Name: 评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病理的协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习利用光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜对小鼠视网膜色素上皮病理进行定量评估的方法。该方案为研究年龄相关性黄斑变性提供了标准化的表型分析框架。

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作者谨此感谢木下悟（Satoshi Kinoshita）以及威斯康星大学（UW）病理学转化研究实验室（TRIP）为本研究的组织样本制备了光学显微镜切片。该核心实验室由威斯康星大学病理学与实验室医学系、威斯康星大学卡本癌症中心（P30 CA014520）以及美国国立卫生研究院院长办公室（S10OD023526）提供支持。共聚焦显微镜实验在威斯康星大学生物化学光学核心实验室完成，该实验室的建立得到了威斯康星大学生物化学系基金的支持。本研究还获得了美国国立眼科研究所的资助（R01EY022086，授予A. Ikeda；R01EY031748，授予C. Bowes Rickman；P30EY016665，授予威斯康星大学眼科与视觉科学系；P30EY005722，授予杜克眼科中心；NIH T32EY027721，授予M. Landowski；F32EY032766，授予M. Landowski）、Timothy William Trout讲席基金（A. Ikeda）、FFB Free Family AMD奖（C. Bowes Rickman），以及防盲研究组织（Research to Prevent Blindness）向杜克眼科中心提供的非限定性资助。

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本方案的作者没有披露信息和利益冲突。

本文介绍了一种用于评估小鼠模型视网膜色素上皮（RPE）结构病理学的表型分析方案。我们详细描述了为进行多种成像技术（包括光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜）而处理眼球所需的步骤，以及对观察到的典型病理学特征进行定量分析的方法。 通过 这些成像方法。我们通过检测验证了RPE表型分析方案的有效性 Tmem135 TG 和 24 月龄的 WT 小鼠，因为这些小鼠表现出 RPE 病理变化30,31,32该方案可应用于任何经基因修饰或药物处理后可能具有视网膜色素上皮（RPE）病变的小鼠，这些病变包括RPE变薄、空泡化、迁移和形态异常，以及Bruch膜异常（BLamDs）6,7尽管在RPE中观察到的病理变化 Tmem135 TG 和 24 月龄的 WT 小鼠存在于其他 AMD 小鼠模型中<s...

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种常见的致盲性疾病，主要影响55岁以上人群1。许多研究人员认为，视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是AMD早期且关键的病理生物学事件2。RPE是由单层极性细胞构成的组织，负责维持邻近感光细胞和脉络膜血管的稳态3。目前已有多种模型用于研究RPE中的疾病相关机制，包括细胞培养模型4,5和小鼠模型6,7,8。最近有研究报告了RPE细胞培养模型的标准化操作流程和质量控制标准4，但尚无研究尝试对小鼠模型中RPE的表型分析进行标准化。事实上，许多关于AMD小鼠模型的出版物缺乏对RPE的完整描述或对RPE病理变化的定量分析。本实验方案的总体目标是为使用AMD小鼠模型的科研人员提供标准化的RPE表型分析方法，并进行无偏倚的定量评估。
既往研究通过三种成像技术观察到小鼠中存在多种视网膜色素上皮（RPE）病理改变。例如，光学显微镜可使研究人员观察小鼠视网膜的大体形态（图1A），并检测RPE变薄、空泡化及迁移等RPE病理变化。在年龄相关性黄斑变性（AMD）小鼠模型中，RPE变薄表现为RPE高度与其相应对照组相比出现偏离（图1B）。RPE空泡化可分为两类：微空泡化（图1C）和巨空泡化（图1D）。RPE微空泡化表现为RPE内出现空泡但不影响其整体高度；而巨空泡化则表现为空泡突入光感受器外节。RPE迁移在视网膜横切面中表现为色素在RPE单层上方局灶性聚集（图1E）。值得注意的是，来自AMD供体眼的迁移性RPE细胞对免疫细胞标志物（如分化簇68（CD68））呈免疫反应阳性9，这可能代表免疫细胞正在吞噬RPE碎片，或RPE细胞正在发生转分化9。另一种称为透射电子显微镜的成像技术可使研究人员观察RPE及其基底膜的超微结构（图2A）。该技术可用于识别小鼠中主要的RPE下沉积物，即基底层状沉积物（BLamD）（图2B）10。最后，共聚焦显微镜可通过成像RPE铺片来揭示RPE细胞的结构（图3A）。该方法可揭示RPE形态异常，即RPE偏离其经典的蜂窝状结构（图3B）；还可检测RPE多核现象，即一个RPE细胞内存在三个或更多细胞核（图3C）。关于当前AMD小鼠模型中存在的RPE病理类型综述，我们建议研究人员参考文献中的相关综述6,7。
研究年龄相关性黄斑变性（AMD）的研究人员在进行表型分析实验前，应了解使用小鼠研究视网膜色素上皮（RPE）病理变化的优缺点。小鼠的优势在于其相对较短的寿命、成本低廉，以及易于进行遗传学和药理学操作。此外，小鼠也会出现与AMD供体眼组织中观察到的相似的RPE退行性改变，包括RPE细胞迁移、形态异常和多核化现象11,12,13,14,15,16,17；这表明小鼠和人类RPE病理变化的发生机制可能存在相似之处。然而，也存在一些关键差异，限制了小鼠研究结果向人类AMD的转化应用。首先，小鼠缺乏黄斑——这是人类视网膜中一个解剖结构独特的区域，对视觉敏锐度至关重要，且在AMD中易受累。其次，某些在小鼠中出现的RPE病理改变，如RPE变薄和空泡化，在AMD供体眼中通常并不常见18。第三，小鼠不会形成AMD病理特征性的玻璃膜疣（drusen）19。玻璃膜疣是位于RPE基底膜与Bruch膜（BrM）内层胶原层之间的沉积物，含有脂质和蛋白质，但几乎不含基底膜蛋白19。玻璃膜疣在成分和解剖位置上均不同于小鼠常见的RPE下沉积物BLamD。BLamD是随年龄和应激累积而形成的富含细胞外基质的异常结构，位于BrM的RPE基底膜与RPE基底皱褶之间20。有趣的是，BLamD在小鼠和人类中的蛋白质组成及形态表现相似6,10,21。近期研究表明，BLamD可能通过影响AMD向晚期阶段的进展而在其发病机制中发挥作用18,22；因此，这类沉积物可能代表了小鼠视网膜中病变的RPE。了解这些优势与局限性，对于希望将小鼠研究结果转化为AMD相关发现的研究人员至关重要。
在本实验方案中，我们讨论了为明场显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜制备眼球样本的方法，以观察视网膜色素上皮（RPE）的病理变化。我们还描述了如何以无偏倚的方式对RPE病理变化进行量化，以便进行统计学分析。作为概念验证，我们应用该RPE表型分析方案，研究跨膜蛋白135（Tmem135）过表达小鼠以及老龄野生型（WT）C57BL/6J小鼠中观察到的RPE结构病理改变。总之，我们的目标是描述一种用于表征年龄相关性黄斑变性（AMD）小鼠模型中RPE特征的表型分析方法，因为目前尚无标准操作流程可供参考。需要指出的是，本方案主要针对RPE，对于希望研究光感受器或脉络膜病理变化（这些结构在AMD小鼠模型中亦受影响）的研究人员，本方案可能不适用于其研究目的。

<table><tbody><tr><td>0.1 M 卡可基酸盐缓冲液 pH7.2</td><td>PolyScientiifc R&amp;D Company</td><td>S1619</td><td></td></tr><tr><td>100 片容量载玻片盒</td><td></td><td></td><td>本方案需要两个（一个用于 H&amp;E 染色的载玻片，另一个用于 RPE 平铺标本）。</td></tr><tr><td>100% 乙醇&amp;nbsp;</td><td>MDS Warehouse</td><td>2292-CASE</td><td>可用于本方案中配制稀释的乙醇溶液。</td></tr><tr><td>一通止流阀，两端均为鲁尔锁母接头</td><td>Qosina</td><td>11069</td><td></td></tr><tr><td>1x 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td>本方案中可使用预配制的 1x PBS 溶液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2.0 mL 微量离心管</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>24-283-LR</td><td></td></tr><tr><td>24 孔包埋胶囊替代模具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70165</td><td></td></tr><tr><td>24 英寸带鲁尔接头的 PVC 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1376778</td><td></td></tr><tr><td>400 目方形网眼铜网（Gilder 细条）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>MDS Warehouse</td><td>2293-CASE</td><td></td></tr><tr><td>带防水防潮屏障的吸水垫（23 英寸 × 24 英寸）</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>可调节 237 ml&amp;nbsp; 喷雾瓶</td><td>VWR</td><td>23609-182</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 标记的驴抗兔 IgG&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 19 号注射器针头</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z192546</td><td></td></tr><tr><td>Bracken 镊子；弯型；细齿交叉纹；4&quot; 长，尖端宽度 1 mm</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5211</td><td>本方案中称为弯头镊子。</td></tr><tr><td>骆驼毛刷</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>65575-02</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳安乐死舱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳流量计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳气罐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castaloy 棘爪延伸夹具</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>05-769-7Q</td><td></td></tr><tr><td>铸铁 L 形底座支撑架</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-474-207</td><td></td></tr><tr><td>Cell Profiler 细胞分析程序</td><td></td><td></td><td>可下载地址：https://cellprofiler.org/releases</td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Colorfrost 紫色显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>10118-956</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td></td><td></td><td>本方案使用 Milli-Q 纯化系统制备的水。</td></tr><tr><td>Dumont 细尖镊子；型号 #55</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-4984</td><td>本方案中称为细尖镊子，共需 3 把（两把用于解剖，一把用于电镜处理）。</td></tr><tr><td>电子显微镜载网夹</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71147-01</td><td></td></tr><tr><td>EPON 815 树脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14910</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Mark-It 组织标记黄色染料</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>22050460</td><td>使用该组织标记染料时，请遵循制造商的操作说明。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Epredia 封片介质</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-610</td><td>用于 H&amp;E 载玻片的封片。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fiber-Lite Mi-150 系列卤素光源照明器，150 W 卤素光源</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Mi-150</td><td>解剖显微镜的光源。</td></tr><tr><td>Fiji ImageJ 图像分析程序</td><td></td><td></td><td>可下载地址：https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Flexaframe Castaloy 钩式连接器</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14-666-18Q</td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5% 戊二醛磷酸缓冲液，pH 7.4，32%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16537-05</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 透射电子显微镜（JEOL），配备 ORIUS (1000) CCD 相机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室台式摇床</td><td></td><td></td><td>本实验需要两台。一台置于室温，另一台置于 4 摄氏度冷室中。</td></tr><tr><td>激光冷冻标签</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77564-05</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铅</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC7 超薄切片机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Reichert Ultracut S 切片机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LifterSlips 载片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22X22I24788001LS</td><td>用于 RPE 平铺标本，因其边缘凸起，可容纳 RPE 的厚度。</td></tr><tr><td>Mayer 苏木精染液</td><td>VWR</td><td>100504-406</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 微型解剖弹簧剪</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5600</td><td>本方案中称为微型解剖剪。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td></td><td></td><td>任何年龄相关性黄斑变性（AMD）小鼠模型及其相应对照均可用于本方案。</td></tr><tr><td>微型解剖剪；标准型；弯型；尖端锋利；刀片长 24 mm；总长 4.5&quot;</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5913</td><td>本方案中称为弯头剪。</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1RS 共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>SouthernBiotech</td><td>0030-01</td><td></td></tr><tr><td>11 号无菌一次性手术刀片</td><td>VWR</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，32%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>铅笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多克隆抗 ZO-1 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>20412</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>VWR</td><td>10040-386</td><td></td></tr><tr><td>小鼠灌流用浅盘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon 醇溶伊红 Y 染液</td><td>VWR</td><td>89370-828</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie 超细尖黑色永久性记号笔</td><td>Staples</td><td>642736</td><td></td></tr><tr><td>染色用载玻片架</td><td>Grainger</td><td>49WF31</td><td></td></tr><tr><td>方形盖玻片</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>带盖染色皿</td><td>Grainger</td><td>49WF30</td><td>H&amp;E 染色步骤需要 15 个。</td></tr><tr><td>Target 全塑料一次性鲁尔滑动式 50 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>S7510-50</td><td>仅使用注射器筒体。</td></tr><tr><td>计时器</td><td>Fisher</td><td>1464917</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>真空烘箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片介质</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>用于 RPE 平铺标本的封片。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>22050283</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 光学显微镜</td><td></td><td></td><td>该显微镜具备生成 20x 拼接图像的功能。若光学显微镜不具备此功能，则需拍摄整个视网膜的图像，且相邻图像之间应有轻微重叠。使用 Adobe Photoshop 将这些图像拼接在一起。有关图像拼接，请参考 Adobe Photoshop 程序的使用手册。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000 解剖显微镜</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>65575-02</td><td></td></tr></tbody></table>

评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病变的实验方案

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种在老年人群中常见的致残性视网膜疾病。目前普遍认为，视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是 AMD 发生发展中的关键病理生物学事件。为了深入理解导致 RPE 功能障碍的机制，研究人员可利用小鼠模型进行研究。已有前期研究表明，小鼠可出现 RPE 病理改变，其中部分病变特征与被诊断为 AMD 患者眼部所见相似。本文介绍了一种用于评估小鼠 RPE 病理改变的表型分析方案。该方案包括通过光学显微镜和透射电子显微镜对视网膜横切面进行制备与评估，以及通过共聚焦显微镜对 RPE 铺片进行分析。我们详细描述了利用上述技术所观察到的小鼠 RPE 常见病理类型，并介绍了通过无偏倚方法进行定量分析以实现统计检验的具体方式。作为概念验证，我们应用该 RPE 表型分析方案，对过表达跨膜蛋白 135（Tmem135）的小鼠以及老龄野生型 C57BL/6J 小鼠中观察到的 RPE 病理改变进行了量化。本方案的主要目标是为使用 AMD 小鼠模型的科研人员提供标准化的 RPE 表型分析方法，并实现无偏倚的定量评估。

完成本文所述的视网膜色素上皮细胞表型分析方案，可对小鼠年龄相关性黄斑变性模型中常见的视网膜色素上皮细胞结构异常进行定量分析。为验证该方案的有效性，我们将其应用于已知存在视网膜色素上皮细胞病理改变的小鼠，包括过表达野生型的小鼠模型。 Tmem135 由鸡β-肌动蛋白启动子驱动Tmem135 甘油三酯30 以及老龄C57BL/6J小鼠31,32本实验旨在向小鼠模型领域的新进研究人员展示，采用本方案所述方法可获得的代表性结果。
我们严格遵循了以下方法： 步骤 1 用于处理与评估野生型（WT）及 Tmem135 利用光学显微镜评估转基因小鼠视网膜色素上皮病理变化。我们发现4月龄 Tmem135 与年龄匹配的WT小鼠相比，TG小鼠在两个测量时间点的RPE厚度均显著降低，该结果通过方差分析及事后Tukey检验得出（<stron...

小鼠模型可用于研究视网膜色素上皮（RPE）的生物学特性。已有研究表明，小鼠可产生多种RPE病理改变。本文介绍一种表型分析方案，通过光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜对小鼠RPE的病理变化进行阐明和定量分析。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种在老年人群中常见的致残性视网膜疾病。普遍认为，该病的发生与视网膜……

本方案首次描述了如何利用透射电子显微镜和共聚焦显微镜对视网膜色素变性（RP）病理中的小鼠样本进行处理和评估。该方案的主要优势在于结合了三种成像技术，对RP病理进行定量分析，从而实现统计学比较。本方案所述技术还有助于进一步拓展我们对维持视网膜色素上皮（RPE）健康的重要分子通路的认识。对于此前未进行过小鼠解剖的人员，本方案可能存在操作困难。我们建议这些人员先通过若干小鼠进行练习，以掌握本方案中描述的技术。首先，在通风橱内的吸水垫上准备一套重力灌流系统，用于心脏灌流。将40毫升新配制的固定缓冲液倒入灌注系统的注射器筒中。将阀门转至与管路平行的位置，使缓冲液流经管路。冲洗管路，直至其中所有气泡完全排出。然后将阀门旋转至与管路垂直，以阻止缓冲液流入管路。进行心脏灌注时，将已处死的小鼠转移至灌注系统附近的浅盘中，腹部朝上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部，然后使用弯头剪刀和镊子在肋骨下方左侧腹壁皮肤上做一个5厘米长的向下切口。接着，在向下切口的顶端横向做一条3厘米长的中线切口，穿过皮肤和腹壁。最后，在中线切口末端，于肋骨下方最右侧腹壁皮肤上再做一个5厘米长的向下切口。用弯头镊子再做一个三厘米长的正中切口，以去除腹部皮瓣。接着剪开膈肌和胸骨，暴露心脏。将套管针插入心脏的左心室并打开阀门。用弯剪剪开右心房，以便血液和固定液流出心脏。让10毫升固定缓冲液灌注小鼠1至2分钟，或直至肝脏颜色变浅且无血液从右心房流出。灌注完成后，将阀门转至与管路垂直方向，以停止缓冲液流动。为进行眼部成核，将小鼠从浅托盘中取出，置于通风橱内的吸水垫上。然后调整小鼠头部方向，使左眼朝向实验操作者，右眼背向不可见。用组织标记染料在眼睛的上方侧做标记。用拇指和食指轻轻按压眼眶周围，使眼球从眼眶中突出。然后使用弯头剪刀，将刀片以与眼眶呈30度角的方式夹住眼球，沿眼球周围剪下。用弯头镊子将眼球从头部取下，置于吸水垫上。用11号手术刀片在角膜上做切口，然后用弯镊将眼球放入含有2毫升固定缓冲液的2毫升微量离心管中。双眼完成去核后，在4°C、75 rpm的摇床中用固定缓冲液避光孵育过夜。次日，弃去固定缓冲液，加入2毫升磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下以75 rpm振荡孵育10分钟。接下来，为了获取后部节段，将眼球置于盛有PBS的培养皿中，在解剖显微镜下操作。用尖头镊子轻轻将眼球周围的脂肪和肌肉组织剥离。使用显微解剖剪沿眼球平行方向小心修剪脂肪和肌肉组织，直至眼球呈现均匀的蓝黑色。将尖头镊子置于角膜穿刺处，用显微解剖剪从穿刺点开始沿角膜边缘剪切，以去除角膜和虹膜。然后使用尖头镊子轻轻将晶状体从眼球中取出，得到视网膜后段。将后段放入含有两毫升 PBS 的离心管中，并在 4°C 冰箱中保存备用。将眼球转移至含有 PBS 的培养皿中，并按演示方法去除角膜和虹膜。用尖头镊子取出晶状体。然后使用两把尖头镊子，轻轻将神经视网膜从眼球后段分离。在视神经乳头处小心剪断神经视网膜，以便从眼球后杯中移除。将眼杯放入含有5微升PBS的2毫升微量离心管中。为固定后部眼杯，向组织中加入500微升甲醇，并在75 rpm的摇床上孵育5分钟。重复甲醇固定三次，最后一次孵育2小时。固定后，用 PBS 清洗组织三次，然后进行免疫荧光染色，并通过共聚焦显微镜观察。4月龄的 TMEM135 转基因小鼠在距视神经 600 和 900 微米处的视网膜色素上皮（RPE）厚度较同龄野生型小鼠显著减少。统计了325日龄野生型（WT）和 TMEM135 转基因小鼠（TG）RPE 病理事件的发生情况，包括微空泡化、大空泡化以及细胞迁移。与TMEM135转基因小鼠相比，野生型小鼠RPE微空泡化的平均频率较低。与TMEM135转基因小鼠观察到的平均值相比，野生型小鼠未检测到RPE大空泡化和细胞迁移现象。在透射电子显微镜下，24月龄视网膜中可见基底膜样沉积物，而2月龄视网膜中则未见此类沉积物。基底板层沉积物高度的累积频率分析显示，与两个月大的小鼠相比，24个月大小鼠的曲线向右偏移，表明24个月大小鼠的沉积物增加。这一观察结果得到了24个月大视网膜中平均沉积高度更大的支持。四个月大的TMEM135转基因小鼠的视网膜色素上皮（RPE）出现形态异常。TMEM135 转基因小鼠视网膜中的 RPE 细胞比同龄野生型小鼠视网膜中的更大且密度更低。此外，与对照组相比，在转基因小鼠视网膜中观察到更多的多核 RPE 细胞。通过遵循本实验方案，研究人员可利用分子生物学技术在小鼠中评估特定信号通路，从而有助于阐明这些视网膜色素变性（RP）病理在小鼠中发生发展的机制。该方案将有助于标准化小鼠中视网膜色素变性（RP）的表型分析，从而将小鼠研究的结果推广至其他年龄相关性黄斑变性（AMD）模型，并促进我们对AMD发病机制的理解。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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通过时间序列吲哚菁绿血管造影检测年龄相关性黄斑变性小鼠模型中脉络膜血管的异常

本文介绍了一种利用直流视网膜电图（DC-ERG）技术记录小鼠视网膜色素上皮（RPE）光诱发电反应的方法，该技术由 Marmorstein、Peachey...

直接耦合视网膜电图（DC-ERG）记录小鼠视网膜色素上皮光诱发的电反应

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3...

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融合绝对定量与相对定量PCR数据以定量STAT3剪接变异体转录本

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