光诱导介电泳法表征人源间充质干细胞电学行为

这种光诱导介电泳（LiDEP）方案提供了一种表征人类间充质干细胞的逐步方法。该方法有助于揭示干细胞样本异质性相关的问题。LiDEP 的优势在于能够根据干细胞的异质性实时调整虚拟电极构型，而这是传统介电泳方法无法实现的。

初次使用该技术的用户可能难以将投影仪的光线充分聚焦到微流控装置上以形成虚拟电极。我们建议重新调整实验装置，直至达到理想效果。本次实验操作将由我实验室的研究生 Zuri Rashad 协助演示。

首先，准备微通道：在双面胶带上距离其短边边缘约五到六毫米、且位于长边中间的位置，打四个直径为四毫米的孔。使用手术刀在孔的位置上切割两条相距三毫米的直线，切割微通道时需确保双面胶带两面的保护膜均保持在位。用可擦除标记笔标记孔的位置，确保钻出的孔与双面胶带上 punched 的孔对齐。

这两个孔将用作微流控装置的入口和出口。在顶部的氧化铟锡（ITO）玻璃片上钻两个直径为三毫米的孔。接下来，将胶带的长边与已钻孔的ITO镀膜玻璃片的长边对齐，放置在玻璃片的上方。

移除双面胶带一侧的保护膜。将胶带上的孔与顶部ITO玻璃片上的孔对齐，并轻轻按压使其贴合，尤其注意去除微通道附近的气泡。随后移除双面胶带另一侧的保护膜。

将双面胶带的边缘朝向顶部氧化铟锡（ITO）玻璃片的中心，压在涂有钼和非晶硅的ITO玻璃片上，使其与光敏玻璃片上远离2毫米间隙一侧的边缘对齐。这样，ITO玻璃片与光敏ITO玻璃片之间会形成一个悬空部分。在平坦表面上按压以确保良好粘附，并剪去两侧多余的胶带。

连接函数发生器时，将铜箔胶带贴在ITO玻璃层和光敏涂层ITO玻璃层的边缘。从双面胶带的边缘开始，将胶带沿ITO或光敏材料的一侧包裹，延伸至玻璃基板未涂层区域约三厘米处。为确保器件制备成功，使用电阻计检测两片玻璃基板的涂层表面与附着在玻璃上的铜箔胶带之间的电阻读数。

向一个含有4.25克蔗糖和0.15克葡萄糖的50毫升锥形管中加入25毫升超纯水。充分混匀，直至一半的蔗糖和葡萄糖溶解，然后用超纯水定容至50毫升刻度线。随后剧烈振荡此DEP缓冲液，直至完全溶解。

将20毫升配制好的蔗糖和葡萄糖溶液加入50毫升锥形管中。向管中加入0.1克牛血清白蛋白（BSA）。充分涡旋振荡，直至所有BSA完全溶解，得到DEP缓冲液中BSA终浓度为0.5%的溶液。

将一乘以十的六次方个人类间充质干细胞（HMSCs）或人胚胎肾细胞（HEK293）悬浮于一毫升培养基中，加入一个十毫升离心管内。将HEK293细胞以201 ×g离心五分钟，HMSCs以290 ×g离心十分钟。离心后，吸除上清液。

01 轻轻地将细胞重悬于1毫升含0.5% BSA的DEP缓冲液中。再重复离心两次，并将细胞重悬于含0.5% BSA的DEP缓冲液中。准备实验装置，包括笔记本电脑、投影仪、物镜、数字显微镜以及用于量化细胞对LiDEP响应的函数发生器。

将10倍物镜、LiDEP芯片及其支架放置在投影仪镜头顶部。使用笔记本电脑设计光投影图案，如星形、菱形、三条线和椭圆形，并将笔记本电脑连接至投影仪。将LiDEP芯片连接至函数发生器，以施加交流电场。

为了观察经历介电泳力（LiDEP）的细胞，使用数字显微镜进行成像并记录 NVIDIA 数据。完成装置搭建后，先用 70% 乙醇冲洗微通道，随后用 0.5% BSA 溶液冲洗，以去除残留的乙醇及先前暴露于介电泳场中的细胞。重复冲洗三次，以确保彻底清洗干净，因为先前暴露于介电泳场的细胞与新鲜细胞的响应不同，可能干扰数据采集。

用移液器移除0.5% BSA溶液。接下来，将函数发生器设置为所需的电压和频率。使用较小的移液器吸头，小心地将70微升制备好的细胞悬液加入装置的微通道中，将吸头略微倾斜插入孔中并朝向微通道，以避免因微通道较薄而导致液体溢出。

使用一次性纸巾擦去接触溶液，并将纸巾丢弃至生物危害废物容器中。然后，将所需的虚拟电几何图形（圆形、菱形、星形或平行线）投射到 LiDEP 芯片上。在数字显微镜软件中，将视频录制时长设置为三分钟。

将实验室计时器设置为2分30秒。当细胞在LiDEP芯片的微通道中静止后，在数字显微镜软件中点击“开始”，启动视频录制过程。10秒后，按下函数发生器通道输出的“开启”按钮，施加交流电场，同时启动计时器。

通过数字显微镜监测细胞的介电泳行为，并防止实验装置周围发生晃动或移动。计时结束后，按下函数发生器通道输出的“开启”按钮，以关闭通道输出，从而停止通过电极施加交流电场。三分钟后停止视频录制，并保存视频以供后续分析。

通过缓慢向微通道中推入含有0.5% BSA的60微升DEP缓冲液，同时从出口端收集，用移液器将细胞从LiDEP芯片的出口端移出。持续操作直至微通道中几乎没有细胞残留，并按照演示重复对所有频率进行介电泳（DEP）。测定了HMSCs在不同频率下的介电泳速度响应及其存活率百分比。

在五、十和二十伏峰值（VPP）下对正向介电泳（DEP）响应的测量结果显示，细胞的平均移动速度分别为0.025、0.036和0.051微米每秒。经历介电泳力作用后的人骨髓间充质干细胞（HMSCs）活力检测结果表明，较高电压通常导致细胞活力降低，在20 VPP时仅有57%的细胞保持存活。本研究选用了白色、黄色、红色和蓝色电极，但光照通过LiDEP深度芯片时受到光电导层的影响，该层呈红橙色。

因此，投影的白色电极呈现黄色外缘和白色内部，红色电极呈现橙色外缘和红色轮廓，蓝色电极则呈现浅绿色。该现象表明黄色和白色区域的介电泳（DEP）场最强，而蓝色和红色区域较弱。使用LiDEP在三深度分析仪中以10 VPP测量了HMCs的DEP响应。

使用 LiDEP 时，正向介电泳（DEP）响应在 30 千赫兹至 20 兆赫兹范围内逐渐减弱。根据三分析仪结果，细胞在 37 至 255 千赫兹范围内的正向介电泳增强，而在 1,772 千赫兹至 20 兆赫兹范围内正向介电泳减弱。该方法中的两个关键组分是强光源和稳定的电连接，以确保电场的产生和细胞的操控。

我们观察到细胞在虚拟电极作用下发生旋转。因此，还可以进行介电旋转，作为另一种细胞分析方法。介电旋转可提供有关HMSCs异质性及稀有亚群的信息。