评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病变的实验方案

本方案首次描述了如何利用透射电子显微镜和共聚焦显微镜对视网膜色素变性（RP）病理中的小鼠样本进行处理和评估。该方案的主要优势在于结合了三种成像技术，对RP病理进行定量分析，从而实现统计学比较。本方案所述技术还有助于进一步拓展我们对维持视网膜色素上皮（RPE）健康的重要分子通路的认识。

对于此前未进行过小鼠解剖的人员，本方案可能存在操作困难。我们建议这些人员先通过若干小鼠进行练习，以掌握本方案中描述的技术。首先，在通风橱内的吸水垫上准备一套重力灌流系统，用于心脏灌流。

将40毫升新配制的固定缓冲液倒入灌注系统的注射器筒中。将阀门转至与管路平行的位置，使缓冲液流经管路。冲洗管路，直至其中所有气泡完全排出。

然后将阀门旋转至与管路垂直，以阻止缓冲液流入管路。进行心脏灌注时，将已处死的小鼠转移至灌注系统附近的浅盘中，腹部朝上。

用70%乙醇喷洒小鼠腹部，然后使用弯头剪刀和镊子在肋骨下方左侧腹壁皮肤上做一个5厘米长的向下切口。接着，在向下切口的顶端横向做一条3厘米长的中线切口，穿过皮肤和腹壁。最后，在中线切口末端，于肋骨下方最右侧腹壁皮肤上再做一个5厘米长的向下切口。

用弯头镊子再做一个三厘米长的正中切口，以去除腹部皮瓣。接着剪开膈肌和胸骨，暴露心脏。将套管针插入心脏的左心室并打开阀门。

用弯剪剪开右心房，以便血液和固定液流出心脏。让10毫升固定缓冲液灌注小鼠1至2分钟，或直至肝脏颜色变浅且无血液从右心房流出。灌注完成后，将阀门转至与管路垂直方向，以停止缓冲液流动。

为进行眼部成核，将小鼠从浅托盘中取出，置于通风橱内的吸水垫上。然后调整小鼠头部方向，使左眼朝向实验操作者，右眼背向不可见。用组织标记染料在眼睛的上方侧做标记。

用拇指和食指轻轻按压眼眶周围，使眼球从眼眶中突出。然后使用弯头剪刀，将刀片以与眼眶呈30度角的方式夹住眼球，沿眼球周围剪下。用弯头镊子将眼球从头部取下，置于吸水垫上。

用11号手术刀片在角膜上做切口，然后用弯镊将眼球放入含有2毫升固定缓冲液的2毫升微量离心管中。双眼完成去核后，在4°C、75 rpm的摇床中用固定缓冲液避光孵育过夜。次日，弃去固定缓冲液，加入2毫升磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下以75 rpm振荡孵育10分钟。

接下来，为了获取后部节段，将眼球置于盛有PBS的培养皿中，在解剖显微镜下操作。用尖头镊子轻轻将眼球周围的脂肪和肌肉组织剥离。使用显微解剖剪沿眼球平行方向小心修剪脂肪和肌肉组织，直至眼球呈现均匀的蓝黑色。将尖头镊子置于角膜穿刺处，用显微解剖剪从穿刺点开始沿角膜边缘剪切，以去除角膜和虹膜。

然后使用尖头镊子轻轻将晶状体从眼球中取出，得到视网膜后段。将后段放入含有两毫升 PBS 的离心管中，并在 4°C 冰箱中保存备用。将眼球转移至含有 PBS 的培养皿中，并按演示方法去除角膜和虹膜。

用尖头镊子取出晶状体。然后使用两把尖头镊子，轻轻将神经视网膜从眼球后段分离。在视神经乳头处小心剪断神经视网膜，以便从眼球后杯中移除。

将眼杯放入含有5微升PBS的2毫升微量离心管中。为固定后部眼杯，向组织中加入500微升甲醇，并在75 rpm的摇床上孵育5分钟。重复甲醇固定三次，最后一次孵育2小时。

固定后，用 PBS 清洗组织三次，然后进行免疫荧光染色，并通过共聚焦显微镜观察。4月龄的 TMEM135 转基因小鼠在距视神经 600 和 900 微米处的视网膜色素上皮（RPE）厚度较同龄野生型小鼠显著减少。统计了325日龄野生型（WT）和 TMEM135 转基因小鼠（TG）RPE 病理事件的发生情况，包括微空泡化、大空泡化以及细胞迁移。

与TMEM135转基因小鼠相比，野生型小鼠RPE微空泡化的平均频率较低。与TMEM135转基因小鼠观察到的平均值相比，野生型小鼠未检测到RPE大空泡化和细胞迁移现象。在透射电子显微镜下，24月龄视网膜中可见基底膜样沉积物，而2月龄视网膜中则未见此类沉积物。

基底板层沉积物高度的累积频率分析显示，与两个月大的小鼠相比，24个月大小鼠的曲线向右偏移，表明24个月大小鼠的沉积物增加。这一观察结果得到了24个月大视网膜中平均沉积高度更大的支持。四个月大的TMEM135转基因小鼠的视网膜色素上皮（RPE）出现形态异常。

TMEM135 转基因小鼠视网膜中的 RPE 细胞比同龄野生型小鼠视网膜中的更大且密度更低。此外，与对照组相比，在转基因小鼠视网膜中观察到更多的多核 RPE 细胞。通过遵循本实验方案，研究人员可利用分子生物学技术在小鼠中评估特定信号通路，从而有助于阐明这些视网膜色素变性（RP）病理在小鼠中发生发展的机制。

该方案将有助于标准化小鼠中视网膜色素变性（RP）的表型分析，从而将小鼠研究的结果推广至其他年龄相关性黄斑变性（AMD）模型，并促进我们对AMD发病机制的理解。