使用短生物素化RNA对RNA结合蛋白进行优化的定量下拉分析

该协议通过使用生物素化的RNA寡核苷酸从细胞提取物中拉下已知RNA序列的蛋白质结合伴侣，从而能够鉴定已知RNA序列的蛋白质结合伴侣。与需要去垢剂或高温将蛋白质从RNA中分离的方法相比，这些方案使用非常温和的条件，也可以保留潜在的蛋白质复合物。演示该程序的将是雅各布·鲁珀特（Jakob Rupert），他是我规定的博士生。

通过从HEK 293T细胞板的孔中取出培养基开始全蛋白质收获，并用一毫升PBS洗涤六个孔板的孔。丢弃PBS并将板转移到冰上，然后向每个孔中加入200微升裂解缓冲液。使用细胞刮刀分离并破碎细胞，然后将来自两个孔的细胞提取物转移到同一个 1.5 毫升管中。

在冰上孵育并离心30分钟后，将上清液转移到预冷管中。接下来，计算对应于1.5毫克蛋白质的蛋白质提取物的体积。然后使用裂解缓冲液将所有样品的最终体积降至600微升。

将样品放在冰上直至使用。要制备珠子，请通过轻弹管将它们混合在存储缓冲液中。计算每个样品的100微升浆料介质后，将计算出的浆料体积放入磁性架中。

要清洗珠子，请取出储存溶液，然后加入一毫升裂解缓冲液并手动倒置来洗涤珠子。然后使用磁性架取出缓冲液并重复洗涤步骤。向珠子中加入相当于浆液培养基初始体积的裂解缓冲液体积，并通过轻弹试管进行混合，然后将培养基均匀分配到尽可能多的 1.5 毫升管中作为样品。

对于磁珠阻塞，使用磁性架除去缓冲液，并加入600微升每毫升0.25毫克在裂解缓冲液中制备的酵母TRNA溶液。在室温下在旋转轮上孵育一小时。在加入600微升裂解缓冲液之前，使用磁性架取出TRNA溶液，并通过手动混合进行洗涤。

重复洗涤步骤并丢弃缓冲液。对于每个含有初始100微升浆液培养基的试管，在600微升裂解缓冲液中制备200微克RNA寡核苷酸。将寡核苷酸加入珠子中，并在室温下旋转孵育一小时。

从珠子中取出溶液，并在室温下旋转试管5分钟，用600微升裂解缓冲液洗涤两次。丢弃缓冲区。对于珠子上的蛋白质结合，从600微升蛋白质溶液中分离出5%或30微升体积，并将其作为输入或IN以供进一步分析。

将剩余的蛋白质混合物添加到每管装载的珠子中，并在 4 摄氏度下缓慢旋转孵育过夜。使用磁性架从珠子中去除未结合的蛋白质级分。节省其体积的 5% 或 30 微升，并标记其流过或 FT。向珠子中加入一毫升洗涤缓冲液 1，并在 4 摄氏度下旋转五分钟。

丢弃缓冲液并重复洗涤一次。向珠子中加入一毫升洗涤缓冲液2。在旋转器上以四摄氏度孵育五分钟后，丢弃上清液。

为了洗脱特定的粘合剂，向磁珠中加入100微升洗脱缓冲液1。通过轻弹手动混合后，在室温下孵育五分钟。将试管放入热混合器中，在 95 摄氏度下剧烈摇晃五分钟。

然后将试管放入磁性架中，并将洗脱的馏分收集到干净的管中。完成后，用台式离心机快速旋转珠子，以最大限度地提高洗脱液的回收率。并节省总洗脱液或EL体积的5%或5微升，用于进一步分析。

通过质谱法鉴定洗脱的蛋白质。绘制火山图中显著富集的蛋白质表明，总蛋白质含量和从RNA洗脱的富集蛋白明显高于RNA，表明RNA可以建立更多的特异性相互作用。作为预测结果和获得结果之间一致性的示例，正RNA和减RNA与来自人类蛋白质组的蛋白质的相互作用得分表明，预测HNRNPH3选择性地结合加RNA，而PCBP2与RNA特异性相互作用。

此外，预测蛋白RBM41对两种RNA寡核苷酸都是混杂的。蛋白质下拉测定样品的质谱分析证实RNA中存在HNRNPH3，负RNA中存在PCBP2。而RBM41被发现与两者相互作用。

蛋白质印迹用于检测结果和方案优化步骤中TDP-43的存在。在RNA中，在输入样品和洗脱液中观察到TDP-43，表明其从一开始就存在。TDP-43在洗涤步骤中被RNA保留，并在结束时用高盐缓冲液洗脱。

通过绘制蛋白质RNA相互作用，该方法可以揭示许多生理途径背后的大分子网络。例如，转录调节或病理机制包括癌症和神经变性。