优化神经肌肉接头透射电子显微镜样品制备流程 果蝇 幼虫

透射电镜（TEM）成像中分布弥散且可视范围有限，为基础设施分析带来了挑战。本方案介绍了一种创新且高效的样品制备方法，优于传统方法。这种先进的TEM样品制备技术在后续脱水过程中能够更好地保持样品平整，相较于传统方法，更有效地防止了样品卷曲。

试剂的选择及剂量的调整必须根据样本类型而定。样本制备过程中使用了多种有毒化学试剂。本次实验操作由甘光明博士实验室的硕士研究生 Sheng Qingyuan 进行演示。

首先，在Jan溶液中解剖游走期三龄黑腹果蝇幼虫，并按照标准操作获取完整的体壁。将幼虫体壁置于解剖皿中，用固定液在4摄氏度下固定过夜。次日，将幼虫体壁从解剖皿转移至1.5毫升离心管中，并用二甲胂酸钠缓冲液多次漂洗。

用1%四氧化锇固定幼虫体壁两小时。固定后，用蒸馏水多次洗涤样品。向离心管中加入2%饱和醋酸铀溶液，以染色PHI神经肌肉接头。

两小时后，用去离子水冲洗样品。接下来，使用剪刀剪下两片孔径为270微米的圆形金属网。将金属网置于平底瓶的底部。

然后将固定的幼虫置于筛网上，再盖上另一层筛网。在4°C条件下，依次用浓度递增的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理20分钟。随后在室温下用丙烯酸甲酯对样品漂洗两次，每次5分钟。

接下来，将样品置于丙烯酸氧化物与环氧树脂的混合溶液中，随后置于纯环氧树脂中，在室温下处理两小时。进行包埋时，将聚乙烯薄膜裁成一个大正方形和一个小的中空矩形支撑物，将小正方形与大正方形粘合在一起。

在大方块中央加入足量环氧树脂。然后打开体视显微镜，将样品放置于预先定位的环氧树脂中，肌肉面朝上。在样品上滴加数滴环氧树脂，并用聚乙烯膜覆盖。

将样品依次置于温度递增的条件下各聚合24小时。聚合完成后，使用锋利刀片去除幼虫体上多余的组织，保留包含A2和A3体节的梯形部分。将该梯形部分从残余的幼虫体壁上取下，并用AB胶将其固定于充满树脂的包埋胶囊中。

在光学显微镜下确认 A2 和 A3 节段第六和第七块肌肉的位置，保持切面平面与第六块肌肉平行。然后沿 A3 节段两侧切去样品的五分之一。使用超薄切片机，从第六块肌肉开始对样品进行超薄切片制备。

切片后，将尽可能多的切片贴附至每一张铜网上。使用透射电子显微镜观察样品。在Lowicryl K4M树脂与环氧树脂之间，Lowicryl K4M树脂可提供更清晰且更易于观察的果蝇体肌结果。

共聚焦成像展示了第六与第七肌肉之间神经肌肉接头的增强可视化效果。透射电子显微镜揭示了珠状的神经肌肉接头，提供了更清晰的突触结构信息。由于金属网格的限制，样品在整个脱水过程中保持平坦。

此外，样品在塑料制品之间进行聚合，防止了样品折叠。未来，该透射电镜样品制备方法可应用于脑和腹神经索神经 Neuropil 的研究，从而提升超微结构研究的潜力。