通过流式细胞术 同时 评估造血干细胞和祖细胞的亲缘关系、分裂数和表型

很少有方法可以快速评估造血祖细胞的功能。该协议测量了第一次细胞分裂对细胞命运和承诺的影响。该协议允许在单细胞水平和高通量下同时测量分裂和分化，而无需复杂和广泛的操作。

该方法适用于任何可以在培养中维持的造血人群。因此，它可以很容易地应用于癌症生物学、免疫学和发育生物学。首先，将 250 微升 CD34+ 级分等分到四个 15 毫升聚丙烯管中。

按照文本手稿中的说明标记管子。将 250 微升 CD34 级分分到另外四个 15 毫升聚丙烯管中并标记管。按照文本手稿中的说明制备 CFSE 高溶液和 CSFE 低溶液。

在 CF 和 CV 管中加入 250 微升 CFSE 高溶液，在 VC 管中加入 250 微升 CFSE 低溶液，在 VI 管中加入 250 微升不含胎牛血清或 FBS 的 Dulbecco 改良鹰培养基或 DMEM。为确保细胞悬浮液在细胞染料中的有效混合，请将试管倾斜 90 度并将 CFSE 溶液沉积在管壁上。然后，垂直握住试管并混合三到四次，以确保CFSE溶液与重悬细胞快速混合。

将悬浮液在 37 摄氏度下孵育 8 分钟。孵育后，加入5毫升含有10%FBS的DMEM，并将试管置于37摄氏度下五分钟。以 300 G 离心管五分钟。

在不干扰沉淀的情况下通过抽吸除去上清液，并用五毫升PBS，ETDA洗涤沉淀。再次旋转试管并弃去上清液，然后将沉淀重悬于40微升PBS，ETDA中。要对CD34 +细胞进行染色，请将抗体预混液制备到单个0.5毫升管中。

将抗体预混液中的 7 微升添加到四种 CD34+ 条件中的每一种。将细胞重悬于染色缓冲液中，CD34 +细胞中的磁珠各使用约500微升，CD34管中的磁珠各使用约500微升。对于细胞分选，通过创建点图来设置门控策略。

首先，在 FSCA 与 SSCA 点图上可视化像元，然后双击多边形门控工具以选择具有低侧散射的种群。将此新创建的门标记为单元格。在下面的点图中，FSCA 与 FSCH 中，右键单击该图，然后单击它从下拉菜单中选择门单元。

使用相同的门控工具在两个轴之间的对角线上选择紧密的种群。将此门标记为单细胞。在第三个点图中，APC 与 FSH-H 显示群体单细胞，并对 APC 谱系表达的阴性细胞进行门控。

将此新创建的人口标记为世系负。在第四个图中，CFSE与CTV显示群体谱系阴性并创建四个单独的门，每个染料组合一个。此处显示的门 VI 作为示例。

使用第五和第六图来识别感兴趣的祖细胞。慷慨地门控CD34 + CD38群体和CD34 + CD38 +在第五图中。然后，在第六个图中选择 CD34+CD38 群体，并为 LMPP、HSC 和 MPP 绘制三个门。

运行CD34 +馏分，在单细胞门中记录至少5， 000个事件。调整每种染料组合的浇口，设置紧密的浇口以选择均匀的群体。使用实验排序布局准备板分类模板。

名为CD34的孔包含5， 000至10， 000个细胞，分选在CF，CV，VC，VI门上。本体孔包含500个在门CD34 + CD38上分选的细胞 - 单细胞孔每个孔的每个细胞分裂染料组合仅包含一个事件，因此每个孔总共包含四个事件。接下来，首先在产量纯度模式下对 CD34-CF 进行分类。

单击"获取"按钮，然后单击"排序"按钮。单击获取，然后单击排序按钮，确保已勾选 0160 作为纯度等级。最后，以单细胞纯度对感兴趣的细胞进行分类，每孔一个细胞，确保勾选索引排序选项。

将板以300 G离心五分钟，并通过在纸巾上快速倒置罩下的板来除去上清液。向孔A1至A4中加入8微升立式缓冲液，然后将8微升混合物添加到其他孔中。使用多通道移液器每孔加入100微升染色缓冲液来洗涤细胞。

离心并除去上清液，然后将细胞重悬于85微升染色缓冲液中。使用专用模板在采集模式下开始流式细胞仪分析，然后单击自定义。从列表中选择感兴趣的荧光团后，按照针对至少包含一个细胞的孔数校正的板模板设置板设置。

勾选搅拌选项并选择 100 微升作为采集体积限制。然后，将采集速率设置为不高于每秒一微升，因为较低的速度会提高每孔分析的总体积。对于代表性浇注，请在单个文件中连接不同的块孔。

单击"串联群体"选项后，从"参数"菜单中选择"所有未补偿的参数"，然后单击"串联"。将级联文件上传到工作区，然后通过拖放应用补偿矩阵。具有 CV 和 VC 的单元格标签需要转换值。

单击"工具"和"派生参数"以获取转换后的值。将指示的公式粘贴到公式框中。将门控作为直方图分别应用于每种颜色。

对于 CF 和 VI，分别在 X 轴上设置 CFSE-A 和 CTV-A。对于CV和VC，在X轴上设置新导出的参数，然后设置对应于每个峰的门。将门控应用于每个单独的单细胞孔。

确保将派生参数添加到每个分析孔中。手动验证每个孔的每个色门，以检测错误分配给给定峰的事件。细胞培养后的流式细胞术分析需要精确的门控，以确定每个细胞的亲属关系以及细胞表型。

峰定义和分配是流式细胞术分析的关键方面。直方图显示了分布在多个峰上的两个家族示例，一个是两个相似的强度峰，另一个是具有两个不同强度峰的家族。这里显示了不同类型的数据表示和统计测试，用于在 72 小时后对 HSC 和 MPP 进行的两个独立实验。

条件HSC分化的热图代表了细胞命运和细胞分裂中的不同细胞家族。此处显示了比较命运HSC和MPP衍生细胞家族的直方图。对于这两种细胞类型，条件GT和条件分化之间的比较与对MPP执行的统计测试一起显示。

此处显示了比较每代细胞家族百分比以及第一次分裂命运对称或不对称类型的直方图。此处显示了MPPs每代命运的分布和条件分化。此过程需要大量分离细胞以设置适当的设门策略。

因此，最好用至少10， 000个细胞开始染色。将这种方法与连续测量相结合，就像活细胞想象一样，可能非常强大，因为两者一起可以提供细胞动力学早期祖先的详细描述。这种方法最初是由霍普金斯实验室为T细胞生物学开发的。

这个版本适用于血液干细胞，现在正在扩展到癌症和干细胞生物学。