，这些区域统称为间质。在本方案中，外肌层通过机械方法去除（图1B），该步骤不会导致间质中成纤维细胞（PdgfrαH2BeGFP+）的丢失（图1C）。在组织解离前，上皮层与间质层被分离，形成两个组织片段（图1B）。分离这两层组织可使较坚韧的上皮层接受更长时间的解离处理，而脆弱的间质层则避免过度处理。通过这种方法，建立了一种高效的分离方案，可同时获得有活力的食管上皮前体细胞和间质成纤维细胞（图1B）。食管前体细胞根据其高表达INTEGRIN-β4和E-CADHERIN进行分选（图1C，D）。
可以通过不同的标志物分离成纤维细胞的不同亚群。本方案提供了一种基于常用成纤维细胞标志物PDGFRα和DPP4（CD26）的成纤维细胞分离策略。利用PdgfrαH2BeGFP报告基因表达或DPP4抗体进行分离的结果显示，分离得到的细胞中约有50%为成纤维细胞（图1E、F）。此外，70%的PDGFRα阳性成纤维细胞也表达DPP4，表明所获得的成纤维细胞群体大部分重叠，但并不完全相同。在分离出上皮细胞和基质细胞群体后，食管前体细胞可单独培养，或与成纤维细胞共同培养于基质滴中。为了研究成纤维细胞对类器官形成的作用，共培养体系维持在生长因子减少的培养基中（图1G）。
食管前体细胞在表皮生长因子（EGF）、NOGGIN和RSPO（ENR）存在下可形成类器官。去除NOGGIN并减少RSPO的用量（25 ng/µL；内质网低足以抑制类器官的形成（图2A）。有趣的是，在食管前体细胞的ER中加入DPP4+或PDGFRα+成纤维细胞低 培养基恢复了类器官的形成能力，表明这两种成纤维细胞群体均具有支持功能（图2A-D). Pdgfrα 的可视化H2BeGFP 转基因显示，在类器官形成过程中，成纤维细胞与上皮祖细胞密切接触（图2A）。第6天，PdgfrαH2BeGFP+ 成纤维细胞在共培养体系中仍然大量存在。成纤维细胞分布于整个类器官穹顶结构中，位于类器官附近并与之接触（完整箭头），或直接附着在类器官上（箭头头标）； 图 2D).
整体染色显示了成纤维细胞与类器官相互作用的三维形态（图3）。尽管可以在不使用透明溶液的情况下进行整体染色实验，但这会降低类器官的透明度和激光穿透能力（图3B，z轴视图）。在封片类器官时，间隔垫片有助于维持类器官的形态。相比之下，将盖玻片直接压在类器官上（不使用垫片）会导致类器官压扁，造成类器官结构的丧失（图3A、B）。
DPP4+ 和 PDGFRα+ 成纤维细胞均被发现包裹在类器官周围（图3C, 视频1，和 视频 2）。可使用不同标志物评估食管类器官的分化。 图4 表明所提供的染色方案适用于较易染色的角蛋白（KRT14/13）以及较难染色的转录因子（TRP63/KLF4）。共培养方案所产生的类器官具有相似的分化模式，如所示 体内13,14 在ENR培养基中培养的类器官中同样可见：KRT14+ 或 TRP63+ 祖细胞形成外层，而KRT13+ 或 KLF4+ 分化细胞则朝向内侧排列。
本方案提供了一种研究食管干细胞微环境的工具 体外 并可视化类器官与成纤维细胞之间的相互作用。通过采用基于抗体的成纤维细胞分离方案，该方法具有可适应性，可用于研究成纤维细胞亚群，而无需使用转基因小鼠。
<img alt="使用流式细胞术分析食管横切面中的上皮和间质细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：从食管中分离祖细胞和成纤维细胞亚群。 （A）食管不同层次的示意图。间质包含固有层和黏膜下层。（B）分离方案的示意图。使用镊子机械去除肌肉层（外肌层）；将剩余的食管切开，并在热蛋白酶中孵育，以分离上皮层与间质。随后将上皮和间质分离，机械剪碎，并通过酶消化获得单细胞悬液。解离后的细胞经染色后用于流式细胞分选（FACS）。（C）去除外肌层后的食管横切面，显示间质中存在PdgfrαH2BeGFP+成纤维细胞。整合素-β4（ITGβ4）和E-钙黏蛋白（ECAD）双阳性细胞为食管的上皮祖细胞。比例尺 = 100 µm。（D）上皮细胞分离的代表性流式细胞术图谱，上图显示所有单细胞中活细胞所占百分比；下图显示所有活细胞中分离出的ITGβ4+ ECAD+祖细胞（Prog.）所占百分比。（E）间质细胞分离的代表性流式细胞术图谱，左上图显示所有单细胞中活细胞所占百分比；右上图显示所有活细胞中分离出的DPP4+成纤维细胞（Fibr.）所占百分比；左下图显示所有活细胞中Pdgfrα+成纤维细胞所占百分比；右下图显示70%的Pdgfrα+成纤维细胞同时表达DPP4。（F）间质细胞的代表性流式细胞术图谱，显示仅表达DPP4的细胞（2.5%）、同时表达DPP4和PDGFRα的细胞（37.5%），以及仅表达PDGFRα的细胞（17.7%）。百分比均基于所有活细胞计算。（G）仅上皮细胞被接种于基质滴中，培养基中添加50 ng/µL EGF、100 ng/µL NOGGIN和250 ng/µL RSPO（ENR）；或与成纤维细胞共培养，培养基中添加EGF及低浓度RSPO（25 ng/µL）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="类器官形成、eGFP表达、成纤维细胞影响；显微镜图像、图表、过程分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：类器官共培养的代表性结果。 （A）明场图像显示类器官从第1天到第6天的生长情况。与PdgfrαH2BeGFP+成纤维细胞共培养的类器官明场图像同时显示细胞核eGFP信号。比例尺 = 25 µm。（B）第6天整个基质穹顶的明场图像。左列为在ERlow或ElowRlow培养基中与Pdgfrα+成纤维细胞共培养的类器官。中列为在ERlow或ElowRlow培养基中与DPP4+成纤维细胞共培养的类器官。右列为在ENR培养基中培养的类器官单培养。ENR培养基 = EGF（50 ng/µL）、NOGGIN（100 ng/µL）和RSPO（250 ng/µL）。ERlow = EGF和25 ng/µL RSPO。ElowRlow = 5 ng/µL EGF和25 ng/µL RSPO。比例尺 = 500 µm。（C）显示类器官形成效率（%）（即在不同培养条件下形成类器官的细胞百分比）的图表。每个点代表一个基质穹顶，条形表示每种条件下所有点的平均值。（D）第6天与PdgfrαH2BeGFP+成纤维细胞共培养的类器官的明场和荧光图像。PdgfrαH2BeGFP+成纤维细胞遍布整个穹顶，部分附着于类器官（箭头所示），部分未附着但仍与类器官接触（实心箭头所示）。比例尺 = 250 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞染色方法示意图；三维肿瘤类器官透明化结果；显微成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：用于研究成纤维细胞-类器官相互作用的整体染色方案。（A）整体免疫荧光染色方案的示意图。AB = 抗体。（B）未经透明化处理的整体染色免疫荧光图像，显示其透明度降低，激光穿透能力较透明化类器官差。缺乏间隔垫片会导致类器官压扁，造成类器官形态丢失。（C）共培养类器官的整体染色图像显示类器官的三维表面，VIMENTIN+成纤维细胞（Fibr.）包裹并紧密接触类器官。三维横截面和二维平面图像展示了类器官的管腔结构。比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示单培养和共培养的3D细胞培养示意图；3D和2D条件下的蛋白质表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：整体染色图像揭示了不同的基底层和上基底层细胞群体。（A）单培养和与PdgfrαH2BeGFP+成纤维细胞共培养的类器官整体染色结果，显示外层为KRT14+基底细胞，以及分化的KRT13+上基底细胞。比例尺 = 50 μm。（B）单培养和与PdgfrαH2BeGFP+成纤维细胞共培养的类器官整体染色结果，显示外层为TRP63+基底细胞，以及分化的KLF4+上基底细胞。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：类器官培养基成分说明表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
视频 1：PdgfrαH2BeGFP+ 成纤维细胞包裹并紧密接触类器官。该视频对应于图 3C的上图面板。图 3C中的比例尺为 50 µm，类器官直径约为 120 µm。VIMENTIN 显示为白色，E-CADHERIN 显示为红色，PdgfrαH2BeGFP 显示为绿色，DAPI 显示为蓝色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：DPP4+ 成纤维细胞包裹并紧密接触类器官。 该视频对应于图 3C的下层面板。图 3C中的比例尺为 50 µm，类器官直径约为 120 µm。VIMENTIN 以白色显示，E-CADHERIN 以红色显示，DAPI 以蓝色显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

类器官-成纤维细胞共培养为研究提供了模型 体内 干细胞微环境。本文描述了一种食管类器官与成纤维细胞共培养的方案。此外，采用整体染色成像技术以可视化成纤维细胞与类器官之间的相互作用。

上皮干细胞和祖细胞在个体一生中均参与上皮屏障的形成与维持。大多数干细胞和祖细胞……

因此，前体细胞通过与环境相互作用来维持组织稳态。利用本方案，我们可以开始理解成纤维细胞如何影响食管前体细胞的行为。该共培养系统采用首先分离的细胞，以模拟正常的食管前体细胞微环境。成像前对类器官进行透明化处理，可实现对细胞间相互作用及类器官形态的分析。该方法可应用于人食管类器官，例如利用来自健康个体或癌症患者的材料。通过这一过程，我们可以深入了解与癌症相关的成纤维细胞的特定功能。上皮细胞与间质细胞的分离对于获得可存活的类器官至关重要。消化不足会导致细胞得率低，而消化过度则会降低细胞活力和类器官形成能力。首先，使用解剖显微镜和镊子机械去除食管的外肌层。用一对镊子夹住已解剖食管的远端，用另一对镊子夹住并从食管的远端向近端方向拉拽肌肉层。去除并弃去肌肉层。为纵向切开食管，需握住食管一端，并将显微解剖弹簧剪的球状头插入管腔内，以防止组织损伤。在握住食管一端的同时进行剪开操作，随后将其放入1.5毫升微量离心管或24孔板中。将打开的食管浸入含有0.5毫克/毫升嗜热菌蛋白酶（thermolysin）的HBSS溶液中，于37°C在摇床振荡器上孵育15分钟。从嗜热菌蛋白酶溶液中取出食管后，小心分离食管上皮与间质。将上皮层和间质层分别转移至两个含有 200 微升 HBSS 解离液的 1.5 毫升微量离心管中，并置于冰上。使用锋利的手术刀切碎食管上皮，并用 200 微升解离液从培养皿中收集切碎的组织。将其转移至1.5毫升微量离心管中。加入800微升新鲜解离液，将含有剪碎上皮层的离心管置于37摄氏度摇床中孵育60分钟。每隔15分钟，使用200微升移液器枪头将溶液上下吹打约20次。将基质层放入含有 200 微升解离液的 1.5 毫升离心管中，用解剖剪将其剪成细小碎片，再加入 800 微升新鲜解离液。将离心管置于 37 摄氏度的摇床上震荡 30 分钟。基质层溶液孵育 30 分钟后，上皮层溶液孵育 60 分钟后，用移液器将溶液上下吹打 20 次。将基质层溶液通过70微米细胞滤筛，上皮层溶液通过40微米细胞滤筛，分别收集到新的1.5毫升微量离心管中。在4摄氏度下以300×g离心10分钟，使用1毫升移液器吸除上清液。将沉淀重悬于200微升抗体混合液中。将混合物转移至流式细胞术检测管后，在4摄氏度下孵育细胞30分钟。加入3毫升1%FBS，再次离心5分钟。然后将细胞重悬于至少200微升的1%FBS中。在流式分选前五分钟，加入按1至10,000比例稀释的死细胞染料标记物，以分离活细胞。将分选后的上皮细胞和成纤维细胞按1:2的比例在离心管中混合。在300 ×g条件下离心5分钟后，用200微升移液器小心移除上清液。通过将细胞沉淀重悬于冷的基礎類器官培養基中，清洗細胞一次，並再次離心五分鐘。將細胞置於冰上，用200微升移液器小心吸除上清液。按每拱形結構加入10微升基質混合液重懸細胞，並將離心管放回冰上。从37摄氏度培养箱中取出预热的48孔板，每孔制备一个基质胶圆顶。使用20微升移液器，向含有类器官共培养物的基质胶圆顶中加入200微升预热的ER低培养基，向仅含有上皮类器官的相应基质胶圆顶中加入ENR培养基。将该培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。前两天，在培养基中添加10 µM的ROCK抑制剂。移除类器官培养基，并向基质小滴中加入200 µL冰浴PBS。将培养板置于冰上5至10分钟后，用移液器吹打数次，然后将溶液转移至0.6 mL的非黏附性离心管中。以100 × g离心30至60秒，使类器官沉降至管底。去除上清液后，向管中加入预冷的PBS缓冲液，再次离心30至60秒。参照前述方法去除多余液体，随后在冰上用200 µL冰冷的含4%多聚甲醛的PBS溶液固定类器官，固定时间为30分钟。将试管直立放置，使类器官沉降，然后去除甲醛。加入500 µL冷的PBS以洗去残留的甲醛。去除多余的PBS后，加入500 µL封闭缓冲液。将试管置于摇床上，室温孵育60分钟。弃去封闭缓冲液，加入200 µL含一抗的封闭缓冲液重悬类器官。再次将类器官置于摇床上，4°C过夜孵育。移除一抗混合液，加入 500 微升含 0.02% Triton X-100 的 PBS 溶液，在室温下洗涤类器官 60 分钟。重复此步骤三次。随后移除洗涤缓冲液，加入 200 微升溶于封闭缓冲液中的荧光标记二抗，在 4 摄氏度下孵育过夜。使用含 0.02% Triton X-100 的 PBS 重悬类器官，随后加入 500 微升 PBS 洗涤。去除所有多余液体后，向类器官中加入 10 微升透明化溶液，在室温下孵育 15 分钟。在显微镜载玻片上放置一个厚度为 0.05 毫米的双面粘性四孔间隔垫。将含有类器官的10微升透明溶液加入一个孔中，并在间隔层上方放置盖玻片。使用共聚焦显微镜系统采集图像。食管前体细胞根据其高表达的整合素β4和E-钙黏蛋白进行分选。上图所示为上皮细胞分离的代表性流式细胞术图，显示了所有单细胞中活细胞所占的百分比。此处展示了从所有活细胞中分离出的整合素β4和E-钙黏蛋白前体细胞所占的百分比。此处所示流式细胞术图表示分离得到的DPP4+和血小板源性生长因子受体α阳性成纤维细胞所占的百分比。与表达Pdgf受体α H2B EGFP阳性的成纤维细胞共培养的类器官的明场图像显示了细胞核的EGFP信号。此处展示了第6天整个基质圆顶的明场图像。该图示化图像展示了类器官的形成效率。每个点代表一个基质小滴，条形线段表示每种条件下所有点的平均值。此处展示了第6天类器官与血小板源性生长因子受体α阳性成纤维细胞共培养的明场和荧光图像。共培养类器官的全 mount 图像显示了类器官的三维表面，其中波形蛋白阳性的成纤维细胞包裹并紧密接触类器官。对单培养和共培养的类器官与血小板源性生长因子受体α阳性成纤维细胞进行整体染色，可揭示出不同的基底层和基底上层细胞群体。类器官的形成效率及其大小均受到共培养中所加入成纤维细胞的影响。当使用不同的成纤维细胞亚群时，预期会出现差异和不同结果。相同的策略可用于表征小鼠和人类中与肿瘤相关的成纤维细胞。

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使用类器官共培养物对食管成纤维细胞进行功能表征和可视化

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食管三维筏式培养模型：一种体外培养技术用于构建人食管黏膜模型

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通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境 体外 气道壁模型

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无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

本方案描述了代表肿瘤进展不同阶段的食管类器官模型的建立及其组织学分析。该方法使研究人员能够研究从正常组织向癌变组织转变过程中细胞形态、空间结构以及分子标志物表达模式的变化。...

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本方案描述了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和非肿瘤相关成纤维细胞（CFs）的方法。使用这些来自同一患者的匹配样本可避免个体间差异带来的问题，为ESCC研究提供合适的实验平台。...

从同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及配对正常成纤维细胞

了解食管类器官与成纤维细胞共培养技术，用于研究干细胞微环境相互作用及肿瘤相关成纤维细胞功能。该方法结合整体成像技术，为食管癌生物学研究提供重要模型。

利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

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