优化 果蝇 幼虫神经肌肉接头透射电子显微镜样品制备工艺

透射电镜的漫射分布和有限的视觉范围给基础设施分析带来了挑战。该协议提供了一种创新且高效的样品制备方法，超越了传统方法。与传统方法相比，这种先进的TEM样品制备方法在防止样品卷曲方面更有效，因为它允许样品在随后的脱水过程中保持平坦。

根据样品类型，必须有必要选择试剂和调整剂量。样品制备过程中会使用许多有毒化学试剂。演示该程序的是来自甘光明博士实验室的硕士生盛清源。

首先，在Jan溶液中解剖游荡的三龄果蝇幼虫，并按照标准程序获得整个体壁。用固定剂在解剖室中以四摄氏度固定幼虫体壁过夜。第二天，将幼虫体壁从解剖室转移到1.5ml离心管中，并用二甲胂酸钠缓冲液冲洗数次。

将幼虫体壁用1%四氧化锇固定两小时。固定后，用蒸馏水洗涤样品数次。将 2% 饱和尿液醋酸溶液加入试管中，以染色 PHI 神经肌肉接头。

两小时后，用去离子水冲洗样品。接下来用剪刀剪下两片孔径为 270 微米的圆形金属网。将金属网放在平底瓶的底部。

然后将固定的幼虫放在网上，然后放置另一个网眼。在4摄氏度的温度下，将样品在增加的乙醇浓度下脱水20分钟。然后用环氧丙烷在室温下冲洗样品两次，每次五分钟。

接下来，将样品置于环氧丙烷和环氧树脂溶液中，然后在室温下将纯环氧树脂置于两小时。为了包埋，将聚乙烯薄膜切成一个大正方形和一个小的空心矩形支架。将小方块与大方块粘合在一起。

在大方块的中心加入足够的环氧树脂。然后打开立体镜，将样品放入预先放置的环氧树脂中，肌肉侧朝上。在样品上加入几滴环氧树脂，并用聚乙烯薄膜覆盖它们。

将用于聚合的样品在升高的温度下放置 24 小时。聚合后，使用锋利的刀片去除幼虫体的多余部分，同时保留梯形，包括 A2 和 A3 段。从剩余的幼虫体壁上取下梯形，并用AB胶将其连接到填充树脂的胶囊上。

在光学显微镜下，确认 A2 和 A3 节段的第六块和第七块肌肉的位置，保持切线平面平行于第六块肌肉。然后沿 A3 段的两侧切去五分之一的样品。使用切片机，从第六块肌肉开始制备样品的超薄切片。

切片后，将尽可能多的切片连接到每个铜网上。使用透射电子显微镜观察样品。在Lowicryl K4M树脂和环氧树脂中，Lowicryl K4M树脂提供了更清晰，更容易观察到果蝇身体肌肉的结果。

共聚焦成像增强了第六块和第七块肌肉之间的神经肌肉接头的可视化。透射电子显微镜显示珠状神经肌肉接头，提供改进的突触结构信息。由于金属网的限制，样品在整个脱水过程中保持平坦。

此外，样品在塑料产品之间聚合，防止样品折叠。未来，TEM样品制备方法可以应用于脑和腹侧神经索神经桩，从而提高超微结构研究的潜力。