Name: 灵长类动物诱导的多能干细胞来源于尿液的产生和维持 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 了解利用尿液细胞通过仙台病毒重编程技术生成和维持灵长类动物诱导多能干细胞的方法。该非侵入性方案为干细胞生物学和再生医学研究提供了重要的技术支持。

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本工作由 DFG EN 1093/5-1（项目编号 458247426）资助。M.O. 受日本学术振兴会（JSPS）海外研究奖学金支持。所有图示使用 BioRender.com 制作。流式细胞术在慕尼黑生物医学中心核心设施流式细胞术平台的协助下完成。我们谨向 ASHBi 的 Makoto Shida 和 Tomoyo Muto 表示感谢，&#160;京都大学，感谢其对视频拍摄的支持。

本实验方案已获得负责人体实验的伦理委员会批准（20-122，慕尼黑大学伦理委员会）。所有实验均按照相关指南和规定进行。 
注意：在开展涉及人类和非人灵长类动物（NHP）样本的实验前，必须获得相应伦理委员会的批准。所有实验操作均须遵循相关指南和规定。以下每一步操作均应在生物安全柜中采用无菌技术进行。所有缓冲液和培养基的组成详见补充表 S1。确保所有培养基在加入细胞前已升温至室温（22 °C）。除非特别说明，所有离心步骤均应在室温下进行。
1. 从尿液样本中分离细胞
注意：确保人类供者无人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）。对于非人灵长类动物（NHP），须确认可能的供者/细胞无特定病原体——B病毒（BV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴β逆转录病毒（SRV）和猴T细胞嗜淋巴细胞病毒（STLV）。
<ol>
	<li>通过向每个孔中加入 500 µL 的 0.2% 明胶，制备明胶包被的 12 孔板，并通过移动平板使液体均匀分布。使用前置于 37 °C 下至少孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 50 mL 锥形管收集人尿液样本。对于非人灵长类动物，使用注射器从动物饲养设施的地面收集尿液。 
	注意：已有研究表明，5 mL 尿液体积足以在 42% 的实验尝试中分离出至少一个克隆。然而，建议使用约 50 mL 的较大体积以提高克隆分离的成功率。非人灵长类动物（NHP）的尿液应尽可能新鲜采集，最好在排尿后立即取样。尿液样本在 4 °C 下保存 4 小时对本方案的成功率无负面影响，但更长时间的保存尚未测试。</li>
	<li>将含有尿液的管在 400 × g 条件下离心 10 分钟，小心吸除上清液，保留约 1 mL 沉淀于管中。</li>
	<li>用残留的 1 mL 液体重悬沉淀。若收集了多个尿液管，可将所有悬液合并至同一管中。</li>
	<li>向管中加入含 2.5 µg/mL 两性霉素的 10 mL 尿液洗涤缓冲液（参见 补充表 S1），用移液管轻轻混匀细胞悬液。</li>
	<li>将管在 200 × g 条件下离心 10 分钟，小心吸除上清液，保留约 &lt;0.2 mL 液体于管中。</li>
	<li>用 1 mL 初级尿液培养基（参见 补充表 S1）重悬细胞沉淀，每 50 mL 初始处理的尿液中含 0.5 µg/mL 两性霉素（即使处理的尿液少于 50 mL，也使用 1 mL 重悬）。</li>
	<li>吸除第 1.1 步中制备的孔内明胶，将第 1.7 步所得悬液 1 mL 接种至 12 孔板的一个孔中。根据所需孔数或可用悬液量重复操作。 
	可选：为避免因不洁采样引入污染，从此时起至首次传代前，可在细胞中添加 100 µg/mL 抗微生物试剂。</li>
	<li>将平板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。</li>
	<li>从第 1 天至第 5 天，每天为每孔添加 1 mL 初级尿液培养基，无需移除原有培养基。</li>
	<li>第 5 天时，从平板中吸除 4 mL 培养基，每孔保留约 1 mL。每孔加入 1 mL REMC 培养基（参见 补充表 S1），使新旧培养基形成 1:1 混合液。</li>
	<li>自此时起每日更换一半培养基为 REMC 培养基，直至首次出现克隆（图 1A、B）。即每孔移除 1 mL 旧培养基，加入 1 mL 新鲜 REMC 培养基。</li>
</ol>
2. 尿液细胞的扩增
注意：尿液细胞传代应在培养物达到 90% 汇合度之前进行。
<ol>
	<li>按照步骤 1.1 所述，准备所需数量的明胶包被 12 孔板。</li>
	<li>吸除旧培养基，并加入 1 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。</li>
	<li>吸除 DPBS，加入 300 µL 用 DPBS 稀释的 0.5 倍解离酶。将培养板置于 37 °C 培养 5 分钟。</li>
	<li>加入 700 µL REMC 培养基以终止酶反应。使用 P1000 移液器轻轻吹打悬液，直至细胞完全解离为单细胞状态。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 1 mL REMC 培养基中。</li>
	<li>使用细胞计数仪（血细胞计数板或自动细胞计数仪）对细胞进行计数。</li>
	<li>为扩增尿源性细胞，将 1.5 × 104 至 3 × 104 个细胞接种于 1 mL REMC 培养基中，接种至经 0.2% 明胶包被的 12 孔板中的一个孔内。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基，直至细胞培养达到 80%–90% 汇合度。操作时，吸除旧培养基并加入 1 mL 新鲜 REMC 培养基。</li>
</ol>
3. 通过仙台病毒载体感染生成诱导多能干细胞
注意：重编程操作流程请参见图2A。用于重编程的尿液细胞应尽可能年轻，但在第4代之前，重编程效率未见显著下降。仙台病毒重编程试剂盒必须在生物安全二级（BL-2）实验室中使用。操作病毒时应在具有层流的生物安全柜内进行，并始终使用适当的防护设备，以防止黏膜暴露。
<ol>
	<li>通过向每个孔中加入 500 µL 基底膜基质，制备包被基底膜基质的 12 孔板，并通过移动培养板使液体均匀分布。将培养板在 37 °C 下孵育至少 1 h，然后用 900 µL REMC 培养基替换基底膜基质。将培养板保存在 37 °C 下，直至使用。</li>
	<li>将仙台病毒重编程试剂盒的组分在 37 °C 水浴中快速解冻。将仙台病毒（多顺反子 KLF4-OCT3/4-SOX2、cMYC 和 KLF4）按 MOI 为 5 的比例混合，并用 REMC 培养基补至 100 µL。使用公式 (1)： 
	<img alt="用于计算 MOI 的病毒体积公式，显示为实验室使用的数学方程。" src="/files/ftp_upload/64922/64922eq1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	注意：由于不同批次的病毒滴度存在差异，务必查阅制造商提供的分析证书中的滴度信息。 
	可选：可额外使用绿色荧光蛋白（GFP）仙台病毒作为转导效率的阳性对照。为此，在步骤 3.3 中另取一个离心管准备额外的 3.5 × 104 个细胞。</li>
	<li>按照步骤 2.2–2.4 对尿液细胞进行解离。使用细胞计数仪计数细胞，并将 7 × 104 个尿液细胞转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>以 200 × g 离心 5 min，小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。将沉淀重悬于 100 µL 步骤 3.2 中制备的 SeV 混合液中。在 37 °C 下孵育 1 h，进行悬浮感染。</li>
	<li>将上述细胞悬液接种至步骤 3.1 中制备的包被基底膜基质的 12 孔板中。常规操作中，每孔接种 1 × 104 和 2.5 × 104 个细胞，设复孔。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育。转导后 24 h 及第 3 天，更换为 1 mL 新鲜的 REMC 培养基。</li>
	<li>转导后第 5 天，将培养基更换为 PSC 生成培养基（参见补充表 S1），之后每隔一天更换一次培养基。操作时，移除旧培养基，并向每孔加入 1 mL PSC 生成培养基。 
	注意：首次出现克隆可能需要长达 15 天。</li>
	<li>当 iPSC 克隆的直径超过 1 mm 时，挑取单个克隆。操作时，在显微镜下用 p10 移液器刮取并小心收集单个克隆。将克隆转移至含有 750 µL PSC 培养基且已包被基底膜基质的新 12 孔板孔中。 
	可选：在挑取前用 DPBS 冲洗培养板，并用 0.5 mM EDTA 处理 1 min，有助于后续步骤的稳定培养。若需延长培养时间以等待后期出现的克隆，则不应进行此 EDTA 处理步骤。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养，并按照本方案第 4 节所述，每隔一天更换一次培养基。当挑取的克隆直径达到 2 mm 时，按照本方案第 5 节所述方法进行常规 iPSC 传代。</li>
</ol>
4. 培养基更换
注意：培养基应每隔一天更换一次，直至菌落生长至足够大，可用于传代。
<ol>
	<li>吸弃旧培养基，每孔添加 750 µL 新鲜培养基。如需更换不同类型的培养基，应在传代后至少 1 天再进行换液。</li>
</ol>
5. 传代
注意：当iPSC集落生长至足够大（直径 &gt; 2 mm），或集落即将相互接触时，应进行传代。通常情况下，iPSC每约5天可传代一次。常规维持培养使用集落块传代法（步骤5.1），而需要确定细胞数量的实验则采用单细胞传代法（步骤5.2）。若iPSC出现大量分化，可通过集落挑选法（步骤5.3）提高培养物的纯度。
<ol>
	<li>团块传代
	<ol>
		<li>通过加入基底膜基质包被12孔板 500 µL 每孔加入基底膜基质，并通过移动培养板使液体分布均匀。将培养板置于 37 °C 至少 1 h。用新的基底膜基质替换原有的基底膜基质 500 µL PSC 培养基，并将培养板置于 37 °C 直至使用。</li>
		<li>吸除培养细胞的培养基，并通过小心加入缓冲液洗涤细胞 500 µL DPBS。移除DPBS并加入 500 µL 加入0.5 mM EDTA至孔中。</li>
		<li>在室温下孵育培养板 2-5 分钟，直至菌落开始脱落。在显微镜下仔细观察细胞。</li>
		<li>当菌落边缘开始翘起，细胞之间出现可见间隙时（图3A），去除EDTA并 仔细地 添加 500 µL DPBS 的 
		注意：移液时应始终沿孔板侧壁加入，切勿直接加在细胞上，以免使细胞从板底脱落。</li>
		<li>吸除 DPBS，并用缓冲液冲洗孔板 500 µL 使用 p1000 移液枪加入 PSC 培养基。上下吹打 1 至 5 次，将细胞集落分散为适当大小的细胞团块（图3A). 不要吸取过多液体. 
		注意：如果iPSCs被反复吹打过多，则添加 10 µM 在培养基中加入ROCK抑制剂Y-27632。这可以提高细胞存活率，因为iPSCs无法以单细胞形式存活。</li>
		<li>将细胞团悬液的1/10至1/50转移至新孔中。具体比例取决于传代前孔内细胞的融合度、接种细胞所需的密度以及iPSC克隆的生长偏好。</li>
		<li>轻轻前后移动培养板数次，使团块在孔中均匀分布。将培养板在至少30分钟内孵育于 37 °C 让聚集体附着。</li>
		<li>更换培养基 750 µL 若观察到大量漂浮的死细胞，则更换PSC培养基；否则，添加 250 µL PSC 培养基中。将培养板置于 37 °C 和5% CO2 在培养箱中。 
		注意：30 分钟后更换培养基至关重要，特别是对于不稳定的细胞系（例如，NHPs）。</li>
		<li>每2-3天更换一次培养基，直至菌落生长至适合传代的大小。更换培养基时，请遵循方案中的第4步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞传代
	<ol>
		<li>按照步骤 5.1.1 所述制备包被有基底膜基质的培养板，并添加 10 µM 将 Y-27632 加入 PSC 培养基中。 
		可选：添加 10 µM 在传代前1-3小时向细胞中加入Y-27632，以提高敏感细胞系的存活率。</li>
		<li>吸弃培养基，通过加入缓冲液洗涤细胞 500 µL DPBS。移除 DPBS 并添加 300 µL 加入消化液至各孔。</li>
		<li>在培养板中孵育 37 °C 5-10 分钟。在显微镜下观察到细胞充分脱落时，加入 700 µL PSC 培养基或 DPBS。</li>
		<li>使用P1000移液器上下吹打5-10次，直至细胞完全解离成单细胞。 吸取时不要过量，以防止细胞损伤.</li>
		<li>将细胞悬液转移至含有至少 2 mL DPBS 的 15 mL 管中，以稀释消化液。</li>
		<li>以 200 × g 离心试管 g 孵育5分钟，然后完全吸除溶液，注意不要破坏细胞沉淀。</li>
		<li>将沉淀物重悬于 500 µL PSC 培养基添加补充剂 10 µM Y-27632</li>
		<li>计数细胞，并将5,000-7,000个细胞接种至每孔经基底膜基质包被的12孔板中，该12孔板按步骤5.2.1制备。 
		注意：如果需要不同的细胞数量，应相应更换为更大或更小的孔。</li>
		<li>将培养板在至少30分钟内孵育 37 °C 和5% CO2 让细胞贴壁。</li>
		<li>更换培养基 750 µL PSC 培养基 + 10 µM 若观察到大量死亡细胞，则添加 Y-27632；否则，添加 250 µL + 10 µM Y-27632 
		注意：此步骤十分关键，尤其对于不稳定的细胞系（例如，NHPs）。</li>
		<li>将培养板置于 37 °C 和 5% CO2 在培养箱中。</li>
		<li>传代后1至2天，将培养基更换为不含Y-27632的PSC培养基，以使细胞重新呈现典型的集落形态（图3B).</li>
		<li>每2天更换一次培养基，直至菌落生长至足够大小。更换培养基的操作请参照方案第4节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过克隆挑取传代iPSCs
	<ol>
		<li>按照步骤5.1.1所述，制备已包被基底膜基质的12孔板。</li>
		<li>吸除培养基，并通过小心加入缓冲液洗涤细胞 500 µL DPBS。吸除 DPBS，然后加入 500 µL 加入0.5 mM EDTA至孔中。</li>
		<li>在室温下孵育培养板1-3分钟，并在显微镜下观察细胞，直至可见克隆边缘出现脱落。</li>
		<li>去除 EDTA 并 仔细地 添加 500 µL DPBS。在缓慢添加之前吸除液体 500 µL 向孔中加入PSC培养基， 不脱离细胞.</li>
		<li>使用 p200 移液枪在显微镜下挑取目标克隆，避免收集已分化细胞。操作时，轻柔刮取克隆区域，同时吸取含有细胞的培养基。</li>
		<li>将每个挑选的菌落转移至一步骤5.3.1中准备好的基底膜基质包被的孔中。使用p1000移液器将细胞吹打2–5次，使细胞解离成小团块。</li>
		<li>在30分钟内将培养板孵育于 37 °C 和5% CO2，使团块得以附着。</li>
		<li>更换培养基 750 µL 若观察到大量悬浮的死亡细胞，则添加PSC培养基；否则，添加 250 µL PSC 培养基 
		注意：30 分钟后更换培养基至关重要，尤其是对于不稳定的细胞系（例如，NHPs）。</li>
		<li>将培养皿置于 37 °C 和5% CO₂2 在培养箱中。</li>
		<li>每2-3天更换一次培养基，直至菌落生长至足够传代的大小。具体操作请参照方案第4节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 尿液细胞和iPSCs的长期保存冻存
注意：通常，iPSCs 以细胞团块形式在细胞冻存液中进行常规冻存，无需计数。操作中应尽量减少移液，以避免细胞解离为单细胞。对于尿源性细胞，通常每管冻存 1.5 × 104 至 3 × 104 个细胞，以便使用者可直接将一管细胞解冻接种于 12 孔板的一个孔中，无需再次计数。
<ol>
	<li>在15 mL离心管中准备5 mL DPBS。</li>
	<li>冷冻尿液细胞时，请按照本方案的步骤2.2-2.4进行操作；冷冻iPSCs时，请按照集落传代方案中的步骤5.1.2-5.1.5进行操作。</li>
	<li>将细胞悬液转移至步骤6.1中准备好的15 mL离心管中。对于尿液细胞的冷冻，取10 µL细胞悬液使用血细胞计数板进行计数。以200 × g离心5分钟，并彻底吸除上清液。</li>
	<li>每管中用400 µL细胞冻存液重悬细胞沉淀，并将细胞分装至所需数量的冻存管中。</li>
	<li>立即将冻存管转移至-80 °C冰箱。在-80 °C冷冻1天后，将冻存管转移至-150 °C超低温冰箱或液氮中进行长期保存。</li>
</ol>
7. 尿源细胞和iPSC的解冻
<ol>
	<li>对于尿液细胞的解冻，按照方案第1.1步所述，准备所需数量的明胶包被12孔板。对于iPSCs，按照第5.1.1步所述，准备基底膜基质包被的12孔板。在这两种情况下，均不得用培养基替换基质。</li>
	<li>准备一个含有4 mL DPBS的15 mL离心管，并将其置于37 °C环境中预热。</li>
	<li>将冻存的细胞冻存管迅速放入37 °C水浴中解冻，直至观察到有浮冰残留。 
	注意：在水浴孵育前后，需用乙醇擦拭冻存管表面，以避免污染。</li>
	<li>向含有冰晶的细胞悬液中加入500 µL REMC培养基（用于尿液细胞）或500 µL PSC培养基（用于iPSCs），并立即将该悬液转移至第7.2步中已预热的15 mL离心管中。</li>
	<li>以200 × g 离心5分钟，然后彻底弃去上清液。</li>
	<li>对于尿液细胞，将沉淀重悬于1 mL REMC培养基中；对于iPSCs，小心地将沉淀重悬于750 µL PSC培养基中。避免过度吹打，以保持细胞团块完整。 
	可选：在培养基中添加10 µM Y-27632有助于提高iPSCs解冻后的存活率。</li>
	<li>吸除第7.1步准备的12孔板中的基质，然后小心地将细胞悬液转移至孔中。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日，更换培养基：iPSCs使用不含Y-27632的PSC培养基，尿液细胞则使用REMC培养基。</li>
	<li>将细胞继续在37 °C、5% CO2的培养箱中培养。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基，直至细胞生长至适合传代的密度。换液操作请参照本方案第4节。</li>
</ol>
8. 免疫细胞化学
注意：利用靶向多能性相关标志物（如 NANOG、OCT3/4、SOX2、TRA-1-60 和 EpCAM）的抗体进行免疫染色，是新生成的诱导多能干细胞（iPSCs）最常用的验证方法之一。有关抗体及稀释比例的详细信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>在使用前1-3天，将iPSC接种于适当数量的12孔板中。吸除培养基，加入500 µL DPBS洗涤细胞，随后移除DPBS。每孔加入400 µL 4%多聚甲醛（PFA），在室温下固定细胞15分钟。</li>
	<li>移除4% PFA，用DPBS洗涤细胞3次。每孔加入400 µL封闭缓冲液，在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>吸除封闭缓冲液，将抗体用400 µL抗体稀释缓冲液（ADB）稀释后加入各孔。将培养板置于4 °C过夜孵育。</li>
	<li>移除含一抗的ADB，用DPBS洗涤细胞3次。</li>
	<li>吸除DPBS，每孔加入400 µL用ADB稀释的二抗。在室温避光条件下孵育1小时。</li>
	<li>移除ADB，用DPBS洗涤细胞3次。每孔加入用DPBS稀释的1 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室温孵育3分钟。</li>
	<li>吸除DAPI溶液，用DPBS洗涤细胞3次。每孔加入500 µL DPBS用于成像。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

诱导多能干细胞（iPSCs）是一类有价值的细胞类型，因为它们能够在体外生成其他方式难以获得的细胞类型。in vitro。由于重编程的起始材料（例如成纤维细胞）并非在所有灵长类物种中都容易获取，本文提供了一种从尿液来源细胞生成iPSCs的实验方案。这些细胞可以通过添加广谱抗生素的培养基，以非侵入性方式获得，甚至可从非无菌的灵长类尿液样本中分离。
该方案中有几个关键步骤值得进一步讨论。首先，在从非无菌尿液中分离细胞时，重要的是在培养基中添加广谱抗菌试剂，以降低污染风险。即使使用了抗生素，若仍出现明显的微生物污染生长，则建议丢弃整个培养物并对操作区域进行消毒；此外，根据我们的经验，继续培养无法获得健康生长的尿源性细胞。其次，在开始重编程细胞时，强烈建议制备多个接种了不同数量SeV转导细胞的培养皿，以避免因细胞过度融合导致所有细胞脱落，并提高获得诱导多能干细胞（iPSC）的概率。通常情况下，接种较高密度的SeV转导细胞有望获得更多的重编程iPSC克隆，而将重编程细胞培养约20天则常常导致过度融合，继而引起整个孔内细胞的脱落。第三，在需要解离iPSC的每一步操作中，至关重要...

人类与非人灵长类动物（NHPs）的基因组比较对于理解我们的进化历史以及人类特有性状的演化至关重要1。此外，这些比较还可通过识别保守的DNA序列来推断功能2，例如用于优先筛选与疾病相关的变异位点3。对基因表达水平等分子表型的比较对于更深入解读基因组差异、发现细胞层面的表型差异具有重要意义。同时，它们与DNA水平的比较类似，具有推断功能相关性的潜力，从而有助于更好地解释人类内部具有医学意义的遗传变异4。将全面的分子表型数据整合到这些比较研究中，需要合适的生物学资源（即跨物种的同源细胞）。然而，由于伦理和实际操作上的限制，获取此类可比细胞，尤其是在发育过程中的细胞，往往困难甚至不可能。诱导性多能干细胞（iPSCs）能够在体外生成这些难以获取的细胞类型in vitro5,6，具有良好的实验可及性，并已被广泛应用于灵长类动物的比较研究6,7,8,9,10,11,12,13,14。
为了生成诱导多能干细胞（iPSCs），需要获取用于重编程的原代细胞。尿液来源的细胞具有优势，因为它们可以从灵长类动物中无创采集，并且易于进行重编程，这可能与其类似干细胞的分子特征有关15。维持灵长类动物iPSCs的培养条件与重编程同样重要；传统上，人类多能干细胞的培养需要使用成分未定义的含血清培养基，并与小鼠胚胎成纤维细胞（即所谓的饲养层细胞）共培养，后者为胚胎干细胞（ESCs）提供必要的营养物质和生长支架16。自化学成分明确且无需饲养层的培养系统发展以来17,18，目前已有多种市售的iPSC培养基和基质可供选择。然而，这些培养条件大多针对人类ESC和iPSC进行了优化，因此在非人灵长类动物（NHP）iPSC培养中可能效果较差。在本视频方案中，&#160;我们提供了从尿源性细胞培养中生成并维持人类及非人灵长类动物iPSC的操作指南。
自首次报道诱导多能干细胞（iPSC）的生成以来&#160;通过2006年在成纤维细胞中强制表达特定因子实现，该方法已被应用于多种不同来源的细胞类型19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32其中，只有尿源性细胞能够以完全无创的方式获取。该方法基于Zhou等人先前描述的方案。33，即使使用非无菌样本，也可通过添加广谱抗生素从灵长类动物尿液中分离并扩增细胞15值得注意的是，通过本方案采集的尿源性细胞具有较高的诱导多能干细胞（iPSCs）生成潜力，且所需时间更短&#160;（集落通常在5-15天内可见），相较于传统成纤维细胞重编程（据我们经验为20-30天）更快速，且具有足够高的成功率。这些尿液来源的细胞被归类为间充质干细胞样细胞与膀胱上皮细胞的混合群体，正是这一特性导致了较高的重编程效率15.
除了原代细胞的差异外，诱导生成iPSCs的重编程方法也根据使用目的的不同而有所差异&#160;。传统的人体体细胞重编程方法通常通过逆转录病毒或慢病毒载体过表达重编程因子，这类方法会导致外源DNA整合到基因组中5,34,35。为了保持所获得的iPSCs基因组的完整性，研究人员已开发出多种非整合型系统，包括可切除的PiggyBac载体36,37、附加体型载体38,39、非整合型病毒载体（如仙台病毒40和腺病毒41）、mRNA转染42、蛋白质转染43,44以及化学小分子处理45。由于其高效性和操作简便性，本实验方案采用基于仙台病毒的重编程载体。在接种前，将原代细胞与病毒在感染复数（MOI）为5的条件下进行1小时的悬浮培养以完成感染。与传统的直接将病毒加入贴壁细胞培养液中的方法相比，这一改进步骤可提高细胞表面与病毒接触的概率，从而获得更多的iPSC克隆15。
人类和非人灵长类多能干细胞的传代可通过克隆传代和单细胞传代方式进行。乙二胺四乙酸（EDTA）是一种成本较低的螯合剂，可结合钙离子和镁离子，从而抑制钙黏蛋白和整合素的黏附活性。EDTA也可作为温和且具有选择性的解离试剂，因为未分化细胞由于表达不同的黏附分子，会先于已分化细胞脱落。然而，完全解离会导致灵长类诱导多能干细胞大量死亡。 通过 Rho/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho/Rock）介导的肌球蛋白过度活化。因此，在需要悬浮单细胞的实验中，向培养基中添加Rho/Rock抑制剂至关重要46,47在本实验方案中，我们推荐将团块传代作为常规的传代方法&#160;仅在必要时推荐单细胞传代，例如需要接种特定数量细胞时，或在亚克隆过程中。

<table><tbody><tr><td>Accumax&amp;trade; 细胞解离液（&lt;em&gt;解离溶液&lt;/em&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B溶液</td><td>Merck</td><td>A2941-100ML</td><td></td></tr><tr><td>抗人TRA-1-60小鼠抗体&amp;nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60064</td><td>稀释比例：1/200</td></tr><tr><td>抗人TRA-1-60 PE标记抗体&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-122-965</td><td>稀释比例：1/50</td></tr><tr><td>Bambanker&amp;trade;（&lt;em&gt;细胞冻存培养基&lt;/em&gt;）</td><td>Nippon Genetics</td><td>BB01</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养多孔板，12孔CELLSTAR</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Countess&amp;trade; II 自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>CryoKing&amp;reg; 1.5 mL 带二维条码的冻存管（&lt;em&gt;冻存管&lt;/em&gt;）</td><td>Sued-Laborbedarf</td><td>52 95-0213</td><td>可用于冻存的冻存管类型多样。带二维条码的冻存管优势在于可将样本信息与唯一的管编号一同存储于数据库中。</td></tr><tr><td>CytoTune&amp;trade; EmGFP 副流感病毒荧光报告系统（&lt;em&gt;GFP副流感病毒&lt;/em&gt;）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16519</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune&amp;trade;-iPS 2.0 副流感病毒重编程试剂盒（&lt;em&gt;副流感病毒重编程试剂盒&lt;/em&gt;）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基</td><td>TH.Geyer</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>15373541</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor&amp;trade; 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor&amp;trade; 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21207</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>不含钙、不含镁的DPBS</td><td>TH.Geyer</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM重组多克隆兔抗体（22 HCLC）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>710524</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL锥底离心管</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL锥底离心管</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，热灭活，巴西来源（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10.8.2</td><td>FlowJo&amp;nbsp;</td><td>663441</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&amp;trade; LDEV-free、hESC认证、低生长因子基底膜基质</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&amp;trade; 添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&amp;trade; 240i CO2培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>16416639</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus HeraSafe生物安全柜</td><td>Kendro</td><td>51017905</td><td></td></tr><tr><td>人EGF，优质级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-749</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&amp;nbsp;</td><td>Fiji</td><td>版本 2.9.0</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯微量离心管，1.5 mL</td><td>Nerbe Plus</td><td>04-212-1000</td><td></td></tr><tr><td>尼康Eclipse TE2000-S显微镜</td><td>Nikon</td><td>TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗甲胎蛋白抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1420</td><td>稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>小鼠抗β-III微管蛋白抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1195</td><td>稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>mTeSR&amp;trade; 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog (D73G4) XP 兔单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4903S</td><td>稀释比例：1/400</td></tr><tr><td>Normocure&amp;trade;（&lt;em&gt;抗菌试剂&lt;/em&gt;）</td><td>Invivogen</td><td>ant-noc</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4兔抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2750S</td><td>稀释比例：1/400</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（PS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>青霉素-链霉素混合液包含100 U/mL青霉素和100 &amp;micro;g/mL链霉素。</td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>重组人血小板源性生长因子AB（PDGF-AB）</td><td>PeproTech</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>台式制冷离心机</td><td>SIGMA&amp;nbsp;</td><td>4-16KS</td><td></td></tr><tr><td>肾上皮细胞基础培养基</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-030</td><td></td></tr><tr><td>肾上皮细胞生长因子试剂盒</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-040</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 (L1D6A2) 小鼠单克隆抗体 #4900</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4900S</td><td>稀释比例：1/400</td></tr><tr><td>SSEA4 (MC813) 小鼠单克隆抗体</td><td>NEB</td><td>4755S</td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>StemFit&amp;reg; Basic02</td><td>Nippon Genetics</td><td>3821.00</td><td>该培养基已停止生产，建议改用StemFit Basic04CT（适用于人细胞系）或StemFit Basic03（适用于非人灵长类动物）。</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&amp;trade; Select酶（1x），无酚红（&lt;em&gt;解离酶&lt;/em&gt;）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>Precision GP 05水浴锅</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632，二盐酸盐（&lt;em&gt;ROCK抑制剂&lt;/em&gt;）</td><td>Biozol</td><td>BYT-ORB153635</td><td></td></tr><tr><td>抗体稀释缓冲液</td><td></td><td></td><td>成分见补充表S1</td></tr><tr><td>封闭缓冲液</td><td></td><td></td><td>成分见补充表S1</td></tr><tr><td>REMC培养基</td><td></td><td></td><td>成分见补充表S1</td></tr><tr><td>初级尿液培养基</td><td></td><td></td><td>成分见补充表S1</td></tr><tr><td>多能干细胞（PSC）培养基</td><td></td><td></td><td>成分见补充表S1</td></tr><tr><td>多能干细胞（PSC）生成培养基</td><td></td><td></td><td>成分见补充表S1</td></tr><tr><td>尿液洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>成分见补充表S1</td></tr></tbody></table>

尿源性灵长类诱导多能干细胞的建立与维持

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

研究灵长类多能干细胞及其分化产物的跨物种方法对于深入理解疾病、发育和进化的分子与细胞机制至关重要。为了提高灵长类诱导性多能干细胞（iPSCs）的可及性，本文介绍了一种非侵入性方法，可从尿液来源细胞中获得人和非人灵长类iPSCs，并采用无饲养层的培养体系对其进行维持。
尿液可从非无菌环境（例如动物笼具）中采集，并在原代细胞培养期间使用广谱抗生素混合物处理，以有效减少污染。在扩增尿源性细胞后，通过改良的转导方法利用 commercially available Sendai virus vector system（市售仙台病毒载体系统）生成诱导多能干细胞（iPSCs）。首先&#160;iPSC 克隆在 5 天后可能已可见，最早可在 10 天后进行挑取。使用无酶解离缓冲液进行常规团块传代，可维持所获得 iPSC 超过 50 代的多能性。

从人和非人灵长类动物（NHP）尿液中分离细胞时，可在分离后直接鉴定出不同类型的细胞。鳞状细胞以及多种较小的圆形细胞会随尿液排出；女性尿液中的鳞状细胞数量远多于男性尿液（图1B - 第0天；补充图S1）。在初级尿液培养基中培养5天后，可观察到首批贴壁增殖的细胞（图1A，B - 第5天）。此后每天更换一半培养基为REMC增殖培养基，直至出现首个细胞克隆。大约在第13天，贴壁细胞生长形成较大的克隆，可进行传代（图1B - 第13天）。这些克隆可由两种形态学上不同的细胞类型构成：一种呈更接近上皮样的表型，细胞紧密贴附生长；另一种则呈现更接近间充质样的形态，细胞呈细长形且迁移能力较强（图1C）。首次传代后，尿源性细胞以单层形式生长，当培养皿中细胞融合度达到80%时即可再次传代（图1B ...

本方案描述了一种从人和非人灵长类动物尿液来源细胞中分离、扩增并重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法，以及新生成的iPSCs在无饲养层条件下的维持培养操作指南。

跨物种方法研究灵长类多能干细胞及其衍生物对于深入理解分子与细胞层面的……至关重要

灵长类诱导多能干细胞（IPSCs）具有重要研究价值，但由于伦理和技术问题，通常难以获取。本方案提供了生成和维持灵长类IPSCs的最便捷途径。使用尿源细胞作为IPSCs的主要来源具有显著优势，因为这些细胞可通过完全无创的方式获得，且无需任何特殊技术。演示该实验步骤的是来自 Wolfgang M.S. 实验室的博士研究生 Jessica Radmer。首先，将含有尿液的试管在 400G 条件下离心 10 分钟。然后小心吸除上清液，保留约 1 毫升于试管中，并用其重悬沉淀物。加入10毫升含有两性霉素的尿液洗涤缓冲液洗涤细胞，并使用血清学移液管轻轻混匀悬浮液。离心后，小心吸除上清液，保留约少于0.2毫升液体于离心管中。将细胞沉淀重悬于1毫升含有两性霉素的初级尿液培养基中，每50毫升初始处理的尿液使用1毫升该培养基。去除明胶，取一毫升悬浮液加入经明胶包被的12孔板中。将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。为制备基底膜基质包被的12孔板，每孔加入500微升基底膜基质。移动培养板以混匀液体，并在37摄氏度下孵育1小时。孵育结束后，将基底膜基质替换为900微升REMC培养基，于37摄氏度保存备用。使用公式计算感染复数为5所需的仙台病毒体积。将仙台病毒重编程试剂盒的各组分在37摄氏度的水浴中快速解冻。在加入计算好体积的仙台病毒并混匀前，向离心管中加入REMC培养基，总体积为100微升。按照文稿中所述方法解离尿液来源细胞后，使用细胞计数仪计数细胞，并将所需数量的细胞转移至1.5毫升离心管中。通过离心获得沉淀，并将其重悬于100 µL预先配制的仙台病毒混合液中。将离心管在37°C孵育1小时，以进行悬浮感染。孵育结束后，在接种细胞悬液至基底膜基质包被的12孔板之前，加入REMC，使总体积达到1 mL。转导后，每隔两天更换一次培养基，直至诱导性多能干细胞（IPSC）集落形成，并在第5天更换为PSC生成培养基。当IPSC集落生长至适合团块传代的大小时，吸除培养细胞的培养基，并用500微升DPBS小心洗涤细胞。移除DPBS后，向孔中加入500微升0.5毫摩尔EDTA，孵育2至5分钟。在显微镜下仔细观察细胞，直至集落开始脱落。当集落边缘开始翘起且细胞之间的间隙变得可见时，移除EDTA，并小心加入500 µL的DPBS。用移液枪吸除DPBS，然后使用P-1000移液器用500 µL的PSC培养基冲洗孔板中的细胞。用移液器上下吹打，将菌落分散成适当大小的团块。根据细胞融合度、接种细胞所需密度以及诱导多能干细胞克隆的偏好性，将细胞团悬液的1/10至1/50转移至新孔中。轻轻前后晃动培养板数次，使团块在孔内均匀分布。将培养板在37摄氏度下孵育至少30分钟，使细胞团块贴壁。每两到三天更换一次培养基，直至克隆生长至足够传代的大小。分离后，可见随尿液排出的鳞状细胞及多种较小的圆形细胞。可观察到首批贴壁增殖的细胞，这些细胞会生长形成较大的克隆集落，并可进行传代。可观察到两种不同的细胞类型：一种具有上皮样表型，另一种则呈现更明显的间充质样表型，形态呈细长状。首次传代后，尿源性细胞以单层形式生长。在诱导多能干细胞（IPSC）的生成过程中，可观察到一些贴壁细胞，这些细胞开始出现形态学变化，表明细胞正在发生重编程。此外，形成克隆的细胞呈现出典型的胚胎干细胞形态。所有生成的IPSC均具有典型的类似胚胎干细胞的克隆形态，其特征为细胞排列紧密，边界清晰。采用免疫细胞化学方法检测了猩猩诱导性多能干细胞中多能性相关标志物的表达。此外，流式细胞术分析显示，所分析的猩猩诱导性多能干细胞对TRA-1-60呈阳性。进一步地，猩猩诱导性多能干细胞能够分化为内胚层、中胚层和外胚层谱系。分化细胞数量增加，以及克隆边缘完整性与均一性的丧失，提示诱导性多能干细胞（IPSC）质量较差。相反，边界清晰、细胞排列紧密以及核仁明显，是高质量IPSC的特征。由于存在冠状面变异，需要针对克隆特性优化相关培养条件，例如传代比例、传代时机以及细胞团块大小，以维持灵长类IPSC的健康生长。作为已建立的诱导多能干细胞（IPSCs）的质量控制，除了检测标志基因表达外，还可以通过体外拟胚体（EV）分化等直接或间接分化诱导方法来验证其多能性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

灵长类动物诱导的多能干细胞来源于尿液的产生和维持

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

为了揭示前列腺癌发生早期的分子机制，迫切需要新颖且创新的人类模型系统和研究方法。前前列腺尿生殖窦间充质（UGSM）具有诱导多能干细胞群体形成人类前列腺上皮的潜力，是前列腺研究中一种强大的实验工具。...

利用啮齿类动物泌尿生殖窦间质与人类干细胞的组织重组形成人类前列腺上皮

本方案包含从肌营养不良症患者尿液中分离尿源细胞的详细步骤，以及通过仙台病毒转导实现这些细胞高效快速重编程的方法。...

由肌营养不良症患者尿源性细胞高效无整合重编程生成诱导性多能干细胞

本研究中，我们利用非病毒型转座子系统，从小鼠羊水细胞生成诱导性多能干细胞。...

利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

我们提出了一种将外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。通过将转导后的血细胞接种至经基质包被的培养板中，并进行离心，可成功从悬浮细胞中诱导生成iPSCs。该技术为PBMCs和CBMCs等细胞提供了一种简单且高效的重编程方法。...

使用仙台病毒和离心法从血细胞生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本方案描述了在完全化学成分明确的条件下，利用非整合型附加体质粒方法将原代羊水及羊膜间充质干细胞重编程为诱导性多能干细胞的过程。详细介绍了细胞的提取、培养、重编程以及通过严格方法对所获得的诱导性多能干细胞进行表征的实验步骤。...

在无异种成分条件下将原代羊水及羊膜细胞重编程为多能性状态

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

本文描述了一种两步法方案，用于从皮肤成纤维细胞生成患者特异性的足细胞 通过...

从皮肤活检样本中生成患者来源的足细胞

了解利用尿液细胞通过仙台病毒重编程技术生成和维持灵长类动物诱导多能干细胞的方法。该非侵入性方案为干细胞生物学和再生医学研究提供了重要的技术支持。

尿源性灵长类诱导多能干细胞的建立与维持

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