使用类器官共培养物对食管成纤维细胞进行功能表征和可视化
January 6th, 2023
类器官-成纤维细胞共培养为研究 体内 干细胞生态位提供了一个模型。这里描述了食管类器官-成纤维细胞共培养的方案。此外，全卡口成像用于可视化成纤维细胞-类器官相互作用。
因此祖细胞与环境相互作用以维持组织稳态。使用该协议，我们可以开始了解成纤维细胞如何影响食管祖细胞的行为。共培养系统首先使用模拟正常食管祖细胞生态位的分离细胞。
在成像前清除类器官可以分析细胞相互作用和类器官形态。该方法可应用于人食管类器官。例如，使用来自健康或癌症患者的材料。
通过这样做，我们可以深入了解癌症相关成纤维细胞的特定功能。上皮细胞和基质细胞的解离对于获得活的类器官至关重要。消化不足会导致细胞产量低，过度消化会降低细胞活力和类器官形成能力。
首先，使用解剖显微镜和镊子机械地去除食道的肌层外侧。用一对镊子握住解剖食道的远端，用其他镊子抓住肌肉并将其从食道远端拉到近端。去除并丢弃肌肉层。
要纵向打开食道，请握住食道的一端，将微解剖弹簧剪刀的球插入腔内，以防止组织损伤。在抓住末端的同时切开食道，并将其放入 1.5 毫升微量离心管或 24 孔板中。将打开的食道浸入 0.5 毫克/毫升热溶酶中 HBSS 中，并在摇臂摇床上以 37 摄氏度孵育 15 分钟。
从热溶素溶液中取出食道后，小心地将食管上皮与基质分开。将上皮层和基质层转移到两个独立的1.5毫升微量离心管中，在HBSS中加入200微升解离溶液，并将它们放在冰上。使用锋利的手术刀切碎食管上皮，并用200微升解离溶液从培养皿中收集切碎的组织。
将其转移到1.5毫升微量离心管中。加入800微升新鲜解离溶液，将带有切碎上皮层的试管放在37摄氏度的摇臂摇床上60分钟。每 15 分钟使用 200 微升移液器吸头上下移液约 20 次。
使用解剖剪刀在含有200微升解离溶液的1.5毫升管中将基质层切成细块，并加入800微升新鲜解离溶液。将试管放在 37 摄氏度的摇臂摇床上 30 分钟。基质溶液孵育30分钟，上皮溶液孵育60分钟后，上下移液20次。
将基质溶液通过70微米细胞过滤器，上皮溶液通过40微米细胞过滤器进入新的1.5毫米微量离心管。在 300G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟，并通过用一毫升移液管去除多余的液体来弃去上清液。将沉淀重悬于200微升抗体混合物中。
将混合物转移到流式细胞术管中后，将细胞在4摄氏度下孵育30分钟。加入三毫升1%FBS，再次离心五分钟。然后将细胞重悬于至少200微升的1%FBS中。
在传真分选前五分钟加入1到10， 000个稀释的死细胞染色标记物以分离活细胞。在管中以一比二的比例混合分选的上皮细胞和成纤维细胞。以300G离心五分钟后，用200微升移液管小心地将其除去，丢弃上清液。
通过将沉淀重悬于冷的碱性类器官培养基中并再次离心五分钟来洗涤细胞一次。将细胞放在冰上，用200微升移液管小心地将其除去，丢弃上清液。将细胞重悬于每个圆顶的10微升基质混合物中，然后将试管放回冰上。
从37摄氏度的培养箱中取出预热的48孔板，每孔制作一个矩阵圆顶。使用20微升移液器向含有类器官共培养物的基质圆顶中加入200微升预热的ER低培养基，向仅包含上皮类器官的相应基质圆顶中加入ENR培养基。将板放入37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。
在前两天，用10微摩尔岩石抑制剂补充培养基。取出类器官培养基，向基质圆顶中加入200微升冰冷的PBS。将板放在冰上5至10分钟后，上下移液并将溶液转移到0.6毫升非粘附管中。
在100G下快速离心30至60秒，让类器官沉淀在底部。去除多余的液体后，将冰冷的PBS加入管中，然后再次离心30至60秒。如前所示去除多余的液体，并在冰上用 200 微升冷的 4% 甲醛在 PBS 溶液中固定类器官 30 分钟。
将管子直立放置，让类器官下沉并去除甲醛。加入500微升冷PBS洗去剩余的甲醛。去除多余的PBS后，加入500微升封闭缓冲液。
将试管在室温下放在摇臂摇床上 60 分钟。取出封闭缓冲液，并将类器官重悬于含有一抗的200微升封闭缓冲液中。将类器官再次放在摇臂摇床上，在四摄氏度下过夜。
除去一抗混合物，并在室温下用500微升0.02%Triton X 100在PBS中洗涤类器官60分钟。重复此操作三次。同样，除去洗涤缓冲液，并在封闭缓冲液中加入200微升荧光偶联二抗，在4摄氏度下过夜。
在PBS中使用0.02%Triton X 100重新洗涤类器官，然后用500微升PBS重新洗涤类器官。除去所有多余的液体后，向类器官中加入10微升的澄清溶液，并在室温下孵育15分钟。将0.05毫米双面粘性四孔垫片放在显微镜载玻片上。
将10微升的澄清溶液与类器官一起加入一个孔中，并将盖玻片放在垫片的顶部。使用共聚焦显微镜系统采集图像。食管祖细胞根据其高集成度的β4和e-钙粘蛋白表达进行分选。
上皮细胞分离的代表性流式细胞术图显示了来自所有单细胞的活细胞的百分比。此处显示了来自所有活细胞的分离整合素β4和e-钙粘蛋白祖细胞的百分比。此处显示的流式细胞术图表示分离的DPP4+和Pdgf受体α阳性成纤维细胞的百分比。
与Pdgf受体α H2 BEGFP阳性成纤维细胞共培养的类器官的明场图像显示核EGFP信号。这里显示了第六天整个矩阵圆顶的明场图像。类器官形成效率由该图形图像表示。
每个点代表一个矩阵圆顶，条形表示每个条件的所有点的平均值。此处显示了第六天类器官与Pdgf受体α阳性成纤维细胞共培养的明场和荧光图像。共培养类器官的整个安装图像显示了类器官的3D表面，其中vimentin阳性成纤维细胞包裹并与类器官紧密接触。
使用Pdgf受体α阳性成纤维细胞对单培养和共培养类器官进行全支架染色，揭示了不同的基底和基底上细胞群。类器官形成效率以及类器官大小受共培养物中包含的成纤维细胞的影响。当使用不同的成纤维细胞亚群时，可以预期的变化和结果。
相同的策略可用于表征小鼠和人类的肿瘤相关成纤维细胞。
概述
本研究开发了食管类器官和成纤维细胞的共培养模型，以模拟体内干细胞微环境。该协议便于研究成纤维细胞对食管祖细胞行为的影响，并利用整体成像技术来可视化共培养中的相互作用。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞-微环境相互作用
- 干细胞微环境动态
- 肿瘤学应用
背景
- 成纤维细胞相互作用在维持组织稳态中的重要性。
- 共培养模型在研究正常和癌症相关成纤维细胞中的应用。
- 通过分析成纤维细胞对祖细胞的影响获得的见解。
使用的方法
- 食管上皮和基质细胞的分离。
- 类器官-成纤维细胞共培养的创建。
- 整体成像技术。
主要结果
- 展示了类器官与成纤维细胞的有效共培养。
- 通过成像突出了形态变化和相互作用。
- 为未来研究癌症相关成纤维细胞效应提供了基础。
结论
- 该研究为理解成纤维细胞和干细胞相互作用提供了有价值的模型。
- 这个共培养系统可以推进食管生物学和肿瘤学的知识。
常见问题
Executive Industry Relevance
Dissecting fibroblast-epithelial interactions in esophageal organoid co-cultures enables mechanistic de-risking of stromal influences on progenitor cell renewal and differentiation. This comparative, high-throughput system supports predictive confidence in target validation and informs early-stage oncology and tissue homeostasis research. The approach provides a reusable platform for interrogating disease-relevant stromal components and their impact on epithelial biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional dissection of fibroblast subpopulations influencing epithelial progenitor fate.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying stromal contributions to stem cell renewal and differentiation.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of niche components in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid-fibroblast co-cultures for downstream quantitative analysis.
- Enables direct comparison of mono-culture and co-culture systems for assay standardization.
- Supports reproducible, scalable workflows for evaluating stromal-epithelial interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling by accommodating both healthy and cancer-associated fibroblasts.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of stromal targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on functional stromal impact.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical model development, supporting target validation and mechanistic studies in esophageal biology and oncology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of fibroblast-driven effects on epithelial progenitors.
- Screening: Delivers quantitative outputs on organoid forming efficiency and size under defined co-culture conditions.
- Analytics: Enables imaging-based readouts and flow cytometry quantification of cell populations.
- Translational Research: Accommodates human and mouse samples, including tumor-associated fibroblasts, for disease-relevant insights.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse stromal subpopulation characterization across model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stromal target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes co-culture and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying stromal contributions to epithelial biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stromal targets in early discovery pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, flow cytometry, and 3D imaging.
- Demands access to confocal microscopy and cell sorting infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of dissociation and co-culture protocols.
- Adaptable to both mouse and human esophageal tissues, including cancer samples.
- Cell viability and yield are sensitive to dissociation conditions and fibroblast subpopulation variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:07
Isolation of Esophageal Progenitor Cells and Fibroblasts
5:02
Establishment and Culture of Esophageal Organoids
6:31
Organoid Processing for Whole Mount Staining
9:22
Results: Isolation of Progenitor Cells and Fibroblast Subpopulations, Organoid Co-Cultures, and Whole-Mount Staining of Fibroblast-Organoid Interactions
11:24
Conclusion
