优化 果蝇 幼虫神经肌肉接头透射电子显微镜样品制备工艺
September 15th, 2023
本报告提供了一种新的样品制备程序，用于可视化 果蝇 幼虫中的神经肌肉接头。与传统方法相比，该方法在防止样品卷曲方面更有效，对于 果蝇 神经肌肉接头超微结构分析特别有用。
透射电镜的漫射分布和有限的视觉范围给基础设施分析带来了挑战。该协议提供了一种创新且高效的样品制备方法，超越了传统方法。与传统方法相比，这种先进的TEM样品制备方法在防止样品卷曲方面更有效，因为它允许样品在随后的脱水过程中保持平坦。
根据样品类型，必须有必要选择试剂和调整剂量。样品制备过程中会使用许多有毒化学试剂。演示该程序的是来自甘光明博士实验室的硕士生盛清源。
首先，在Jan溶液中解剖游荡的三龄果蝇幼虫，并按照标准程序获得整个体壁。用固定剂在解剖室中以四摄氏度固定幼虫体壁过夜。第二天，将幼虫体壁从解剖室转移到1.5ml离心管中，并用二甲胂酸钠缓冲液冲洗数次。
将幼虫体壁用1%四氧化锇固定两小时。固定后，用蒸馏水洗涤样品数次。将 2% 饱和尿液醋酸溶液加入试管中，以染色 PHI 神经肌肉接头。
两小时后，用去离子水冲洗样品。接下来用剪刀剪下两片孔径为 270 微米的圆形金属网。将金属网放在平底瓶的底部。
然后将固定的幼虫放在网上，然后放置另一个网眼。在4摄氏度的温度下，将样品在增加的乙醇浓度下脱水20分钟。然后用环氧丙烷在室温下冲洗样品两次，每次五分钟。
接下来，将样品置于环氧丙烷和环氧树脂溶液中，然后在室温下将纯环氧树脂置于两小时。为了包埋，将聚乙烯薄膜切成一个大正方形和一个小的空心矩形支架。将小方块与大方块粘合在一起。
在大方块的中心加入足够的环氧树脂。然后打开立体镜，将样品放入预先放置的环氧树脂中，肌肉侧朝上。在样品上加入几滴环氧树脂，并用聚乙烯薄膜覆盖它们。
将用于聚合的样品在升高的温度下放置 24 小时。聚合后，使用锋利的刀片去除幼虫体的多余部分，同时保留梯形，包括 A2 和 A3 段。从剩余的幼虫体壁上取下梯形，并用AB胶将其连接到填充树脂的胶囊上。
在光学显微镜下，确认 A2 和 A3 节段的第六块和第七块肌肉的位置，保持切线平面平行于第六块肌肉。然后沿 A3 段的两侧切去五分之一的样品。使用切片机，从第六块肌肉开始制备样品的超薄切片。
切片后，将尽可能多的切片连接到每个铜网上。使用透射电子显微镜观察样品。在Lowicryl K4M树脂和环氧树脂中，Lowicryl K4M树脂提供了更清晰，更容易观察到果蝇身体肌肉的结果。
共聚焦成像增强了第六块和第七块肌肉之间的神经肌肉接头的可视化。透射电子显微镜显示珠状神经肌肉接头，提供改进的突触结构信息。由于金属网的限制，样品在整个脱水过程中保持平坦。
此外，样品在塑料产品之间聚合，防止样品折叠。未来，TEM样品制备方法可以应用于脑和腹侧神经索神经桩，从而提高超微结构研究的潜力。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本报告介绍了一种新颖的样品制备程序，用于在果蝇幼虫中可视化神经肌肉连接，增强超结构分析。与传统技术相比，该方法有效防止了样品卷曲，展示了其对神经肌肉连接结构进行详细观察的实用性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物成像
- 超结构分析
背景
- 由于样品卷曲，神经肌肉连接的可视化存在挑战。
- 透射电子显微镜（TEM）常被使用，但可能限制视觉范围。
- 需要创新方法来改善样品稳定性和分析质量。
研究目的
- 开发一种能够保持样品完整性的样品制备方法。
- 增强果蝇神经肌肉连接的可视化。
- 提供适用于其他类型神经组织的超结构分析协议。
使用的方法
- 利用透射电子显微镜进行成像。
- 以果蝇幼虫的神经肌肉连接作为生物模型进行研究。
- 包括固定、染色、脱水和包埋等具体步骤。
- 使用金属网格在脱水过程中防止样品卷曲。
主要结果
- 新方法使样品在制备和聚合过程中保持平坦。
- 利用共聚焦成像增强神经肌肉连接的可视化。
- 结果表明，与传统方法相比，突触结构的可见度有所改善。
结论
- 本研究在神经肌肉连接分析的样品制备方面呈现了重大进展。
- 该方法使得更好地观察神经结构成为可能，具有在其他神经生物学研究领域应用的潜力。
- 研究结果有助于理解突触结构和果蝇模型中的功能分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust ultrastructural analysis of neuromuscular junctions in Drosophila larvae is critical for early-stage neuroscience target validation and mechanistic de-risking. This optimized TEM sample preparation method enhances morphological fidelity and quantitative imaging, supporting predictive confidence in synaptic biology workflows. Improved sample integrity directly impacts the reliability of downstream discovery and translational research decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution interrogation of synaptic architecture for mechanistic pathway clarification.
- Reduces sample distortion, supporting functional target validation in neuromuscular models.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage in neurobiology programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, flat biological samples for reproducible imaging workflows.
- Supports quantitative assessment of synapse abundance and morphology for assay standardization.
- Enables reliable comparison of compound effects on neuromuscular junction structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ultrastructural findings with disease-relevant synaptic biomarkers in preclinical models.
- Provides continuity from discovery imaging to translational validation of neural targets.
- De-risks advancement decisions by ensuring morphological endpoints are robust and reproducible.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation protocol integrates at the interface of discovery biology and preclinical imaging, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Maintains sample flatness for accurate ultrastructural hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables precise measurement of synaptic features, supporting statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical biomarker validation in neuromuscular systems.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, scalable protocol adaptable to other neural tissues and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic biology.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neurobiological assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by ensuring robust morphological endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in TEM sample handling and neuromuscular dissection.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of reagent selection and dosage adjustments.
- Adaptable to other neural tissues with consideration of tissue-specific preparation needs.
- Involves handling of toxic reagents, requiring strict adherence to safety protocols.
