评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病理的协议
March 10th, 2023
小鼠模型可以成为研究视网膜色素上皮（RPE）生物学的有用工具。已经确定小鼠可以发展出一系列RPE病理。在这里，我们描述了一种表型方案，以使用光，透射电子和共聚焦显微镜阐明和量化小鼠的RPE病理。
该协议是第一个描述如何使用透光电子和共聚焦显微镜处理和评估RP病理学的小鼠大小的协议。该协议的主要优点是包括对RP病理的定量评估，使用这三种成像技术进行统计比较。本协议中描述的技术也可能有助于扩展我们对RPE健康重要的分子途径的了解。
以前没有解剖过小鼠大小的个体可能会与该协议作斗争。我们建议这些人与一些小鼠一起练习，以掌握本协议中描述的技术。首先，在吸收性垫上准备重力进料灌注系统，以便在通风橱中进行心脏灌注。
将40毫升新鲜制备的固定缓冲液倒入灌注系统的注射器筒中。将阀门平行于管路转动，使缓冲液流过管路。冲洗管路，直到从管路中去除所有气泡。
然后将阀门垂直于管路转动，以阻止缓冲器流入管路。要进行心脏灌注，请将安乐死的小鼠转移到灌注系统附近的浅托盘中。腹部朝上。
用70%乙醇喷洒腹部，然后使用弯曲的剪刀和镊子穿过肋骨下方小鼠左侧的皮肤和腹壁，形成一个5厘米的下切口。继续在下切口顶部的皮肤和腹壁上做一个三厘米的内侧切口。在内侧切口末端再做一个五厘米的下切口，穿过肋骨下方小鼠最远右侧的皮肤和腹壁。
再做一个三厘米的内侧切口，用弯曲的镊子去除腹部皮瓣。接下来，切开横膈膜和胸骨，露出心脏。将仪表针插入心脏的左心室并转动瓣膜。
用弯曲的剪刀剪开右心房，让血液和固定剂排出心脏。允许10毫升固定缓冲液灌注小鼠一到两分钟，或直到肝脏变得苍白并且没有血液流出右心房。灌注完成后，垂直于管路转动阀门以停止缓冲流。
要使眼睛成核，请将鼠标从浅托盘中取出，然后将其放在通风橱中的吸收垫上。然后将鼠标头部定向，左眼朝向实验者，右眼远离视线。用组织标记染料注释眼睛的上侧。
用拇指和食指轻轻向下推眼窝周围，使眼睛从眼窝突出。然后使用弯曲的剪刀，用刀片将眼睛与眼窝成30度角，并在眼睛周围剪裁。用弯曲的镊子从头部取出眼球，并将其放在吸收性垫上。
用 11 号手术刀刀片切开角膜，并用弯曲的镊子将眼睛放入含有 2 毫升固定缓冲液的 2 毫升微管中。双眼成核后，在四度房间的摇床上以75rpm的速度将它们在固定缓冲液中孵育过夜。第二天，用两毫升PBS替换固定缓冲液，并在室温和75rpm的摇床上孵育10分钟。
接下来要生成后节，将眼睛放入充满PBS的培养皿中，并在解剖显微镜下。用细尖镊子轻轻地将任何脂肪和肌肉从眼球上移开。用与眼球平行的微型解剖剪刀小心地修剪脂肪和肌肉，直到眼球具有均匀的蓝黑色 将细尖镊子放在角膜穿刺部位，然后用微型解剖剪刀从穿刺部位开始在角膜周边切割，以去除眼球上的角膜和虹膜。
然后使用细尖镊子，轻轻地将晶状体从眼球上取下，以产生后段。将后段放入含有两毫升PBS的管中，并在4摄氏度下储存在冰箱中直至使用。如图所示将眼睛转移到含有PBS的培养皿上，并如图所示去除角膜和虹膜。
用细尖镊子拉出镜片。然后使用两个细尖的镊子，轻轻地将神经视网膜与后段分开。小心地切割视神经头处的神经视网膜，以便从后眼杯中取出。
将眼罩放入含有五微升PBS的两毫升微管中。要固定后眼杯，向组织中加入 500 微升甲醇，并在摇床上以 75 rpm 孵育五分钟。重复甲醇固定三次，最终孵育两小时。
固定后，用PBS洗涤组织三次，然后进行免疫荧光染色并通过共聚焦显微镜进行可视化。四个月大的TMEM 135 TG小鼠，相对于年龄匹配的野生型小鼠，在距离视神经600和900微米处显示视网膜色素上皮或RPE厚度显着减少。计算325日龄WT和TMEM 135 TG小鼠的RPE病理事件，包括微血管化，大空泡化和迁移。
与TMEM 135 TG小鼠相比，野生型RPE微空泡化的平均频率较低。与TMEM 135 TG小鼠观察到的平均值相比，野生型未检测到RPE大空泡化和迁移。在透射电子显微镜中，在24个月大的视网膜中观察到基底层沉积物，而在两个月大的视网膜中不存在。
对基底层流沉积物高度的累积频率的分析表明，与两个月大的小鼠相比，24个月大的小鼠向线右侧移动，表明24个月大的小鼠的沉积物增加。这一观察结果得到了24个月大的视网膜中较大的平均高度的支持。四个月大的TMEM 135 TG小鼠的RPE畸形。
TMEM 135 TG视网膜的RPE比年龄匹配的野生型视网膜更大，密度更低。此外，与对照组相比，在TG视网膜中观察到更多的多核RPE细胞。遵循该协议，研究人员可以使用分子生物学技术在小鼠中评估特定途径，这可能有助于我们了解这些RP病理如何在小鼠中发展。
该协议将有助于标准化小鼠的RP表型，这将把小鼠研究的结果转化为其他AMD模型，并有助于我们理解AMD病理生物学。
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概述
本协议描述了一种用于处理和评估小鼠模型以研究视网膜色素上皮（RPE）病理的方法。利用光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜，该方法允许对RPE健康进行定量评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 视网膜生物学
- 病理学
背景
- 小鼠模型对于研究RPE生物学非常有价值。
- 小鼠可以发展出各种RPE病理。
- 理解这些病理对于推进视网膜健康研究至关重要。
- 本协议旨在增强RPE条件的评估。
研究目的
- 描述小鼠RPE病理的表型分析协议。
- 使用先进的成像技术提供定量评估。
- 促进RPE健康的统计比较。
使用的方法
- 光学显微镜用于初步评估。
- 透射电子显微镜用于详细的结构分析。
- 共聚焦显微镜用于高分辨率成像。
- 心脏灌流制备用于组织处理。
主要结果
- 成功实施了全面的表型分析协议。
- 通过成像技术获得RPE病理的定量数据。
- 增强了对RPE健康相关分子通路的理解。
- 协议帮助研究人员掌握解剖技术。
结论
- 本协议为研究RPE病理提供了一个强有力的框架。
- 定量成像技术对于准确评估至关重要。
- 进一步的研究可以在这些发现的基础上改善视网膜健康。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized, quantitative phenotyping of retinal pigmented epithelium (RPE) pathologies in mouse models is critical for de-risking early discovery in age-related macular degeneration (AMD) research. This protocol enables reproducible, unbiased assessment of RPE dysfunction, supporting predictive confidence in target validation and translational continuity across preclinical AMD models. Enterprise R&D teams benefit from robust statistical outputs that inform portfolio triage and mechanistic prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of RPE dysfunction as a mechanistic driver in AMD models.
- Supports functional target validation by quantifying pathologies linked to disease progression.
- Facilitates predictive confidence in pathway selection and early portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated mouse RPE systems for downstream compound screening workflows.
- Standardizes quantitative imaging outputs for reproducibility and cross-study comparability.
- Enables reliable evaluation of candidate interventions targeting RPE health.
Translational & Preclinical Research
- Aligns murine RPE pathology readouts with human AMD features for translational relevance.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling unbiased statistical comparisons.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model validation in AMD research.
- Discovery Biology: Quantitative imaging and statistical testing clarify RPE dysfunction mechanisms and pathway involvement.
- Screening: Standardized phenotyping ensures assay readiness and reproducibility for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of RPE thickness, vacuolization, and deposit formation for condition comparison.
- Translational Research: Provides endpoints that align with human AMD pathology for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across AMD mouse models, supporting platform-wide standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in AMD target validation.
- Operational Value: Delivers reproducible, scalable, and unbiased quantitative assessments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of AMD therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and advanced microscopy techniques.
- Demands access to light, transmission electron, and confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification protocols.
- Adaptable to various mouse models of AMD with protocol-specific optimizations.
- Practical limitations include technical learning curve and need for statistical rigor in data analysis.
