灵长类动物诱导的多能干细胞来源于尿液的产生和维持

灵长类IPSC是有用的，但由于伦理和技术问题，往往难以获得。该协议为灵长类IPSC的生成和维护提供了最容易获得的途径。使用泌尿细胞作为IPSC的主要来源具有很大的优势，因为它们可以以完全非侵入性的方式获得，无需任何特殊技术。

演示该程序的将是来自Wolfgang M.S.Laboratory的博士生Jessica Radmer。首先，将含尿管以400G离心10分钟。然后小心地吸出上清液，在管中留下约一毫升并将沉淀重悬于其中。

通过加入10毫升含有两性霉素的尿洗涤缓冲液来洗涤细胞，并使用血清移液管小心地混合悬浮液。离心后，小心吸出上清液，在管中留下约小于0.2毫升。将细胞沉淀重悬于每 50 毫升初始处理的尿液中含有两性霉素的一毫升原代尿培养基中。

除去明胶，将一毫升悬浮液加入涂有明胶的12孔板中。将板在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育。为了制备涂覆12孔板的基底膜基质，每孔加入500微升基底膜基质。

移动板以分配液体并在 37 摄氏度下孵育一小时。孵育后，用900微升REMC培养基替换基底膜基质，并在37摄氏度下储存直至使用。使用公式计算五种感染的多种感染所需的仙台病毒数量。

在37摄氏度回火的水浴中快速解冻仙台重新编程套件的组件。在加入计算体积的仙台病毒并混合之前，将REMC培养基总共100微升加入管中。如手稿中所述解离泌尿细胞后，使用细胞计数器计数细胞并将所需数量的细胞转移到1.5毫升管中。

通过离心获得沉淀并将其重悬于100微升制备的仙台病毒混合物中。将试管在 37 摄氏度下孵育一小时以治疗悬浮液感染。孵育后，将REMC加入至总共一毫升，然后将细胞悬液接种在涂有12孔板的基底膜基质中。

转导后，每隔一天更换培养基，直到诱导多能干细胞或IPSC集落发育，并在第五天切换到PSC生成培养基。当IPSC菌落长到足以进行团块传代时，从培养的细胞中吸出培养基，并用500微升DPBS仔细洗涤细胞。取出DPBS后，向孔中加入500微升0.5毫摩尔EDTA并孵育两到五分钟。

在显微镜下仔细观察细胞，直到菌落开始分离。当菌落的边缘开始剥落并且细胞之间的间隙变得可见时，取出EDTA并小心地加入500微升DPBS。吸出DPBS并使用P-1000移液器用500微升PSC培养基冲洗孔。

上下移液，将菌落分散成适当大小的团块。根据汇合度，所需接种细胞密度和IPSC克隆偏好，将1/10至1/50的细胞团块悬浮液转移到新孔中。轻轻地来回移动板几次，以将团块均匀地分布在孔中。

将板在 30 摄氏度下孵育至少 37 分钟，让团块附着。每两到三天更换一次培养基，直到菌落长到足以传代。分离后，可以看到鳞状细胞和各种较小的圆形细胞随尿液排出体外。

可以看到第一个贴壁增殖细胞，这些细胞生长成可以传代的大菌落。可以看到两种不同的细胞类型，一种具有上皮样表型，另一种显示出具有细长形状的间充质样表型。第一次传代后，泌尿细胞以单层形式生长。

在IPSC的生成过程中，可以看到一些贴壁细胞，这些细胞开始显示出形态变化，表明细胞的重编程。此外，形成集落的细胞显示出典型的胚胎干细胞形态。所有生成的IPSC都具有典型的胚胎干细胞样集落形态，其特征是紧密堆积的细胞具有清晰的边缘。

免疫细胞化学用于测试大猩猩IPSC中多能性相关标志物的表达。此外，流式细胞术分析表明，分析的猩猩IPSC对TRA-1-60呈阳性。此外，大猩猩IPSC能够分化为内胚层，中胚层和外胚层谱系。

分化细胞数量的增加以及边界完整性和均匀性的丧失表明IPSC质量差。相比之下，明确的边界、紧密的细胞包装和突出的核仁意味着高质量的IPSC。由于冠状变异性，需要优化克隆的特定条件，如分裂率、传代时间和团块大小，以保持灵长类IPSC的健康生长。

作为已建立的IPSC的质量控制，除了检查标记基因表达外，还可以通过直接或间接分化诱导（例如体外EV分化）来验证前效性。