Name: 从新生儿啮齿动物中分离和培养前庭和螺旋神经节 Somata 以进行膜片钳记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学习从新生啮齿动物内耳分离前庭神经节和螺旋神经节神经元并进行膜片钳记录的技术。该方法支持体外电生理研究，用于表征听觉和平衡相关神经元的离子通道特性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我们感谢薛 Jing Bing 和 Ruth Anne Eatock 博士对这些方法早期开发所做出的贡献。本研究工作由美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH NIDCD）R03 DC012652 项目、NIH NIDCD DC012653S 项目以及 RK 负责的 R01 DC0155512 项目资助，DB、NN 和 KR 获 NIH T32 DC009975 项目资助。

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+diversity+and+the+organization+of+central+vestibular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways.</a> Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).</li>
<li>Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+set+spike+timing+regularity+of+mammalian+vestibular+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).</li>
<li>Smith, C. E., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stochastic+afterhyperpolarizaton+model+of+repetitive+activity+in+vestibular+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents.</a> Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).</li>
<li>Berglund, A. M., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+innervation+by+spiral+ganglion+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse.</a> The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).</li>
<li>Jagger, D. J., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+type+II+spiral+ganglion+neurones+identified+in+a+neonatal+rat+cochlear+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice.</a> Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).</li>
<li>Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+patterns+of+type+II+spiral+ganglion+neurons+in+vitro%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro).</a> The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).</li>
<li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons%3A+involvement+in+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li>
<li>Mo, Z. L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+firing+patterns+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).</li>
<li>Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity%2C+ontogeny%2C+and+cAMP+modulation+of+the+hyperpolarization-activated+current+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells%3A+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442(2010).</li>
<li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+membrane+conductance+in+the+giant+axon+of+Loligo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo.</a> The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+sodium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+ganglion+17eurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons.</a> Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).</li>
<li>Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential+in+mammalian+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The action potential in mammalian central neurons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).</li>
<li>Izhikevich, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIzhikevich%2C+EM+%22Dynamical+Systems+in+Neuroscience%22">Dynamical Systems in Neuroscience</a>. , MIT Press. (2018).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+depolarization-activated+potassium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).</li>
<li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li>
<li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li>
<li>Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity%2C+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li>
<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+cation+channels%3A+From+genes+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li>
<li>Davis, R. L., Crozier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+firing+properties+of+type+I+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+signaling+complex%3A+Regulation+of+type+I+spiral+ganglion+neuron+responses+in+the+auditory+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery.</a> Hearing Research. 336, 1-16 (2016).</li>
<li>Eatock, R. A., Christov, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEatock%2C+RA+%22Ionic+Conductances+of+Vestibular+Afferent+Neurons%3A+Shaping+Head+Motion+Signals+From+the+Inner+Ear%22">Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear</a>. , Elsevier. (2020).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+in+the+biophysical+properties+of+spiral-ganglion+and+vestibular-ganglion+neurons+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 710275(2021).</li>
<li>Armstrong, C. E., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+frog+saccular+hair+cells%3A+distortion+by+enzymatic+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).</li>
<li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li>
<li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+variations+in+K%2B+currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li>
<li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li>
<li>Liu, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion%3A+NaV1.5%2C+NaV1.8%2C+and+tetrodotoxin-sensitive+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文所述方法专门针对分离神经元的记录；以往的研究主要集中于半离体标本中轴突末梢的记录。与现有的末梢记录技术相比，分离记录具有更优的空间钳制和等电位特性。此外，该方案能够获取更广泛的神经元样本，因为在前庭上皮的半离体记录中仅能获得带有终球样结构的亚群神经元。最后，分离记录允许使用穿孔膜片钳技术，从而避免了全细胞穿破记录中细胞内溶液与胞质之间的透析所常引起的细胞内环境紊乱。
成功的记录首先依赖于分离和培养的神经元胞体的质量。细胞存活的关键步骤在于吹打过程中施加的力度，以获得分离的神经元。轻柔的操作对细胞存活至关重要。吹打时，移液管应置于L-15溶液气泡的上方，避免将神经元强力喷射到培养皿底部。如果出现细胞存活率低的问题，还应格外注意防止产生气泡或破坏液面气泡，以免影响解离后的细胞沉降到盖玻片上。最好准备一系列不同规格的热抛光吹打移液管，以便研究者灵活选择合适口径的移液管，使神经节在通过时仅受到轻微阻力。对移液管进行热抛光可减少神经节在通过玻璃粗糙边缘时造成的损伤。虽然保留粗糙边缘在初期看似更有利于解离神经节，但这种方法会损伤胞体，降低细胞在培养期间的存活率。最后一条建议是：务必妥善保存...

前庭蜗神经的双极神经元将内耳的感觉毛细胞与脑干相连，是传递声音和头部运动信息的主要通路；这些重要细胞的损伤会导致耳聋和平衡障碍。该神经的前庭部分和听觉部分各自包含不同类型的细胞，这些细胞&#160;形态和功能上具有多样性1,2在前庭系统中，两类传入神经亚群以规则或不规则的间隔自发放电2传入神经的动作电位时序被认为反映了离子通道组成在基础水平上的多样性3,4在听觉系统中，螺旋神经节神经元（SGNs）主要有两种亚群；其中I型SGNs与单个内毛细胞形成突触联系5，II 型螺旋神经节神经元接触多个外毛细胞5. 体外 来自半完整制备和器官型培养的记录表明，I型和II型螺旋神经节神经元的膜特性存在差异6,7.
这些神经元末梢存在的许多离子通道和神经递质受体，同样存在于其胞体中。因此，可对分离的前庭神经节和螺旋神经节胞体培养物进行研究 体外 了解离子通道和神经递质受体如何参与这些神经元的反应。分离的细胞体具有紧凑的形态，便于进行高质量的电生理记录，适用于对电压门控离子通道和神经递质受体进行详细表征。可便捷获取多种具有代表性的神经元亚型，有利于对细胞多样性进行高通量分析。
本文介绍了一种从出生后第9至20天（P9至P20）大鼠前庭神经节上部分离并培养离散的神经节细胞胞体的方法。此外，还提供了将这些方法扩展应用于螺旋神经节的建议，以及成功提取、解离和接种神经节细胞所需的操作步骤。这些方法是在多个实验室先前发表的技术基础上发展而来的8,9,10。本文还包含了如何选择健康细胞进行膜片钳记录的技术指导。
最后，本方案概述了采用穿孔膜片钳构型进行膜片钳记录的实验步骤11。尽管穿孔膜片钳构型比常用的全细胞穿破膜片钳构型更耗时且技术难度更高，但它更有利于维持细胞质内环境，从而实现长时间且稳定的记录。本文通过展示穿孔膜片钳记录相较于穿破膜片钳记录在超极化激活阳离子电流稳定性方面的改善，说明了该记录构型的优势。
本方案分为五个部分。第1至第3部分描述了可预先配制并储存的溶液和工具。第4部分描述了前庭器官和螺旋神经节神经元（SGNs）的解剖与接种步骤。第5部分描述了细胞培养一段时间后对神经元进行记录的步骤。在我们的操作中，第4部分和第5部分在连续两天内完成。

<table><tbody><tr><td>两性霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4888-100MG</td><td>用于穿孔膜片钳记录。</td></tr><tr><td>ATP 二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>内液添加剂</td></tr><tr><td>B27 补充剂（50 倍浓缩，无血清）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td>培养基添加剂，用于螺旋神经节神经元</td></tr><tr><td>烧杯（1000、100、10）毫升</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>本生灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td>内液添加剂</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5318</td><td>消化组织的三种酶之一</td></tr><tr><td>盖玻片，矩形，1号厚度，22×40&amp;nbsp;</td><td>华纳仪器</td><td>64-0707</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biotium</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>消化组织的三种酶之一</td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子（钝头）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子（精细型）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子（精细型）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>内液添加剂</td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>Narashige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>落射照明光源&amp;nbsp;</td><td>蔡司&amp;nbsp;</td><td>CL 1500 ECO</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>用于清洁头部及解剖台周围区域</td></tr><tr><td>用于电极的细丝状硼硅酸盐毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF140-117-10</td><td></td></tr><tr><td>精细刃口解剖刀</td><td>精细科学工具</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>用于拉制反复吹打移液管</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16140063</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>用于本方案中所有溶液的pH缓冲</td></tr><tr><td>加热板/磁力搅拌器&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>76549-914</td><td></td></tr><tr><td>装有冰的保温桶</td><td></td><td></td><td>保持所有样品和溶液处于低温状态</td></tr><tr><td>K2SO4，硫酸钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9458-250G</td><td>内液添加剂</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P93333</td><td>内液添加剂</td></tr><tr><td>KOH（1 M）</td><td>霍尼韦尔</td><td>319376-500ML</td><td>调节内液至所需pH值。</td></tr><tr><td>大型弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14133-13</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td>灌流液与浸泡液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>用于培养皿的低剖面浴式记录室</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0236</td><td></td></tr><tr><td>30 ml 鲁尔锁注射器</td><td>BD</td><td>302832</td><td>用于吸取L-15/HEPES/HEPES溶液。</td></tr><tr><td>MEM + Glutamax 补充剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>41-090-101</td><td>培养基底部</td></tr><tr><td>MgCl2·6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>内液添加剂</td></tr><tr><td>用于填充微移液管的microFil针头 - 34号规格&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narashige</td><td>MF-90</td><td>用于电极抛光。</td></tr><tr><td>N2 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502-048</td><td>添加至培养基，用于螺旋神经节神经元（SGN）</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>内液添加剂</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>托马斯科学公司</td><td>319511-500ML</td><td>用于滴定 pH</td></tr><tr><td>渗透压计</td><td>Advanced Instruments Inc.</td><td>3320</td><td></td></tr><tr><td>医用级氧气，配备合适的减压阀和管路</td><td>南加州大学物资管理</td><td>MEDOX200（编号：00015）</td><td>用于溶解于解剖液和灌流液中</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>贝米斯</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管胶头（3 ml）</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td>用于吹打移液管的橡皮球</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>防止培养基污染的添加剂</td></tr><tr><td>基于戊巴比妥的安乐死溶液（例如，Fatal Plus. 50 &amp;ndash; 60 mg/kg 剂量）&amp;nbsp;</td><td>MWI动物健康</td><td>15199</td><td>用于安乐死</td></tr><tr><td>PES 膜过滤器&amp;nbsp; 0.2 微米&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>566-0020</td><td>用于过滤溶液</td></tr><tr><td>PES 膜无菌注射器滤器，0.22 μm，30 mm&amp;nbsp;</td><td>CELLTREAT</td><td>229747</td><td>用于过滤吸入注射器的溶液</td></tr><tr><td>培养皿，35 × 10 毫米</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-103</td><td>用于显微解剖及在穿孔膜片钳配置中盛放尖端浸蘸溶液</td></tr><tr><td>培养皿，60 × 15 mm</td><td>Midland Scientific</td><td>P7455</td><td>用于大体解剖</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Mettler Toledo</td><td>Model S20</td><td></td></tr><tr><td>移液器（1000、200、10）微升</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿</td><td>Mattek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>用于培养神经元的铺板操作</td></tr><tr><td>快速换液平台，带加热底座，适用于35 mm培养皿</td><td>华纳仪器</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>参照细胞</td><td>世界精密仪器公司</td><td>RC1T</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Miltex</td><td>4-315</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>科学天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（10，25）毫升</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅脂套装（用于密封盖玻片和腔室）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0378</td><td></td></tr><tr><td>小型动物断头器</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>小型动物断头器</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td>对于解剖 P15 以上大鼠的断头操作。</td></tr><tr><td>体视解剖显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>直头手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>注射器（3、10、30）毫升</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td>消化组织的三种酶之一</td></tr><tr><td>结核菌素注射器&amp;nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881500105</td><td>通过腹腔注射给予安乐死溶液</td></tr><tr><td>Vannas弹簧剪，2.5 mm刃口</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>1000毫升容量瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋</td><td>VWR</td><td>945300</td><td></td></tr><tr><td>水，无菌超纯，R&gt;18.18 兆欧·厘米（例如，经 Millipore-Sigma 水纯化系统过滤）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CDUFBI001</td><td></td></tr></tbody></table>

从新生啮齿类动物前庭和螺旋神经节分离并培养神经元胞体用于膜片钳记录

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

耳蜗神经节神经元在分离培养后呈现紧凑的形态，便于对参与该细胞群体多样性的离子通道和神经递质受体进行详细表征。本实验方案概述了成功分离、解离并短期培养内耳双极神经元胞体以进行膜片钳记录所需的步骤。文中提供了前庭神经节神经元的详细制备方法，并列出了用于螺旋神经节神经元铺板所需的关键调整。该方案包括采用穿孔膜片钳构型进行全细胞膜片钳记录的操作说明。通过示例结果展示了在电压钳模式下记录超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道介导电流的特性，突显了穿孔膜片钳构型相较于常规破膜膜片钳构型在记录稳定性方面的优势。将分离的胞体与穿孔膜片钳记录技术相结合，可用于研究需要长时间稳定记录并维持细胞内环境完整性的细胞过程，例如G蛋白偶联受体介导的信号传导。

通过施加一系列电压阶跃来运行电压钳制程序，可揭示多种不同电流家族的电压依赖性激活。以下为从前庭神经元（VGN）记录的全细胞电流的代表性示例，数据改编自已发表的记录结果13 如图所示 图1A，B. 施加去极化电压（图1B) 激活一种内向电流（按惯例为负值），该电流激活和失活均非常迅速（图1A）。这典型地反映了电压门控钠通道的特性14,15，主要驱动动作电位的上升支16,17去极化还会激活一种持续时间较长且激活相对较慢的外向电流，这种电流驱动动作电位的下降支。药理学研究显示，这些电流主要由前庭神经节神经元（VGNs）中的多种钾通道介导。<sup cla...

本文介绍了内耳前庭神经节和螺旋神经节神经元的分离、解离、培养以及膜片钳记录的详细实验方法。

耳蜗神经节神经元在分离培养后呈现紧凑的形态，有利于对离子通道和神经递质……进行详细表征

在听觉和前庭传入神经元末梢发现的许多离子通道和神经递质受体，同样存在于这些神经元的胞体中。通过体外培养分离的神经元胞体，可研究这些离子通道和受体如何影响神经元的反应特性。由于胞体形态紧凑，便于进行高质量的电生理记录，从而可表征离子通道和神经递质受体的电压依赖性特性。此外，由于能够便捷地获取多种细胞类型，因此可通过细胞多样性的物理分析实现高通量。本实验操作将由本实验室的研究生凯瑟琳·雷加拉多（Katherine Regalado）以及博士后研究员丹尼尔·布朗森博士（Dr. Daniel Bronson）和内森尼尔·诺瓦克（Nathaniel Nowak）共同演示。首先，将玻璃巴斯德吸管置于本生灯火焰上加热，以制备用于细胞解离的滴定吸管。当玻璃尖端开始熔化时，将玻璃拉伸至所需的尖端直径。将移液管的一端从火焰中移开，以形成一个小的弯曲。将弯曲的移液管置于显微镜下。使用刻痕片在所需直径处对玻璃进行刻痕并折断。将移液管尖端在本生灯火焰上方快速通过，以迅速熔平尖端附近的粗糙边缘。使用闭合的手术剪挖出已处死小鼠的脑组织。切断并移除脑神经，以将脑组织完全从颅骨中分离。从头部后方开始，用镊子剥离透明的膜状物质，然后用手术剪剪开颅骨顶部并移除。去除头颈部背面多余的组织，以使解剖区域和耳囊更清洁且更易于操作。将组织转移至含有新鲜L-15溶液的第二个培养皿中。随后定位耳囊以及前庭蜗神经、上 vestibular 神经、听神经和下 vestibular 神经。使用小型弹簧剪分离上、下神经节，并剪除听神经。用手术刀轻轻削去骨脊，以削弱神经进入骨性囊壁下方的骨质区域。用手术刀小心清除碎屑，暴露出神经节的整个肿胀部分。使用精细的弹簧剪刀切断并分离向椭圆囊方向延伸的外周神经分支上的神经节。用精细镊子取出上部神经节，并将其转移至含有新鲜L-15溶液的35毫米培养皿中。预热酶溶液后，将酶混合液倒入35毫米培养皿中，置于37°C培养箱中孵育10至15分钟。使用精细镊子和小型弹簧剪，清除神经节周围的骨组织、多余组织、神经纤维及其他多余结构，以清洁神经节。注意尽量减少对神经节组织本身的损伤。将清洁后的神经节转移至预热的酶溶液中，并放回培养箱孵育10至40分钟。然后将神经节转移至含有新鲜L-15溶液的35毫米培养皿中。两到三分钟后，将神经节转移至另一个盛有滤过培养基的35毫米培养皿中。将约150微升滤过培养基转移至包被的玻璃底培养皿上。然后，将所需数量的神经节转移至盖玻片上。从培养皿中吸取少量培养基，用培养基冲洗滴定管，以防止组织黏附在玻璃移液管管壁上。通过轻轻反复使组织经过移液管，进行吹打解离，直至神经节充分分散。五分钟后，在光学显微镜下检查细胞是否已沉降到盖玻片上。小心将培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育12至24小时。接着，在将头部沿中线切开后找到耳囊，并用镊子轻轻敲除边缘骨质，从颅骨中取出耳囊。

isolating-culturing-vestibular-spiral-ganglion-somata-from-neonatal

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从新生儿啮齿动物中分离和培养前庭和螺旋神经节 Somata 以进行膜片钳记录

本视频演示了从内耳分离螺旋神经节组织块并将其与柯蒂氏器在多电极阵列上进行共培养的过程。螺旋神经节被小心地提取并切割成较小的组织片段或组织块。这些组织块被培养在多电极阵列的活性区域，以促进神经元突起的生长。...

在多电极阵列上培养小鼠螺旋神经节神经元外植体

本视频展示了一种从小鼠幼崽内耳中分离前庭神经元的方法。该方法详细阐述了内耳解剖、前庭神经节采集以及将神经节解离为单个细胞的各个步骤。随后，将这些细胞培养在玻璃底培养皿中，以建立前庭神经元培养体系。...

从小鼠内耳分离前庭神经节神经元

本视频演示了用于从小鼠视网膜平铺标本进行电生理记录的全细胞膜片钳技术。使用带有电极的细玻璃移液管接近视网膜内的星形细胞（SACs）。在形成密封后，施加负压以破裂膜并形成全细胞膜片钳构型。最后，利用该构型测量通过SAC突触受体的离子流。...

建立用于小鼠视网膜扁平铺片电生理记录的全细胞膜片钳技术

本视频演示了用于测量内耳感觉神经元胞体中离子电流的膜片钳技术。详细介绍了制备和使用经抛光的膜片钳移液管的方法，该移液管内充满含有两性霉素B的内液，可穿透细胞膜以允许离子移动，同时保持细胞内环境的稳定。通过施加电压脉冲来触发并记录离子通道的活动，从而深入了解其特性与行为。...

内耳感觉神经元胞体的穿孔膜片钳记录

红外神经刺激已被提出作为多种神经类型电刺激的一种替代方法，包括与听觉系统相关的神经。本方案描述了一种膜片钳方法，用于研究红外神经刺激在原代听觉神经元培养物中的作用机制。...

全细胞膜片钳技术用于研究红外神经刺激的机制

由于前庭毛细胞位于颅骨最坚硬部分——岩骨颞骨的深处，其功能分析较为复杂。目前大多数毛细胞功能研究均采用急性分离的毛细胞。本文介绍一种用于膜片钳电生理记录和双光子显微成像研究的小鼠前庭上皮半完整制备方法。...

用于电生理学和高分辨率双光子显微镜的小鼠前庭感觉上皮离体半完整制备方法

我们描述了在麻醉后对海洋海兔Aplysia的神经系统进行解剖，分离神经元用于短期组织培养，并通过膜片钳技术记录单细胞离子电流。...

Aplysia californica 感觉神经元的分离及其谷氨酸能电流的膜片钳记录

本文描述了如何制备完整的背根神经节以进行膜片钳记录。该制备方法保留了神经元和卫星胶质细胞的微环境，从而避免了使用离体培养背根神经节神经元时所出现的表型和功能改变。...

成年大鼠完整背根神经节的膜片钳记录

本方案描述了记录新生大鼠幼崽听觉脑干反应的方法。为了研究外毛细胞的功能发育，本文逐步介绍了在分离的外毛细胞中进行全细胞膜片钳记录的实验步骤。...

新生大鼠听觉脑干反应与外毛细胞全细胞膜片钳记录

在此，我们介绍一种从小鼠血管纹中分离、纯化和培养原代边缘细胞以及建立 体外...

从新生小鼠血管纹中分离和培养原代边缘细胞

We present a new dissection method to extract the vestibular ganglion and all five vestibular organs (utricle, saccule, and three cristae: lateral/horizontal, anterior, and posterior) as one whole-mount vestibular complex. Confocal imaging allows visualization of vestibular neuron cell bodies for quantification, as well as neuronal projections to the sensory...

Whole-Mount Dissection of the Vestibular Complex and Quantification of Vestibular Ganglion Neurons in Mice

学习从新生啮齿动物内耳分离前庭神经节和螺旋神经节神经元并进行膜片钳记录的技术。该方法支持体外电生理研究，用于表征听觉和平衡相关神经元的离子通道特性。

从新生啮齿类动物前庭和螺旋神经节分离并培养神经元胞体用于膜片钳记录

探索更多视频