同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

目前仅有少数方法能够快速评估造血祖细胞的功能。本方案用于检测最初的细胞分裂对细胞命运和分化承诺的影响。该方法可在单细胞水平上同时高通量地测量细胞分裂与分化过程，且无需复杂的操作步骤。

该方法适用于任何可在培养条件下维持的造血细胞群体，因此可广泛应用于癌症生物学、免疫学和发育生物学研究。实验开始时，将250微升CD34+细胞组分等量分装至四个15毫升聚丙烯管中。

按照文稿中的描述标记试管。将 CD34 细胞组分分装 250 µL 至另外四个 15 mL 聚丙烯试管中，并标记试管。按照文稿中的描述配制 CFSE 高浓度和 CFSE 低浓度溶液。

向 CF 和 CV 管中加入 250 µL CFSE 高浓度溶液，向 VC 管中加入 250 µL CFSE 低浓度溶液，向 VI 管中加入 250 µL 不含胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。为确保细胞悬液与细胞染料充分混匀，将离心管倾斜约 90 度，沿管壁加入 CFSE 溶液。随后将离心管垂直持握，上下颠倒混匀三至四次，以确保 CFSE 溶液与重悬细胞迅速混合均匀。

将悬液在37摄氏度下孵育8分钟。孵育结束后，加入5毫升含10% FBS的DMEM，并将试管置于37摄氏度下5分钟。以300 ×g离心5分钟。

用移液法吸除上清液，注意不要扰动沉淀，然后用5毫升PBS、ETDA洗涤沉淀。再次离心试管，并弃去上清液，随后将沉淀重悬于40微升PBS、ETDA中。为了染色CD34+细胞，将抗体配制成主混合液，加入一个0.5毫升的离心管中。

向四个 CD34+ 条件样本中各加入 7 微升抗体混合液。分别用约 500 微升染色缓冲液重悬 CD34+ 细胞磁珠样本，用 1 毫升染色缓冲液重悬 CD34- 管中的细胞。进行细胞分选时，通过创建点图设定设门策略。

首先，在FSCA与SSCA散点图上观察细胞，并双击多边形门控工具，选择侧向散射光较低的细胞群体。将新创建的门命名为“Cells”。在接下来的FSCA与FSCH散点图中，右键单击图表，从下拉菜单中点击选择“Cells”门。

使用相同的设门工具，在两个轴之间的对角线上选择一个紧密的细胞群。将此门标记为单细胞。在第三个点图中，以 APC 与 FSH-H 为参数，显示单细胞群体，并圈选不表达 APC 系列标记的细胞。

将新创建的群体标记为谱系阴性。在第四幅图中，即CFSE与CTV图，显示谱系阴性群体，并创建四个独立的门，每个染料组合对应一个门。此处以门VI为例展示。

使用第五和第六个图来鉴定目标前体细胞。在第五个图中，宽泛圈选 CD34+CD38- 群体和 CD34+CD38+ 群体。然后，在第六个图中选择 CD34+CD38- 群体，并针对 LMPP、HSC 和 MPP 绘制三个门。

运行 CD34+ 组分，至少在单细胞门内记录 5,000 个事件。针对每种染料组合调整门控，设置紧凑的门以选择均一的细胞群体。使用实验分选布局制备分选板模板。

标记为 CD34- 的孔中含有 5,000 至 10,000 个细胞，这些细胞根据 CF、CV、VC、VI 门进行分选。批量孔中含有 500 个细胞，根据 CD34+CD38- 门进行分选。单细胞孔每孔仅包含每种细胞分裂染料组合的一个事件，因此每孔总共四个事件。接下来，以得率纯度模式（Yield Purity mode）开始分选 CD34-CF。

单击“采集”按钮，然后单击“分选”按钮。先单击“采集”，再单击“分选”按钮，并确保勾选纯度等级为0160。最后，以单细胞纯度模式对目标细胞进行分选，每孔一个细胞，同时确保已勾选“索引分选”选项。

将培养板在300 G条件下离心五分钟，然后在通风橱内的纸巾上方迅速倒置培养板以去除上清液。向A1至A4孔中每孔加入8 µL静置缓冲液，随后向其余各孔中每孔加入8 µL混合液。使用多通道移液器向每孔加入100 µL染色缓冲液，以洗涤细胞。

离心并弃去上清液，然后将细胞重悬于85 µL染色缓冲液中。使用专用模板，在流式细胞仪上以采集模式开始分析，并点击“Custom”。从列表中选择目标荧光染料后，根据板模板设置孔板布局，校正所含细胞的孔数（至少含有一个细胞的孔）。

勾选“振荡”选项，并将采集体积上限设为 100 微升。然后，将采集速率设置为不超过每秒 1 微升，因为较低的速度可提高每孔分析的总体积。为获得代表性门控结果，将不同批量孔的数据合并为单个文件。

单击“合并群体”选项后，从“参数”菜单中选择“所有未补偿参数”，然后点击“合并”。将合并后的文件上传到工作区，再通过拖放方式应用补偿矩阵。CV 和 VC 标记的细胞需要进行转换值处理。

单击“工具”和“派生参数”以获取转换后的数值。将指定的公式粘贴到公式框中。对每种颜色分别应用门控，以直方图形式显示。

对于 CF 和 VI，分别将 CFSE-A 和 CTV-A 设为 X 轴。对于 CV 和 VC，将新衍生的参数设为 X 轴，然后针对每个峰设置门控。将门控应用于每个单独的单细胞孔。

务必在每个被分析的孔中添加推导参数。手动检查每个孔的颜色门控，以识别被错误分配到特定峰的事件。细胞培养后的流式细胞术分析需要精确设门，以确定各个细胞之间的亲缘关系及细胞表型特征。

峰的界定与指认是流式细胞术分析中的关键环节。直方图展示了家族分布在多个峰上的两个示例，其中一个为两个强度相似的峰，另一个为两个强度不同的峰。此处展示了在72小时后对造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）进行的两个独立实验所采用的不同类型的数据呈现方式及统计检验方法。

代表HSC分化条件的热图展示了不同的细胞谱系，包括细胞命运和细胞分裂情况。此处显示了比较HSC和MPP来源细胞谱系命运的直方图。对于这两种细胞类型，均同时展示了GT条件与分化条件之间的比较结果，以及针对MPPs所进行的统计检验。

此处展示了比较每代细胞家族百分比及其首次分裂命运对称性或不对称性类型的直方图。同时展示了多能祖细胞（MPPs）每代命运分布及条件分化情况。该操作需要大量分离细胞，以建立适当的设门策略。

因此，最好从至少 10,000 个细胞开始染色。将此方法与连续测量技术（如活细胞成像）相结合可能非常强大，因为两者结合可对细胞动力学的早期前体细胞提供详尽的描述。该方法最初由 Hopkins 实验室为 T 细胞生物学研究开发。

这一版本经过改进，适用于血液干细胞，现正拓展至癌症和干细胞生物学领域。