Name: 通过流式细胞术 同时 评估造血干细胞和祖细胞的亲缘关系、分裂数和表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学习使用流式细胞术同时评估造血干祖细胞的分裂次数、表型特征及亲缘关系。该方法可在单细胞水平高通量分析细胞命运与分化，适用于癌症生物学和免疫学研究。

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我们感谢居里研究所流式平台成员在建立流式细胞术实验过程中提供的帮助。我们还要感谢Perié研究团队其他成员在多次讨论中的贡献。感谢Julia Marchingo博士和Phil Hodgkin教授（Walter and Eliza Hall医学研究所）分享他们在淋巴细胞细胞分裂染料多重标记方面的实验方案。感谢圣路易医院脐带血生物样本库为本实验方案的开发提供了必要的生物资源。本研究获得了法国国家科学研究中心（CNRS）和贝当古-舒勒基金会（Bettencourt-Schueller Foundation）ATIP-Avenir项目资助（授予L.P.），Labex CelTisPhyBio 项目（ANR-10-LBX-0038）（授予L.P.和A.D.），巴黎科学与文学大学（Paris-Science-Lettres）Idex项目（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）（授予L.P.），法国国家癌症研究所（INCA）Canceropole新兴项目（2021-1-EMERG-54b-ICR-1，授予L.P.），以及ITMO MIIC项目（21CM044，授予L.P.）的资助。此外，本研究还获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下“ERC StG 758170-Microbar”项目（授予L.P.）的资助。A.D.获得了法国基金会（Fondation de France）博士后奖学金的支持。

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作者声明本研究不存在任何利益冲突。资助方在研究设计、数据收集与解释，以及决定提交论文发表等过程中均未发挥任何作用。

MultiGen 检测是一种高通量、操作简便且成本低廉的检测方法，已被广泛用于淋巴细胞研究23,24,35 和小鼠造血细胞26,27. 此处，我们介绍该方法的一种新进展，可用来解析 离体 人类HSPC承诺的早期阶段，通过短期培养在单细胞水平上研究图6）。单细胞 离体 培养系统通常用于评估造血干细胞和祖细胞向成熟细胞的长期分化命运，但某些分化命运的发生早于其他。36，可能导致分析结果偏向于较少的命运类型。此外，这些培养系统通常缺乏命运决定过程中细胞分裂的相关信息。已有研究表明，最初的命运决定步骤可能早在培养初期即已发生，有时甚至不伴随细胞分裂。26,37，因此短期培养并追踪细胞分裂对于研究早期命运决定至关重要。通过同时追踪细胞的命运、分裂行为及谱系关系，该检测方法能够揭示人类造血干祖细胞（HSPCs）中首次分裂与命运决策的作用。利用该方法，可推断命运承诺过程发生在第几次分裂之后，早期前体细胞自我更新与分化之间的平衡关系，以及这些特性在世代间如何遗传。据我们所知，这是目前唯一可在单细胞分辨率下对人类HSPCs实现上述测量的检测方法。此外，通过使用不同组合的细胞分裂染料，我们提高了分析通量，使该检测成为快速生成大规模数据集的有力工具。染料组合的使用使得在同一孔中可同时追踪多个细胞谱系，从而增加短期培养中可用于分析的细胞数量。未来，染料组合的数量还有望进一步增加。 通过 可添加其他染料（例如黄色染料）或调整CFSE与CTV的比例，但这会减少可分析的其他参数数量。
<img alt="细胞分选流程图：染料染色、抗体染色、数据分析、统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：实验方案的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了成功完成分析，由于孔数量较多且待分析的细胞数量较少，必须使用配备微孔板读板器的流式细胞仪进行分析。新一代台式分析仪特别适用于该检测，因为其中大多数仪器具有更小的死体积，可降低细胞损失比例。这反过来保证了从每孔中回收全部细胞的效率更高，据估计效率可达70%左右26。在流式细胞术检测过程中评估细胞损失对于每个细胞家族的分析至关重要。例如，在假设无细胞死亡的前提下，通过计数细胞分裂次数，可估算每个家族的细胞数量。然而，建议进行一些验证性实验，特别是在特定培养条件下对细胞死亡情况进行评估，并通过使用已知数量的细胞进行实验来测定实际回收率。
该方案中一个关键步骤是峰的指认。如前所述，高质量的峰分布很大程度上依赖于细胞分选时获得非常窄的峰。然而，仅根据峰分布来准确指认细胞分裂次数仍然存在困难。由于细胞分选和流式细胞术分析是在两台不同的仪器上进行的，无法直接比较每个信号的强度，因此可能难以判断在直方图右侧末端观察到的第一个峰是第0峰还是第1峰。针对这一问题，有几种可行的解决方案：一种方法是进行正交实验，以精确测量这些细胞所经历的分裂次数（例如，活细胞成像）；另一种方法是在进行流式细胞术分析之前，使用倒置明场显微镜简单计数培养孔中的细胞数量，从而推断出平均分裂次数（假设无细胞死亡）。最后，还有一种事后修正的峰指认方法，即检测是否存在异常数量的“不可能的家系”；这些家系包含每代细胞数超过理论可能的情况（例如，第二代中有五个细胞，或第一代中有两个细胞且第二代中有一个细胞）。在统计分析步骤中已编码了排除“不可能家系”的功能，并会标记出此类家系。如果此类错误出现频率过高，则合理推测峰的指认需要重新校正。
在本实验方案中，我们包含了该检测方法中数据呈现与分析的若干示例，因为这已成为大规模数据生成与解读中的关键步骤38。第一个示例是热图，展示按细胞家族组织的所有被分析细胞的总体情况。这是一种高效工具，可用于探索数据的整体特征及潜在结论：家族是否由多种细胞类型组成，还是倾向于具有同质性？家族是否跨越多个世代，还是主要进行相同次数的分裂？这种探索性分析随后需结合更具体的图表和统计检验加以补充。该方法可用于定量评估对称性与不对称性命运决定、不分裂即分化、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所经历的分裂次数。在实验设计阶段，必须根据所研究问题的类型合理设定细胞培养时长；例如，针对前两个问题（对称/不对称平衡和不分裂即分化），设计较短的培养周期可分离出大量仅经历一次或未发生分裂的细胞家族26。相反，较长周期的实验则有助于探究特定细胞命运决定所需的分裂次数，因为它能够采集处于不同分化阶段的细胞家族。然而，该方法并不适用于长期培养（2–3周），因为细胞染料稀释无法准确追踪超过七到八次的细胞分裂22。因此，该技术主要适用于研究造血祖细胞的早期命运决定，而不适用于对其长期分化特性的可靠结论。
该统计框架是专门为分析此类数据而开发的，其基础是置换概念26。之所以需要这样做，是因为观察到细胞类型分布及细胞分裂次数存在家族依赖性。换句话说，属于同一家族的细胞更可能表现出相似的表型，并进行相同次数的分裂。尽管深入分析超出了本研究的范围，但所提供的统计检验方法在评估不同条件时应已足够。
总之，该方案是评估造血干细胞和祖细胞细胞动力学的有力工具 离体以快速且经济的方式进行。由于其在分析时间点、培养条件和所分析的HSPC类型方面具有灵活性和多功能性，因此可用来测试多种实验条件。作为一种基于流式细胞术的检测方法，它可在大多数实验室中实施，且不需要 extensive prior knowledge，使其成为筛选实验和预实验的理想选择。

过去十年见证了单细胞技术在细胞与分子生物学领域的全球性普及。继单细胞基因组学1,2之后，如今已能够利用每年不断涌现的新型单细胞组学技术，对单个细胞的多种组分（如DNA、RNA、蛋白质）进行研究。这些技术在免疫学、神经生物学、肿瘤学等领域，无论是使用人类细胞还是模式生物细胞，都为新旧科学问题提供了新的见解3。通过揭示个体细胞之间的差异，单细胞组学推动了造血过程新模型的建立，该模型聚焦于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的异质性，摒弃了传统上将细胞群体视为离散且均一的模型4,5。
所有组学技术为数不多的缺点之一是会破坏目标细胞，从而无法评估该细胞的功能活性。相比之下，其他单细胞方法，如单细胞移植实验和谱系示踪技术，则可通过追踪单个细胞的命运来反映祖先细胞的功能状态。 体内6,7谱系示踪技术涉及利用可遗传的遗传标记对目标细胞进行标记7 或荧光标记8,9，从而能够同时追踪多个单细胞的命运。然而，对起始细胞的表征通常仅限于少数几个参数，例如通过流式细胞术检测的少数表面蛋白的表达水平10此外，单细胞谱系示踪技术通常需要繁琐的细胞标记检测过程 通过 DNA/RNA测序或成像。尤其是最后一点限制了单次实验中可检测的条件数量。
另一类用于研究单个细胞功能的方法是单个造血干细胞和祖细胞（HSPC）的ex vivo细胞培养系统。这类实验操作简便，是公认的金标准检测方法，其过程包括将单个细胞分选至96孔细胞培养板中，经过培养后，通常通过流式细胞术或形态学分析来鉴定子代细胞的表型。这些检测方法主要用于表征HSPC在体外培养2-3周后向成熟细胞的长期分化能力11,12。此外，这些方法也被用于尝试在ex vivo条件下维持和扩增HSPC13,14,15,16,17,18，有望为人类干细胞移植带来临床应用价值19。最后，这些方法还被用于通过短期培养研究HSPC的早期命运决定20，但此类培养产生的细胞数量较少，是其主要局限性。上述各类ex vivo检测方法的一个缺点是只能部分反映in vivo的复杂性；尽管如此，它们仍是目前为数不多可用于研究人类HSPC分化的实验手段之一。
现有单细胞方法（单细胞组学、谱系示踪和 离体 准确检测细胞分裂是研究造血干祖细胞（HSPC）动态时需要考虑的一个关键参数21一种评估分裂次数的简单方法 通过 流式细胞术是利用可溶性 &#34;蛋白质染料&#34;，类似于5-(和6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）22这些分裂染料会扩散至染色细胞的胞质内，在每次细胞分裂时被稀释一半，并平均分配至两个子代细胞，从而可追踪多达10次细胞分裂。通过联合使用多种分裂染料，可在同一孔中接种多个独立的前体细胞，因为每种染料均可独立区分各自的子代细胞。这一原理即为细胞染料用于多重克隆及分裂追踪技术的基础，最早应用于小鼠淋巴细胞。23,24.
在此，我们介绍了用于小鼠和人类造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的MultiGen检测方法的开发。该方法可同时对大量单细胞进行检测，评估其分化潜能、分裂能力及谱系亲缘关系。 离体该高通量、操作简便且成本低廉的检测方法可同时测量细胞表型、细胞分裂次数以及孔内细胞之间的亲缘关系和克隆关联性。可用于定量评估命运决定的对称性与不对称性、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所需的分裂次数。本实验方案需要配备平板读取功能的荧光激活细胞分选仪（FACS）和流式细胞仪，以及进行细胞培养所需的常规设备。除针对人HSPC执行该检测的技术流程外，我们还提供了详细的分析框架，包括评估与细胞家族概念相关的细胞特性所必需的统计检验方法。25该方案已成功用于描述小鼠HSPC区室26,27.
以下方案以磁珠富集的CD34+细胞作为起始材料28。通过该方法，可高效地对来自不同血液来源（例如脐带血、骨髓、外周血）的人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行染色和分离。注意不要丢弃CD34-组分，因其将在本方案中用于设置多种实验对照。所述的细胞数量和体积可根据实验流程和实际需求进行相应放大或缩小。同样，通过调整细胞分选和流式细胞术步骤中所使用的抗体，该方案也可适用于不同类型前体细胞的研究。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL聚丙烯微量离心管</td><td>vWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>15 mL聚丙烯管</td><td>vWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>50 mL聚丙烯管</td><td>vWR</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底培养板&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>抗人 Lin APC</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22-7776-72</td><td>稀释比例 1/40</td></tr><tr><td>ARIA III</td><td>BD</td><td></td><td>可替换为任何能够将单个细胞分选至96孔板的FACS分选仪</td></tr><tr><td>羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）</td><td>Life Technologies</td><td>C34570</td><td></td></tr><tr><td>细胞示踪紫（CTV）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>补偿微珠&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Life Technologies</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J62948-36</td><td>在无菌水中配制 0.5 M 溶液</td></tr><tr><td>FC 封闭 Fc1.3216</td><td>BD</td><td>564220</td><td>稀释比例 1/50</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Dutscher</td><td>S1900-500C</td><td>S00CH 批次</td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD10 PerCP-5.5，克隆号 HI10a</td><td>Biolegend</td><td>312216</td><td>稀释比例 1/20</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD123 BUV395，克隆 7G3</td><td>BD</td><td>564195</td><td>稀释比例 1/15</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD34 APC-Cy7，克隆 581</td><td>Biolegend</td><td>343513</td><td>稀释比例 1/40</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD38 BV650，克隆 HB7</td><td>Biolegend</td><td>356620</td><td>稀释比例 1/40</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD45RA AF700，克隆号 HI100</td><td>BD</td><td>560673</td><td>稀释比例 1/20</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD45RA PE-Cy7，克隆 HI100</td><td>BD</td><td>560675</td><td>稀释比例 1/20</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD90 PE，克隆 5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>稀释 1/20</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）1X</td><td>Life Technologies</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌12x75 mm锥形聚丙烯管</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZE5&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td>可替换为任何配备微孔板读取功能的流式细胞仪</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;实验室制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养基</td><td></td><td></td><td>根据具体实验而定。每日新鲜配制，并于+4℃保存 &amp;deg;C，直至使用</td></tr><tr><td>DMEM + 10% FBS</td><td></td><td></td><td>可在无菌条件下于 +4 ℃ 保存 &amp;deg;C 可保存长达 1 年。配制 500 mL 时，将 50 mL FBS 加入 450 mL DMEM 中</td></tr><tr><td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td><td></td><td></td><td>可在无菌条件下于室温保存，最长1年。制备500 mL时，将3.42 mL 0.5 M EDTA加入500 mL 1× PBS中</td></tr><tr><td>染色缓冲液</td><td></td><td></td><td>可在无菌条件下于 +4 ℃ 保存 &amp;deg;C，最长可保存1年。配制500 mL时，向500 mL 1× PBS中加入2 mL 0.5 M EDTA和1 mL胎牛血清（FBS）。</td></tr></tbody></table>

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

很少有技术能够同时评估单个细胞的表型和命运。目前用于表征表型的大多数方案虽然能够生成大量数据，但需要破坏目标细胞，从而无法进一步评估其功能命运。因此，对于造血等具有异质性的生物分化系统，其动态过程难以准确描述。基于细胞分裂示踪染料，我们进一步开发了一种实验方案，可同时确定大量单个造血祖细胞的亲缘关系、分裂次数和分化状态。该方案能够实现对 离体 小鼠和人类造血祖细胞的分化潜能，这些细胞分离自多种生物来源。此外，由于该方法基于流式细胞术并仅需有限数量的试剂，因此能够以相对低廉的成本在单细胞水平上快速生成大量数据。我们还提供了单细胞分析的分析流程，并结合了可靠的统计学框架。由于该方案可在单细胞水平上关联细胞分裂与分化过程，因此可用于定量评估对称性与不对称性命运决定、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所需的分裂次数。总体而言，该方案可用于旨在从单细胞视角揭示不同造血祖细胞之间生物学差异的实验设计。

FACS 分选 
本方案中呈现的分选设门策略基于广泛认可的策略12,30,31. 对于所示的设门策略 图1，起始材料为先前纯化的脐带血前体细胞 通过 CD34+ 磁性富集，这解释了Lineage阳性细胞比例极低的原因。必须对四种细胞内染料组合（如图中CTV）设置严格的设门，以提高后续分析中峰的分辨率，并准确圈定目标细胞群体。图1D）。如图所示，设门选择的是最大且轮廓更清晰的细胞群。根据我们的经验，每种细胞分裂染料组合出现多个且彼此接近的细胞群，并不反映真实的生物学差异，而可能提示：a）染色步骤未达到最佳状态，或 b）起始细胞群体具有较大的异质性（尤其是细胞大小方面的异质性）。当起始材料为脐带血或其他复杂的生物来源（如骨髓穿刺液、外周血）时，这种情况并不罕见。如果设门范围不够精确，不同染料组合的逐步稀释可能导致后期峰的重叠，尤其是在 CV 和 VC 条件下图 2D次优门控的另一个负面影响是，在细胞培养后无法有效区分不同的峰，因为起始细胞群体的异质性可能导致峰形浅平。
<img alt="流式细胞术分析；细胞分选示意图；标记的坐标轴 FSC、SSC、APC；CD34、CD38 标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：细胞分选的设门策略。（A）FSC-A 与 SSC-A 图，用于排除碎片和污染细胞。（B）FSC-A 与 FSC-H 图，用于排除双联体和细胞团块。（C）Lin 与 FSC-H 图，用于排除 Lin+ 细胞。（D）CTV 与 CFSE 图，用于明确识别用染料组合 CF、CV、VC 和 VI 染色的细胞。设门应足够严格，以确保包含均一的细胞群体。（E）CD34 与 CD38 图，用于将限制性祖细胞 CD34+CD38+（也称为 HPCs）与多能细胞群 CD34+CD38- 分离开。（F）从 CD34+CD38- 群体中分析 CD45RA 与 CD90，以区分最原始的富集于 HSC（CD90+CD45RA-）的祖细胞、LMPP（CD90midCD45RA+）以及更定向的 MPP（CD90-CD45RA-）。（G）分选索引事件，此处显示其细胞染料组合染色情况，以及（H）表面标记物 CD90 和 CD45RA 的表达。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig1v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
细胞培养后的流式细胞术分析 
上述数据 图2 代表在多种细胞因子存在下培养 72 小时的人类脐带血造血干细胞（HSCs），这些细胞因子能够支持多种髓系祖细胞和前体细胞的生长。图示各组 2A 至 二维 表示建立各个单细胞之间亲缘关系所需的设门策略，而各图版 2E 至 2G 允许进行细胞表型分析。图中MEPs数量减少可能是由于本代表性实验所用的培养条件所致（图 2F使用不同的细胞因子和培养条件会改变各亚群的相对百分比，这与选择不同的起始细胞进行实验类似。
<img alt="通过CFSE和CTV标记显示细胞群体的流式细胞术散点图，突出CD34 CD38细胞亚群。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig2v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：流式细胞术分析的设门策略。（A）FSC-A 对 SSC-A，用于排除碎片和污染细胞。（B）FSC-A 对 FSC-H，用于排除双联体和细胞团块。（C）CTV 对 CFSE，设门“Labeled”可用于排除可能影响数据分辨率的自发荧光事件。（D）CTV 对 CFSE。根据细胞分裂染料的稀释情况，严格设门区分四个细胞群极为重要。（E）CD34 对 CD38，用于区分定向前体细胞（CD34-）、限制性祖细胞（HPC）（CD34+CD38+）和未成熟祖细胞（CD34+CD38-）。（F）CD45RA 对 CD123，用于区分三种类型的限制性祖细胞：CMP（CD123+CD45RA-）、MEP（CD123-CD45RA-）和 GMP（CD123+CD45RA+）。（G）CD45RA 对 CD90，从 CD34+CD38-细胞中识别HSCs、LMPPs和MPPs。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
峰的定义与指认步骤（图3 和 图4）是本实验方案中的关键环节，需要设定严格的门控。在进行峰的定义时（图3），至少需要1,000个事件才能实现可靠的识别。因此，在细胞分选步骤中为“Bulk”孔分离更多细胞可能是有益的。图4 展示了四个单孔中包含多个家族的示例。该图阐明了 图2D 和 图3 中门控的重要性，尤其是在识别每个家族及每个峰时。图4A 展示了一个简单的示例，门控CF中的所有细胞彼此非常接近，可轻松归入单一峰。图4C 显示了另一个家族明确分布在两个分离良好的峰上的示例，如 图4D 的直方图中清晰所示。图4E、G 揭示了基于大量事件进行严格门控的重要性；这两个图均显示有少量事件位置接近但位于染料组合门控之外。若仅基于单孔分析，这些事件可能被错误地纳入VI和CF门控中。最后，图4F、H 展示了两个家族分布在多个峰上的不同示例，其中一个为两个强度相似的峰（图4F），另一个为两个强度不同的峰（图4H）。
<img alt="流式细胞术直方图；CFSE、CTV 数据分析；峰代表细胞增殖阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：流式细胞术分析中的峰定义。 （A-D）应至少记录 500 个事件来定义峰，以确保每个独立峰具有良好的代表性。 （A） CFSE-A 荧光强度的直方图。可识别出多个峰，每个峰对应一个不同的分裂细胞群体。 （B,C） 衍生参数（代表 CFSE-CTV 混合物）CV（B）和 VC（C）的荧光强度直方图。 （D） CTV-A 荧光强度的直方图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析，CFSE 和 CTV 散点图，细胞群体鉴定，数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：峰的指认。（A,B）在此孔中，CF 门内仅能检测到一个峰。（C,D）在此孔中，VI 门内可检测到两个强度几乎相等的峰，且峰之间分辨良好。（E,F）在此孔中，VI 门内可检测到两个强度相近的峰。仅考虑了基于混样孔所设定策略的门内事件。（G-H）在此孔中，CF 门内可检测到两个强度不等的峰。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
数据表示与统计检验 
图5 显示了两次独立实验在细胞培养72小时后不同类型的数据呈现结果。造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）在两种不同的细胞培养基中培养，旨在改变细胞分裂与分化特性。这两种培养基分别命名为“Diff”（分化）32 和“GT”33前者促进髓系和红系分化，因其含有促红细胞生成素（EPO）和粒单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）；后者则是在基因治疗临床试验背景下开发，旨在维持并扩增高比例的造血干细胞与祖细胞（HSPCs）。 图 5A “Diff”条件下的代表性热图，展示了多种细胞谱系，涵盖不同的细胞命运和分裂次数。在该热图中，每一行代表一个独立的谱系，每个方块代表一个单独的细胞，各列则将处于相同世代的细胞进行归类（例如，第2代细胞至少经历了两次分裂）。可以区分出高度同质的谱系，即由单一细胞类型组成且分裂次数相同的谱系（如谱系#63），以及异质性谱系，包含跨越两个世代的三种细胞类型（如谱系#84）。由于该分析的细胞回收率约为70%，因此完整谱系（定义为所有细胞均被回收，可能处于不同世代，例如第1代1个细胞、第2代2个细胞的谱系）较为罕见（其编号旁显示井号标记表示） 图5A）。对于检测不完全的情况，存在多种可能的解释，可能是技术性的（如染色问题、因操作步骤导致的细胞丢失），也可能是生物学性的（如细胞死亡和/或凋亡）。可通过使用专门设计以减少单个样本死体积的分析仪，以及在细胞培养板中直接进行细胞染色以减少移液体积，来克服技术上的局限性。相反地，可采用正交方法来测定细胞死亡程度（例如， 通过 活细胞成像实验）有助于区分导致检测不完全的技术因素与生物学因素。
图 5Bi 展示了如何可视化培养条件对细胞类型组成的影响，如同进行了批量检测一样。在此，Diff 条件促进了更多种类的细胞命运，并提高了 CD34 的百分比+ 细胞（定义为除CD34以外的所有细胞类型）-）。置信区间在脚本中计算得出 通过 基础自举法，包含 250,000 个自举数据集34值得注意的是，其余所有直方图中的 图5 显示以相同方法计算的置信区间。 表5 概括了每一代中家族数量和细胞数量的全部信息。
图5Bii 图示表示在脚本“2_bar_plot”中执行的统计检验结果。有关统计框架的正式描述可查阅相关文档26简而言之，该框架在统计假设检验中假设来自同一谱系的细胞具有相关性（这一假设本身可被检验），这与经典统计学要求所有观测细胞之间相互独立的前提相反。在图中所示的具体案例中，统计检验用于验证一个假设：即多能祖细胞（MPPs）的命运选择（通过培养中不同细胞类型的频率来衡量）是否独立于所使用的细胞培养条件。首先，采用G检验统计量来评估不同培养基条件下细胞类型频率之间的差异（以图中示例为例，在 Bii，该统计量以红条表示）。随后，对数据进行随机化处理 通过 置换，即在两种细胞培养条件下交换整个细胞家族。此举旨在保持家族相关细胞之间的依赖性，同时确保每组中的家族数量与原始数据一致。G检验统计量由随机化后的数据集计算得出。图中蓝色数值表示 5Bii 是针对250,000次置换的G检验统计量。最后， p 通过计算该值来评估原始数据集与置换后数据集分布之间的偏离程度。在本示例中，原始统计量与分布存在显著偏离，从而得到一个较小的值 p 因此否定了MPPs的细胞命运与培养条件无关的假设。
图5C 表示每个最大代次的细胞家族所占的百分比，用于探究不同条件如何改变每个细胞家族的细胞分裂情况。该数据图显示，在72 h时，Diff条件下培养的细胞比GT条件下的细胞完成更多的分裂次数。此处表示的是每个家族的最大代次数，因此，一个包含第1代和第2代细胞的家族被视为第2代。可用于图5B的相同统计框架可用于在统计学上检验细胞分裂与培养条件之间的独立性。
图5D 探讨了不同类型祖先细胞（HSCs 或 MPPs）第一次分裂的对称性/不对称性类型。对于第一代中完整的细胞家族——这是唯一能够明确将两个子细胞确定为姐妹细胞的世代——可定义四种不同类型的对称性/不对称性：“对称未分化”（Sym Undiff）指两个子细胞均保留了亲代细胞表型的家族；“对称分化”（Sym Diff）指两个子细胞具有相同但不同于亲代细胞的表型；“不对称未分化”（Asym Undiff）指仅有一个子细胞保留亲代细胞表型；最后，“不对称分化”（Asym Diff）描述的是两个子细胞具有不同表型，且均不同于亲代细胞的家族。为了在评估这些对称/不对称之命运时获得足够的统计学效力，建议在早期时间点进行 MultiGen 分析，以便观察到更多其后代处于第一代的细胞家族。
最后，图5E展示了不同分裂次数下各类细胞所占的百分比，以揭示细胞在分裂过程中分化模式的演变规律。例如，图中数据显示，细胞会逐渐向CD34-状态转变，仅经过三次分裂后，该类别中检测到的细胞比例就已超过50%。此外，可以推断出多能祖细胞（MPPs）并不倾向于进行自我更新式的分裂，因为仅有少量细胞保留了原始的表型。其中部分结论可通过前文图示中所介绍的统计框架进行验证。
<img alt="克隆生成示意图、细胞类型分布图、MPP分化分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：使用脐带血HSPC进行一次72小时实验的数据表示示例。 (A) 选定数据集（HSC，在“Diff”培养基中培养72 h后）的热图。图中每个方块代表单个细胞，按其亲缘关系（行）、经历的分裂次数（列，称为代数）和表型（颜色）进行排列。生物) 比较HSCs和MPPs细胞后代中各类细胞比例在GT条件与Diff条件下的直方图。Bii该图展示了在“2_bar_plot”脚本中对培养72小时的MPPs进行的统计学检验结果，比较了“Diff”与“GT”两种细胞因子组合的效果。实验测得值以红色显示，生成的数值以 通过 250,000 次置换，以蓝色表示。该 p. G检验的P值显示在右上角，括号内为用于检验的家系数量。C) 柱状图比较了每种培养条件下造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）各世代（按颜色编码，共314个家族）所占家族百分比。置信区间通过250,000次自助抽样数据集计算得出。D) 直方图表示在第1代含有两个细胞的家族中，子代细胞命运之间对称性/不对称之类型的分布：对称未分化（Sym Undiff，两个子代细胞均保留来源细胞的表型）、对称分化（Sym Diff，两个子代细胞具有相同的表型，且与来源细胞不同）、不对称未分化（Asym Undiff，仅一个子代细胞保留来源细胞的表型）和不对称分化（Asym Diff，两个子代细胞具有不同的表型，且均不类似于来源细胞）。E使用“Diff”培养基培养的MPP细胞按代次分类的细胞类型贡献比例直方图；n = 204个细胞，97个家族。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
表5：每种实验条件下（细胞来源和细胞培养基）分析的家族数量和细胞数量的描述。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Table_5_revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件 1： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Supplemental_file_1_merge_files.R" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Supplemental_file_2_preprocess_data.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Supplemental_file_3_heatmap_plotting.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 4： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Supplemental_file_4_additional_plots_and_statistics.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。

很少有技术能够同时评估单个细胞的表型和命运。尽管目前用于表征表型的大多数方案虽然能够……

目前仅有少数方法能够快速评估造血祖细胞的功能。本方案用于检测最初的细胞分裂对细胞命运和分化承诺的影响。该方法可在单细胞水平上同时高通量地测量细胞分裂与分化过程，且无需复杂的操作步骤。该方法适用于任何可在培养条件下维持的造血细胞群体，因此可广泛应用于癌症生物学、免疫学和发育生物学研究。实验开始时，将250微升CD34+细胞组分等量分装至四个15毫升聚丙烯管中。按照文稿中的描述标记试管。将 CD34 细胞组分分装 250 µL 至另外四个 15 mL 聚丙烯试管中，并标记试管。按照文稿中的描述配制 CFSE 高浓度和 CFSE 低浓度溶液。向 CF 和 CV 管中加入 250 µL CFSE 高浓度溶液，向 VC 管中加入 250 µL CFSE 低浓度溶液，向 VI 管中加入 250 µL 不含胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。为确保细胞悬液与细胞染料充分混匀，将离心管倾斜约 90 度，沿管壁加入 CFSE 溶液。随后将离心管垂直持握，上下颠倒混匀三至四次，以确保 CFSE 溶液与重悬细胞迅速混合均匀。将悬液在37摄氏度下孵育8分钟。孵育结束后，加入5毫升含10% FBS的DMEM，并将试管置于37摄氏度下5分钟。以300 ×g离心5分钟。用移液法吸除上清液，注意不要扰动沉淀，然后用5毫升PBS、ETDA洗涤沉淀。再次离心试管，并弃去上清液，随后将沉淀重悬于40微升PBS、ETDA中。为了染色CD34+细胞，将抗体配制成主混合液，加入一个0.5毫升的离心管中。向四个 CD34+ 条件样本中各加入 7 微升抗体混合液。分别用约 500 微升染色缓冲液重悬 CD34+ 细胞磁珠样本，用 1 毫升染色缓冲液重悬 CD34- 管中的细胞。进行细胞分选时，通过创建点图设定设门策略。首先，在FSCA与SSCA散点图上观察细胞，并双击多边形门控工具，选择侧向散射光较低的细胞群体。将新创建的门命名为“Cells”。在接下来的FSCA与FSCH散点图中，右键单击图表，从下拉菜单中点击选择“Cells”门。使用相同的设门工具，在两个轴之间的对角线上选择一个紧密的细胞群。将此门标记为单细胞。在第三个点图中，以 APC 与 FSH-H 为参数，显示单细胞群体，并圈选不表达 APC 系列标记的细胞。将新创建的群体标记为谱系阴性。在第四幅图中，即CFSE与CTV图，显示谱系阴性群体，并创建四个独立的门，每个染料组合对应一个门。此处以门VI为例展示。使用第五和第六个图来鉴定目标前体细胞。在第五个图中，宽泛圈选 CD34+CD38- 群体和 CD34+CD38+ 群体。然后，在第六个图中选择 CD34+CD38- 群体，并针对 LMPP、HSC 和 MPP 绘制三个门。运行 CD34+ 组分，至少在单细胞门内记录 5,000 个事件。针对每种染料组合调整门控，设置紧凑的门以选择均一的细胞群体。使用实验分选布局制备分选板模板。标记为 CD34- 的孔中含有 5,000 至 10,000 个细胞，这些细胞根据 CF、CV、VC、VI 门进行分选。批量孔中含有 500 个细胞，根据 CD34+CD38- 门进行分选。单细胞孔每孔仅包含每种细胞分裂染料组合的一个事件，因此每孔总共四个事件。接下来，以得率纯度模式（Yield Purity mode）开始分选 CD34-CF。单击“采集”按钮，然后单击“分选”按钮。先单击“采集”，再单击“分选”按钮，并确保勾选纯度等级为0160。最后，以单细胞纯度模式对目标细胞进行分选，每孔一个细胞，同时确保已勾选“索引分选”选项。将培养板在300 G条件下离心五分钟，然后在通风橱内的纸巾上方迅速倒置培养板以去除上清液。向A1至A4孔中每孔加入8 µL静置缓冲液，随后向其余各孔中每孔加入8 µL混合液。使用多通道移液器向每孔加入100 µL染色缓冲液，以洗涤细胞。离心并弃去上清液，然后将细胞重悬于85 µL染色缓冲液中。使用专用模板，在流式细胞仪上以采集模式开始分析，并点击“Custom”。从列表中选择目标荧光染料后，根据板模板设置孔板布局，校正所含细胞的孔数（至少含有一个细胞的孔）。勾选“振荡”选项，并将采集体积上限设为 100 微升。然后，将采集速率设置为不超过每秒 1 微升，因为较低的速度可提高每孔分析的总体积。为获得代表性门控结果，将不同批量孔的数据合并为单个文件。单击“合并群体”选项后，从“参数”菜单中选择“所有未补偿参数”，然后点击“合并”。将合并后的文件上传到工作区，再通过拖放方式应用补偿矩阵。CV 和 VC 标记的细胞需要进行转换值处理。单击“工具”和“派生参数”以获取转换后的数值。将指定的公式粘贴到公式框中。对每种颜色分别应用门控，以直方图形式显示。对于 CF 和 VI，分别将 CFSE-A 和 CTV-A 设为 X 轴。对于 CV 和 VC，将新衍生的参数设为 X 轴，然后针对每个峰设置门控。将门控应用于每个单独的单细胞孔。务必在每个被分析的孔中添加推导参数。手动检查每个孔的颜色门控，以识别被错误分配到特定峰的事件。细胞培养后的流式细胞术分析需要精确设门，以确定各个细胞之间的亲缘关系及细胞表型特征。峰的界定与指认是流式细胞术分析中的关键环节。直方图展示了家族分布在多个峰上的两个示例，其中一个为两个强度相似的峰，另一个为两个强度不同的峰。此处展示了在72小时后对造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）进行的两个独立实验所采用的不同类型的数据呈现方式及统计检验方法。代表HSC分化条件的热图展示了不同的细胞谱系，包括细胞命运和细胞分裂情况。此处显示了比较HSC和MPP来源细胞谱系命运的直方图。对于这两种细胞类型，均同时展示了GT条件与分化条件之间的比较结果，以及针对MPPs所进行的统计检验。此处展示了比较每代细胞家族百分比及其首次分裂命运对称性或不对称性类型的直方图。同时展示了多能祖细胞（MPPs）每代命运分布及条件分化情况。该操作需要大量分离细胞，以建立适当的设门策略。因此，最好从至少 10,000 个细胞开始染色。将此方法与连续测量技术（如活细胞成像）相结合可能非常强大，因为两者结合可对细胞动力学的早期前体细胞提供详尽的描述。该方法最初由 Hopkins 实验室为 T 细胞生物学研究开发。这一版本经过改进，适用于血液干细胞，现正拓展至癌症和干细胞生物学领域。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过流式细胞术 同时 评估造血干细胞和祖细胞的亲缘关系、分裂数和表型

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。...

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

本方案提供了建立竞争性小鼠骨髓移植实验的逐步指南，用于研究造血干细胞/祖细胞功能，而无需通过细胞分选对干细胞进行预先纯化。...

竞争性移植评估造血干细胞适应性

尽管浸润性巨噬细胞持续从循环前体细胞招募至成体组织，但组织驻留巨噬细胞在发育过程中定植于组织，并在无前体细胞进一步输入的情况下长期维持。近期，组织驻留巨噬细胞的前体细胞已被鉴定。本文介绍了对组织驻留巨噬细胞前体细胞进行遗传谱系示踪的方法。...

通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红髓系祖细胞及其子代

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。...

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。...

利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。...

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

批量基因表达检测会掩盖异质性细胞群体中单个细胞的差异。本文介绍了一种将单细胞基因表达分析与基于荧光激活细胞分选（FACS）的索引分选相结合的实验方案，可用于解析细胞异质性，并在分子水平上对免疫表型不同的细胞亚群进行特征鉴定。...

一种用于表征人类干细胞与祖细胞群体分子及免疫表型异质性的组合式单细胞方法

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内...

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

学习使用流式细胞术同时评估造血干祖细胞的分裂次数、表型特征及亲缘关系。该方法可在单细胞水平高通量分析细胞命运与分化，适用于癌症生物学和免疫学研究。

同时评估亲缘关系、分裂次数和表型通过造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

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同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

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