从新生儿啮齿动物中分离和培养前庭和螺旋神经节 Somata 以进行膜片钳记录

这里介绍的方法提供了从内耳前庭神经节和螺旋神经节神经元解剖、解离、培养和膜片钳记录的详细说明。

在听觉和前庭传入神经元末端发现的许多离子通道和神经递质受体也存在于它们的细胞体中。可以在体外研究分离细胞体的培养物，以了解这些离子通道和受体如何影响神经元的反应。细胞体的紧凑形态允许高质量的电记录，以表征离子通道和神经递质受体的电压依赖性。

此外，易于获得多种细胞类型，可通过对细胞多样性进行物理分析实现高通量。这些程序将由研究生凯瑟琳·雷加拉多（Katherine Regalado）以及我实验室的博士后研究员丹尼尔·布朗森（Daniel Bronson）博士和纳撒尼尔·诺瓦克（Nathaniel Nowak）进行演示。首先，将玻璃牧场移液管放在本生燃烧器的火焰上，以制备用于细胞解离的氚移液器。

玻璃尖端开始熔化后，将玻璃拉伸至所需的尖端直径。将移液器的一端从火焰上拉开，形成一个小弯曲。将弯曲的移液器放在显微镜下。

使用刻痕瓷砖，以所需的直径刻划并打破玻璃。将移液器吸头越过燃烧器火焰的顶部。这将快速抛光尖端附近的粗糙边缘。

使用封闭的手术剪刀舀出安乐死小鼠的大脑。切断并切除颅神经，使大脑与颅骨完全分离。从头部后部开始，用镊子将透明的膜状材料拉出，然后用手术剪刀剪掉颅骨的顶部。

去除头部和颈部后部的多余组织，使解剖区域和耳囊更清洁，更易于取用。将组织转移到装有新鲜L-15溶液的第二个培养皿中。然后定位耳囊和听觉、上、前庭和下前庭神经。

用小弹簧剪刀将上神经节和下神经节分开，切掉听觉神经。使用手术刀轻轻剃掉骨脊，以削弱神经潜入骨囊的骨区域。小心地用手术刀清除碎屑，露出整个肿胀的神经节部分。

使用细弹簧剪刀将神经节与向椭圆囊俯冲的周围神经分支切割并分开。使用细镊子去除上神经节，并将其转移到装有新鲜L-15溶液的35毫米培养皿中。预热酶溶液后，将酶混合物倒入 35 毫米培养皿中，并将其放入 37 摄氏度的培养箱中 10 至 15 分钟。

使用细镊子和小弹簧剪刀清洁神经节，去除骨头、多余的组织、神经纤维和任何其他多余的结构。注意尽量减少任何神经节组织的切除。将清洁的神经节转移到预热的酶溶液中，并将其放回培养箱中 10 至 40 分钟。

然后用新鲜的L-15溶液将神经节转移到35毫米培养皿中。两到三分钟后，将神经节转移到另一个装有过滤培养基的35毫米培养皿中。将约150微升过滤的培养基转移到镀膜的玻璃底培养皿上。

然后，将所需数量的神经节转移到盖玻片上。从培养皿中抽出少量培养基，并用培养基冲洗涕流移液器，以防止组织粘在玻璃移液器的侧面。通过轻轻和反复地将组织通过移液管直到神经节充分解离来研磨。

五分钟后，在光学显微镜下检查细胞是否沉淀在盖玻片上。小心地将培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中 12 至 24 小时。接下来，在将头部一分为二后找到耳囊，并使用镊子切掉边缘将其从颅骨中取出。

耳囊的螺旋部分容纳耳蜗和Corti器官。切掉骨头，用平行于骨骼曲线的细镊子覆盖耳蜗。使用小弹簧剪刀切断耳蜗底部的 modiolus，以将其从耳囊的其余部分释放出来。

用小弹簧剪刀将Corti的器官切成两到三圈，使其平放，然后从每一圈切除modiolus。用细镊子捏住底部的纹，去除血管纹。在螺旋周围展开，一直到顶点，将其从Corti器官中剥离出来。

通过切割螺旋神经节神经元纤维束向毛细胞投射的边缘来去除螺旋神经节，然后如前所述清洁神经节。酶促处理螺旋神经节后，在补充有N 2和B27的培养基中枘化螺旋神经节。将含有解离神经节的培养皿置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中 12 至 24 小时。

将移液管的尖端浸入培养皿的清洁溶液中，以填充不含两性霉素的清洁溶液。用含有两性霉素的内部溶液填充移液器的背面。将移液管的尖端浸入培养皿的干净溶液中，同时两性霉素从移液器背面缓慢进入吸头。

接下来，用两性霉素溶液填充移液器，使其达到移液器的三分之二。将移液器放入记录室的浴槽中，并将移液器吸头定位在视野中间。确保吸头没有气泡或其他碎屑。

将移液器靠近膜并牢固地落在细胞中心。使用注射器或口腔移液器施加负压或抽吸。打开负 60 毫伏的保持电位。

密封电阻应增加，直到它超过千兆欧姆。一旦形成千兆欧姆密封，释放负压。在酪氨酸开始起作用之前，输入电阻缓慢降低，响应于五毫伏电压步进的电流随着两性霉素进入膜而逐渐增加。

下图显示了从前庭神经节神经元诱发的全细胞电流的代表性示例。净内向钠电流在这里通过其瞬时活化和失活来识别。净向外电流主要由钾离子携带，其活化和失活动力学比钠电流慢得多。

超极化激活的环状核苷酸门控电流或HCN电流由一系列长时间的超极化电压激活。在记录过程中，穿孔贴片中离子通道表征的稳定性如图所示。HCN电流的电压相关激活曲线是在穿孔贴片配置中测量的。

该曲线呈 S 形，在长时间的记录中保持稳定。破裂贴片模式的相对不稳定性由不同时间点的非重叠S 形曲线来说明。此处显示了补丁配置破裂期间 HCN 电流的激活曲线。

这里显示了五个前庭神经节体、五个螺旋神经节神经元的放电模式，以及相应的当前步骤。放电模式的这种异质性反映了前庭神经节神经元和螺旋神经节神经元中潜在钠和钾通道组成的基本多样性。为了在此过程中最大限度地提高细胞存活率，请避免形成气泡，不要让组织过度劳累，并在将样品放入培养箱之前让细胞沉淀。

穿孔膜片钳可以研究由胞质第二信使调节的离子通道，这对于研究传出神经递质对神经节神经元的影响至关重要。这些双极神经元的膜片钳记录有助于揭示生物物理多样性如何促进感觉神经元的功能多样性。