Name: 一种构建1型糖尿病大鼠伤口模型的方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 学习使用链脲佐菌素诱导雄性SD大鼠建立1型糖尿病伤口模型的标准化方案，通过腹腔注射和圆形活检打孔技术制备伤口，评估血管生成和再上皮化过程，为糖尿病伤口愈合机制研究提供可靠平台。

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本研究由国家自然科学基金（82104877）资助。

本方案遵循《赫尔辛基宣言》进行，所有动物实验均经成都中医药大学管理委员会批准（记录编号：2021-13）。
1. 链脲佐菌素注射液的制备
<ol>
	<li>选取15只8周龄、体重为220 g ± 20 g的SD雄性无特定病原体（SPF）级大鼠，采用简单随机化方法将其分为糖尿病组（n = 10）和正常对照组（n = 5）。</li>
	<li>测量大鼠的初始体重，并根据55 mg/kg的剂量确定链脲佐菌素（STZ）的给药量。 
	注意：根据预实验结果，55 mg/kg为STZ的最佳剂量。</li>
	<li>准确称取STZ粉末，置于避光容器中。</li>
	<li>加入适量0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5），将STZ溶解至浓度为1%。 
	注意：柠檬酸钠缓冲液必须在使用前于4 °C冰箱中预冷2小时。&#160;STZ溶液的配制过程需保证无菌。</li>
	<li>使用药物振荡器振荡30秒，置于冰盒中备用。 
	&#8203;注意：配制好的注射液应在15分钟内使用完毕。</li>
</ol>
2. 1型糖尿病模型的诱导
<ol>
	<li>在注射STZ前，将大鼠禁食18小时，但可自由饮水。</li>
	<li>进行1% STZ溶液的腹腔注射。
	<ol>
		<li>抓握大鼠，暴露腹部皮肤及注射部位（两侧大腿根部连线与腹部中线的交点）。</li>
		<li>使用浸有75%酒精的棉球对注射部位消毒两次（一次顺时针，一次逆时针）。将大鼠头部置于腹部下方。</li>
		<li>将针头以45°角平行于腹部中线刺入皮肤后，将针头角度减小至30°，再推进2–3 mm。轻拉针栓，确保注射器内未吸入血液或液体。注入STZ溶液后拔出针头，并用棉签压迫止血。 
		注意：若回抽时有黄色液体进入注射器，提示针头可能已刺入膀胱；若回抽为深绿色液体，则可能刺入大肠或盲肠。上述任一情况均应立即拔出针头，并由兽医人员对动物进行评估。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在STZ造模后的第3天和第7天上午09:00测定随意状态（非禁食或禁食）下的血糖水平。 
	注意：随机血糖检测时间应固定。本方案中设定为上午09:00，但并非唯一可用时间点。通过针刺尾静脉采血所获得的血液受组织液干扰较小，相比断尾取血更为准确，因此测得的血糖值更可靠。
	<ol>
		<li>使用大鼠固定器固定大鼠（图1）。</li>
		<li>找到尾静脉位置，使用浸有75%酒精的棉球对大鼠尾部消毒两次。</li>
		<li>穿刺尾静脉使其出血，用血糖仪测定血糖值，并用棉签压迫止血。 
		注意：STZ注射后第7天血糖水平高于16.7 mmol/L者，判定为T1DM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每周称量大鼠体重，并检测血糖水平及其他参数，包括饮食、饮水量和尿量。</li>
	<li>STZ造模后正常喂养动物8周。</li>
</ol>
3. 伤口模型的构建
<ol>
	<li>实验前1天使用电动剃须刀剃除大鼠背部毛发，剃毛区域一般以5 cm × 5 cm为宜。</li>
	<li>用温热的生理盐水棉球擦拭剃毛区域，待其干燥后，涂抹脱毛膏5分钟。用纱布清洁该区域，并用温热的生理盐水冲洗残留的脱毛膏。</li>
	<li>称量大鼠体重，根据35 mg/kg的标准计算所需戊巴比妥钠剂量。使用生理盐水将戊巴比妥钠溶解配制成3%浓度的溶液。&#160;其他常用全身麻醉剂（如氯胺酮/赛拉嗪或异氟烷）也可用于本操作。请与机构动物护理和使用委员会协作，以确定最佳方案。 
	注意：为确保有效性，溶液应新鲜配制，且戊巴比妥钠粉末及溶液应避光保存。</li>
	<li>实验前使大鼠禁食12小时，然后进行麻醉。通过腹腔注射给予麻醉剂。麻醉给药后，使用四环素眼膏或普通眼用润滑剂以防止角膜干燥。 
	注：当大鼠肌肉相对放松、眼球运动消失、呼吸规律且对疼痛刺激反应较小时，视为达到中度麻醉状态。</li>
	<li>使用浸有碘液的棉球对背部皮肤消毒两次（一次顺时针，一次逆时针），再用75%酒精以交替方式重复消毒。</li>
	<li>干燥后，使用直径为20 mm的圆形活检打孔器切割皮肤。</li>
	<li>用无菌镊子提起皮肤，然后用无菌手术剪沿打孔切口标记切除全层皮肤。用生理盐水棉球止血。 
	注意：伤口的上缘应位于大鼠肩胛下缘下方5-10 mm处，并位于脊柱右侧/左侧5-10 mm处图2沿脊柱两侧对称分布，当构建两个伤口时。</li>
	<li>使用凡士林纱布覆盖伤口，并用纱布和透气绷带包裹，再用橡胶胶带固定。注射&#160;皮下注射卡洛芬（5 mg/kg），每日一次，以缓解术后疼痛。每日更换一次伤口敷料（使用卡洛芬进行镇痛）。 
	注意：&#160;观察包扎完成后大鼠的运动和呼吸是否存在异常，并确保透气性绷带松紧适度。</li>
	<li>在伤口下方放置一把尺子，使用数码相机对伤口进行拍照，持续至第14天。根据机构动物护理与使用指南，于第14天处死大鼠。从伤口边缘向外5 mm处切除伤口皮肤组织。将组织样本分为两部分，用PBS冲洗以去除可见血渍，随后用4%多聚甲醛溶液固定。</li>
</ol>
4. 使用 ImageJ 软件计算伤口面积
<ol>
	<li>打开软件后，点击 文件 按钮，然后下拉并点击 打开，以导入伤口图片。</li>
	<li>选择 直线 工具，在伤口图片中的标尺上沿其方向绘制一条长度为 1 cm 的直线。</li>
	<li>在 分析 菜单中点击 设置比例尺 命令，并将 已知距离 设置为 1。</li>
	<li>选择 自由选择 工具，在图片上勾画出伤口的轮廓。</li>
	<li>在 分析 菜单中点击 测量 命令，待结果弹出后读取 面积 值。</li>
</ol>
5. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>在通风橱中用手术刀将皮肤组织从固定液中取出，切成薄片，并放入脱水盒中。</li>
	<li>将脱水盒放入脱水机中，按以下步骤进行组织脱水：75% 酒精 4 小时；85% 酒精 2 小时；90% 酒精 2 小时；95% 酒精 1 小时；无水乙醇 I 和 II 各 30 分钟；酒精苯 5–10 分钟；二甲苯 I 和 II 各 5–10 分钟；石蜡 I、II 和 III 各 1 小时。</li>
	<li>将组织包埋于石蜡中，在 −20°C 的冷冻台上冷却，并整齐修整石蜡块。</li>
	<li>使用石蜡切片机将石蜡块纵向切成 3 µm 厚的切片。</li>
	<li>将切片依次浸入二甲苯 I 和 II 各 20 分钟，无水乙醇 I 和 II 各 5 分钟，自来水 5 分钟。</li>
	<li>用苏木精染液染色 3–5 分钟，0.5% 盐酸水溶液分化，0.5% 氨水溶液返蓝，再用水冲洗。</li>
	<li>用 85% 和 95% 酒精对组织切片进行脱水，然后用伊红染色液染色 5 分钟。 
	注意：通常伊红染色时间为 30 秒至 2 分钟，可根据染色结果和实际需求调整时间。</li>
	<li>将切片依次用以下溶液脱水：无水乙醇 I、无水乙醇 II、无水乙醇 III、二甲苯 I 和二甲苯 II，每种溶液各 5 分钟。最后用中性树胶封片。</li>
	<li>在显微镜下以 40x、20x 和 10x 倍率观察 H&amp;E 染色组织，拍照并保存每张切片的代表性图像。</li>
</ol>
6. CD31 免疫荧光染色
<ol>
	<li>将组织切片依次浸入二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各15分钟，无水乙醇Ⅰ和Ⅱ中各5分钟，85%乙醇中5分钟，75%乙醇中5分钟，最后用蒸馏水冲洗。</li>
	<li>抗原修复
	<ol>
		<li>在微波炉容器中加入适量pH 6.0的10 mM柠檬酸缓冲液，高火加热至沸腾，然后将玻片放入其中。</li>
		<li>中火煮沸8分钟，停止加热静置8分钟，再以中低火煮沸7分钟。</li>
		<li>让玻片自然冷却后，移入PBS（pH 7.4）中，在脱色摇床上每次5分钟，洗涤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在画圈区域内滴加5%山羊血清，孵育30分钟。</li>
	<li>轻轻甩去封闭液（5%山羊血清），滴加兔抗CD31抗体（用PBS按1:200比例稀释），将切片置于湿盒中，4°C过夜孵育。</li>
	<li>在脱色摇床上用PBS（pH 7.4）洗涤玻片3次，每次5分钟。轻轻振荡使切片略干，然后覆盖一滴环形FITC标记的山羊抗兔IgG。室温避光孵育50分钟。</li>
	<li>在脱色摇床上用PBS（pH 7.4）洗涤玻片3次，每次5分钟。轻轻振荡使切片空气干燥，加入DAPI染色液。室温避光孵育10分钟。</li>
	<li>切片干燥后，用PepPen在组织周围画圈（防止抗体流失），向圈内加入自发荧光淬灭剂（0.3%苏丹黑B）处理5分钟，随后用流动水冲洗10分钟。</li>
	<li>在脱色摇床上用PBS（pH 7.4）洗涤玻片3次，每次5分钟。轻微振荡切片，用抗荧光淬灭封片剂封片。</li>
	<li>在荧光显微镜下以40×、20×和10×放大倍数观察并拍照。 
	&#8203;注意：DAPI的紫外激发波长为330-380 nm，发射波长为420 nm（蓝光）；FITC的激发波长为465-495 nm，发射波长为515-555 nm（绿光）。</li>
</ol>
7. 统计学分析
<ol>
	<li>使用 SPSS 收集并分析数据。</li>
	<li>以均值 ± 标准差形式报告数据。</li>
	<li>采用独立样本 t 检验分析糖尿病组与正常组之间的差异。</li>
	<li>统计学显著性水平设定为 **p &#60; 0.01 和 *p &#60; 0.05。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均声明本论文不存在利益冲突。

本方案阐明了1型糖尿病（T1DM）伤口建模中存在争议的操作步骤。本文解决了关于链脲佐菌素（STZ）注射方案、T1DM诱导成功标准、血糖稳定时间以及伤口位置和大小的关切问题。此外，还明确了用于评估T1DM伤口愈合的病理学特征和可测量参数。
在注射STZ前，大鼠禁食18小时，以避免葡萄糖或其类似物与β细胞发生竞争性结合，从而影响STZ的效果。目前最常用的诱导1型糖尿病（T1DM）的方法是单次给予高剂量STZ，该方法通过损伤胰岛并减少胰岛素分泌来升高血糖水平21。预实验结果显示，55 mg/kg的STZ剂量可实现较高的成模率和较低的死亡率，此剂量低于以往研究中报道的最佳剂量22,23,24。在本实验方案中，采用单次腹腔注射55 mg/kg STZ的方法诱导T1DM。
STZ注射后3天，所有大鼠的血糖水平均高于16.7 mmol/L。然而，STZ注射后第7天血糖水平高于16.7 mmol/L才是公认的T1DM造模成功标准，因为不同大鼠胰岛损伤程度存在差异，适当延长诊断时间可降低假阴性率。此外，STZ注射5周后血糖波动趋于稳定，此期间大鼠体重逐渐增加，与既往研究结果一致25,26。这表明T1DM模型的血糖水平应至少稳定6周，且在6周后出现体重增加可降低创面造模期间的死亡率。因此，本方案在STZ注射8周后进行创面造模。
伤后第7天和第14天，糖尿病组的伤口闭合率显著低于正常伤口组，表明愈合速度较慢。此外，糖尿病组的伤口再上皮化和血管生成程度也显著低于正常组。这表明T1DM伤口模型的愈合速度和再上皮化过程均比正常大鼠更缓慢，可能与伤口血管生成减少的病理变化有关。然而，在第14天时，T1DM大鼠的伤口愈合率仍超过90%，这与人类糖尿病慢性难愈合伤口的特征不同。这可能是因为啮齿类动物的伤口愈合生理机制与人类存在差异27。因此，在糖尿病伤口研究中，最佳伤口直径应至少为20 mm，足够大以留出时间评估干预措施的有效性。伤口位置应避开肩胛骨和脊柱区域，因为这两个部位的持续活动可能干扰伤口愈合。
综上所述，采用本方案所述方法构建的1型糖尿病（T1DM）伤口模型是有效的。该方案能够复制慢性糖尿病伤口的一些特征，例如与正常大鼠伤口相比，伤口愈合速度较慢、再上皮化延迟以及血管生成减少。然而，目前尚不清楚该模型是否能够复制糖尿病伤口的其他慢性表型。此外，本方案描述的是最基础且广泛应用的方法，未考虑大鼠皮肤收缩的问题。未来的研究可将伤口夹板技术纳入本方案，或探索其他慢性糖尿病伤口模型，这将是未来研究人员面临的重要挑战。

1型糖尿病（T1DM）是一种以高血糖和胰腺β细胞破坏为特征的慢性代谢性疾病1。T1DM伤口是一种难以愈合的慢性伤口，是人类糖尿病最常见且最具破坏性的并发症2,3。动物模型是研究伤口愈合过程中病理变化以及潜在治疗药物安全性和有效性的最合适原型4。与其他类型相比，雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠对链脲佐菌素（STZ）更敏感，且相关死亡率较低，因此在糖尿病伤口研究中被广泛使用5,6。
已有多种构建1型糖尿病（T1DM）伤口模型的方法被报道。在T1DM模型方面，研究主要关注链脲佐菌素（STZ）注射方法对糖尿病诱导成功率的影响7,8。然而，该步骤的操作在不同研究中存在不一致。一项研究中，大鼠在STZ注射前禁食18小时；STZ注射1周后，血糖水平高于16.67 mmol/L的大鼠被认定为糖尿病模型，并在3周后建立糖尿病伤口模型9。相比之下，在另一项相关研究中，Zhu等人在STZ注射前使大鼠禁食12小时；注射后72小时血糖水平高于16.7 mmol/L的大鼠被视为糖尿病模型，并在4周后引入伤口10。总体而言，STZ注射方案、糖尿病诊断标准以及伤口引入时间等方面均存在不一致。
在创面建模方面，大多数研究在成功诱导1型糖尿病（T1DM）后，通过切除背部皮肤的全层组织来构建T1DM创面模型11,12,13。尽管该模型在大鼠中易受皮肤收缩的影响，但由于操作简便且成本较低，仍是创面愈合研究中最常用的模型14,15。然而，目前尚缺乏针对这种全层皮肤切除技术的方法学指导研究。此外，现有研究在创面大小和位置方面尚无统一标准12,16。创面的大小和位置可能间接影响实验设计的一致性以及研究结果的科学有效性。因此，迫切需要建立一套标准化的T1DM诱导与创面建模操作规程，为研究人员提供参考。本研究的目标是可视化展示一种特定的T1DM创面建模方案，可作为T1DM创面研究的参考依据。

<table><tbody><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>Southern Biotechnology Associates, Inc.</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>自发荧光淬灭剂</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td><td>G1221</td><td></td></tr><tr><td>全自动切片染色机</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>Varistain&amp;trade; Gemini ES</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td><td>GB11063-2</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸抗原修复液</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td><td>G1201</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>脱色摇床</td><td>Scilogex</td><td>S1010E</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>广州瑞新生物科技有限公司</td><td>&amp;mdash;</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>成都科龙化工试剂厂有限公司</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>药物振荡器</td><td>深圳佳士科技有限公司</td><td>VM-370</td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td>上海飞科电器股份有限公司</td><td>FC5908</td><td></td></tr><tr><td>包埋机</td><td>武汉俊杰电子有限公司</td><td>JB-P5</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，绝对</td><td>成都科龙化工试剂有限公司</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的山羊抗兔IgG</td><td>Servicebio Technology co., Ltd.</td><td>GB22303</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>苏木精和伊红染色液</td><td>北京瑞安生物科技有限公司</td><td>DH0020</td><td></td></tr><tr><td>Image J 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>&amp;mdash;</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>美的集团股份有限公司&amp;nbsp;</td><td>M1-L213B</td><td></td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>Scilogex</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>PBS缓冲液</td><td>Biosharp</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>便携式血糖仪</td><td>Sinocare Inc.</td><td>GA-3</td><td></td></tr><tr><td>快速组织处理仪</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>STP420 ES</td><td></td></tr><tr><td>大鼠固定器</td><td>Globalebio（北京）科技有限公司</td><td>GEGD-Q10G1</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.</td><td>80312-3181</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠缓冲液</td><td>北京索莱宝科技有限公司 &amp;科技有限公司</td><td>c1013</td><td></td></tr><tr><td>链脲佐菌素</td><td>Sigma</td><td>57654595</td><td></td></tr></tbody></table>

1型糖尿病大鼠伤口模型构建方案

A Protocol for Constructing a Rat Wound Model of Type 1 Diabetes

单次注射高剂量链脲佐菌素（streptozotocin）后，在大鼠背部进行全层皮肤切除，是构建1型糖尿病伤口动物模型的常用方法。然而，操作不当可能导致模型不稳定及大鼠死亡率较高。遗憾的是，目前关于1型糖尿病伤口建模的现有指南较少，且缺乏详细说明，未提供具体可参考的策略。因此，本实验方案详细阐述了构建1型糖尿病伤口模型的完整流程，并分析了糖尿病伤口的进展过程及其血管生成特征。1型糖尿病伤口模型的建立包括以下步骤：链脲佐菌素注射液的配制、1型糖尿病的诱导以及伤口模型的构建。在造模后第7天和第14天测量伤口面积，并取大鼠皮肤组织进行组织病理学和免疫荧光分析。结果表明，采用55 mg/kg链脲佐菌素诱导的1型糖尿病模型具有较低的死亡率和较高的建模成功率；在诱导5周后，血糖水平相对稳定。糖尿病伤口在第7天和第14天的愈合率均显著低于正常伤口（p &#60; 0.05），但至第14天时，两类伤口的愈合率均可达到90%以上。与正常对照组相比，糖尿病伤口在第14天时表皮层闭合不完全，再上皮化延迟，且血管生成显著减少（p &#60; 0.01）。基于本方案构建的1型糖尿病伤口模型具有慢性伤口愈合的特征，表现为闭合不良、再上皮化延迟以及血管生成减少，与正常大鼠伤口相比存在明显差异。

共10只SD大鼠接受单次STZ腹腔注射以诱导T1DM模型。其中1只大鼠提前死亡（10%），但所有大鼠均成功诱导出糖尿病（100%）。STZ注射3天后，所有大鼠的血糖水平均高于16.7 mmol/L，且血糖水平在诱导后第5周趋于稳定。图 3A糖尿病组在STZ注射后体重逐渐增加，但在第3周出现下降，随后从第4周起再次缓慢上升。图3B）。相比之下，正常组大鼠的体重稳步增加，其在糖尿病诱导后第3天的平均体重高于糖尿病组。图 3B）。所有糖尿病大鼠均表现出典型的口渴、多尿和体重减轻症状，这与Hao等人的研究结果相似。17.
在造模后第7天和第14天，宏观分析显示，正常组大鼠的再上皮化程度较糖尿病组更为显著。图 4A定量结果显示，在第7天和第14天，糖尿病组的伤口愈合率显著低于正常组。p &#60; 0.01）。然而，在第14天，糖尿病组的伤口愈合率同样可超过90%。p &#60; 0.05, 图 4B这表明，T1DM伤口模型的特征是愈合不良，但尚未达到人类糖尿病伤口中所见的慢性不愈合程度。
H&#38;伤口愈合第14天的伊红染色显示，与正常组相比，糖尿病组的伤口表皮不完整，角质形成细胞增殖缓慢，再上皮化延迟。糖尿病伤口显示出部分毛囊和皮脂腺的缺失。可见的毛细血管也较少。图 5).
糖尿病导致内皮细胞功能障碍、细胞外基质蛋白糖基化以及血管去神经支配。18这些并发症导致糖尿病创面的血管生成低于正常水平。18伤口愈合需要血管生成，而伤口血管生成通常通过CD31免疫染色进行分析。图 6A)19,20根据CD31表达的平均光密度（AOD）分析，正常组创面部位的血管生成显著高于糖尿病组。p &#60; 0.01, 图 6B).
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig01.jpg" /> 
图 1被固定器固定的大鼠图片。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig02.jpg" /> 
图 2大鼠伤口位置示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig03.jpg" /> 
图 3实验大鼠的血糖水平与体重。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig04.jpg" /> 
图 4实验大鼠背部全层皮肤创面（直径20毫米）。 (A) 第0天、第7天和第14天伤口的宏观外观。使用数码相机拍摄第0天、第7天和第14天的伤口形态图像。B) 使用 ImageJ 软件测量创面面积，并用于计算创面愈合率。创面愈合率（%）计算公式如下：（初始创面面积 &#8722; 指定时间点的创面面积/初始创面面积 &#215; 100. 数值以平均值形式呈现。 &#177; SD（n = 14）。统计学显著性设定为 ** p &#60; 0.01 与 * p &#60; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig05.jpg" /> 
图 5代表性组织病理学H&#38;伤口建立后第14天的E图像。 蓝色箭头指示毛细血管。红色箭头显示角质形成细胞的增殖。左侧比例尺：一格 = 200 &#181;m；右侧比例尺：一横条 = 100 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig06v2.jpg" /> 
图 6CD31 表达的免疫荧光染色分析。 CD31 水平被用于评估血管生成状态。&#160;(A)&#160;糖尿病组与正常组中CD31免疫荧光染色的代表性图像。使用Image-Pro Plus 6.0软件计算每个皮肤样本的积分光密度（IOD）值和像素面积（AREA）。同时计算平均光密度（AOD）值（AOD = IOD/AREA）。AOD值与CD31的阳性表达水平成正比。B) 糖尿病组与正常组CD31阳性表达的定量比较。数据以平均值表示 &#177; SD。 p &#60; 0.01. 比例尺：一格 = 200 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig06largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

雄性SD大鼠链脲佐菌素诱导的糖尿病伤口模型是目前研究1型糖尿病伤口愈合最常用的模型。本方案描述了构建该模型所使用的方法，同时提出并解决了可能遇到的挑战，并探讨了糖尿病伤口的进展过程及其血管生成特征。

单次高剂量链脲佐菌素注射联合大鼠背部全层皮肤切除是构建动物……的常用方法

1型糖尿病伤口建模过程的许多细节容易出错，对经验丰富的研究人员而言也是一项艰巨的挑战。因此，有必要采用本方案。以最简单的方式，该技术可有效模拟慢性糖尿病伤口的一些特征，例如伤口不愈合、再上皮化延迟以及血管生成减少。链脲佐菌素溶液应在配制后立即使用。在制造伤口时，需注意伤口的大小和位置必须加以控制。首先将链脲佐菌素粉末溶于适量的 0.1 摩尔/升柠檬酸钠缓冲液中，配制成 1% 的溶液，使用药物振荡器振荡 30 秒，随后置于保温箱中。进行 1% 链脲佐菌素溶液腹腔注射时，抓握大鼠，暴露注射部位的腹部皮肤。用浸有 75% 酒精的棉球对注射部位消毒两次，并将大鼠头部置于腹部下方。将针头与腹中线平行，以45度角插入。然后将针头角度减小至30度，再插入2至3毫米。轻轻回拉针芯，注射链脲佐菌素溶液，然后拔出针头，再用棉签按压。为测定第3天和第7天上午9:00的因果性血糖水平，需找到尾静脉的位置。采血前用75%酒精对大鼠尾部消毒两次，然后穿刺尾静脉取血，使用血糖仪测量血糖。操作完成后，用棉签按压止血。在造模前一日，使用电动剃须刀剃除大鼠背部5厘米×5厘米区域的毛发。用温热的生理盐水棉球擦拭剃毛区域，并使其干燥，随后涂抹脱毛膏5分钟。用纱布清洁该区域，并用温热的生理盐水清洗残留的脱毛膏。然后使用浸有碘液的棉球对背部皮肤消毒两次，再交替使用75%酒精消毒两次。待皮肤干燥后，用直径20毫米的圆形皮肤活检打孔器切割皮肤。用镊子固定皮肤，然后用手术剪沿打孔切口完全切除全层皮肤。操作完成后，用生理盐水棉球止血。使用凡士林纱布覆盖伤口。所有大鼠在注射链脲佐菌素三天后成功诱导糖尿病，血糖水平高于16.7毫摩尔每升。诱导后五周，血糖水平趋于稳定。糖尿病组在链脲佐菌素注射后体重逐渐增加，第3周体重下降，随后从第4周开始缓慢回升。相比之下，正常组大鼠的体重持续稳定增加。在糖尿病诱导三天后，其平均体重高于糖尿病组。在伤口形成后的第7天和第14天进行的大体分析显示，正常组大鼠的再上皮化程度较糖尿病组更为明显。第7天和第14天的定量结果显示，糖尿病组的伤口愈合率显著低于正常组。然而，在第14天时，糖尿病组的伤口愈合率已超过90%。糖尿病伤口表现出毛囊和皮脂腺的部分缺失，且可见毛细血管较少。通过CD31免疫染色分析创面血管生成，CD31表达的平均光密度显示，正常组创面部位的血管生成显著高于糖尿病组。建模创面时，应确保去除前肢厚度的皮肤，包括表皮、真皮和皮下组织。

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