Name: 具有eGFP组成型表达的 利什曼原虫 菌株的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解利用pLEXSY系统构建稳定表达eGFP的利什曼原虫菌株的方法。该方案通过有限稀释法克隆转染寄生虫，筛选高荧光强度克隆用于高通量药物筛选，为抗利什曼病药物研发提供可靠工具。

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本工作由巴拿马国家科学技术与创新秘书处（SENACYT）资助，资助编号为NI-177-2016，以及巴拿马国家研究系统（SNI）资助，资助编号分别为SNI-169-2018、SNI-008-2022和SNI-060-2022。

为保持样本无菌，所有涉及寄生虫培养的步骤均应在生物安全二级（BSL-2）操作台内进行，或遵循当地健康与安全法规操作。本方案的图示摘要见图1。
<img alt="基因编辑过程、质粒载体图谱、PCR、转染、基因组整合验证。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64939/64939fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：利用 pLEXSY-2.1 载体家族构建表达 eGFP 的 L. panamensis 和 L. donovani 寄生虫的实验流程概要图。 文中所述全部六个主要步骤均在此图中展示。1）eGFP 基因的扩增及插入 pLEXSY-2.1 载体：扩增目标基因，并引入限制性内切酶 KpnI 和 BglII 的识别位点；随后使用这两种酶对 eGFP 扩增片段和 pLEXSY 质粒进行依次消化，再通过 T4 DNA 连接酶进行连接。2）pLEXSY 表达质粒的线性化：使用 SwaI 酶对 pLEXSY + eGFP 构建体进行消化以实现线性化，并纯化出 7–8 kbp 的表达盒。3）转染及 4）多克隆筛选：通过电穿孔法将表达盒转染至 Leishmania 前鞭毛体，随后重新培养并使用抗生素筛选重组寄生虫；通过流式细胞术确认寄生虫的荧光表达。5）基因组整合验证及 6）有限稀释克隆：通过诊断性 PCR 验证 pLEXSY-eGFP 表达盒的基因组整合，PCR 正向引物结合表达盒序列，反向引物结合表达盒中不存在的染色体序列；可通过有限稀释法对转染后的培养物进行富集，筛选出平均荧光强度最高的克隆用于后续实验应用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64939/64939fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 将eGFP基因扩增并插入pLEXSY-2.1载体
<ol>
	<li>扩增 eGFP 基因 
	注意：由于本实验方案使用 pLEXSY-2.1 载体系列（见材料表），在将表达盒整合至利什曼原虫（Leishmania）染色体 18S rRNA 位点（ssu）后实现目标蛋白的组成型表达，因此第一步是在 eGFP 基因中引入包含限制性酶切位点的序列，以便将其插入 pLEXSY-2.1 载体。本实验中，由于 eGFP 仅需在细胞质中表达，因此在 eGFP 基因的 5' 和 3' 末端分别添加了 BglII 和 KpnI 的限制性酶切位点。使用 KpnI 进行克隆可使目标蛋白与载体 pLEXSY-2.1 上编码的六聚组氨酸标签（polyhistidine tag）在 C 末端融合，并紧随一个终止密码子，便于后续对目标蛋白进行纯化。因此，反向引物序列中不包含终止密码子。
	<ol>
		<li>根据 eGFP 的质粒来源，使用限制性酶切分析工具（如 NEBcutter，http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3）31 分析目标序列，确保其内部不含用于克隆的限制性内切酶（BglII 和 KpnI）或用于转染前线性化载体的 SwaI 酶的识别位点。</li>
		<li>设计用于扩增 eGFP 的正向和反向引物，使其分别包含 BglII 和 KpnI 的限制性酶切序列。例如，本实验中 eGFP 的来源为 pEGFP-N1-1X 质粒32，引物序列采用 Bolhassani 等人27 报道的序列： 
		正向引物（EGFP1）：5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3'（BglII 酶切位点加粗）。 
		反向引物（EGFP2）：5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3'（KpnI 酶切位点加粗）。</li>
		<li>使用高保真 DNA 聚合酶扩增目标基因，以确保编码序列的完整性。例如，针对引物 EGFP1 和 EGFP2，采用 Bolhassani 等人27 报道的 PCR 循环程序：94 °C 预变性 2 分钟，随后进行 30 个循环（94 °C 变性 30 秒，57 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分钟），最后在 72 °C 延伸 10 分钟。引物终浓度为 0.2 µM。</li>
		<li>使用常规 PCR 产物纯化试剂盒，或按照文献所述方法33 采用乙酸钠/乙醇沉淀法纯化扩增片段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 eGFP 插入 pLEXSY-2.1 表达载体
	<ol>
		<li>按照制造商说明，使用 BglII 和 KpnI 对 eGFP-PCR 产物进行末端酶切。
		<ol>
			<li>首先，根据制造商说明，为需要较低盐浓度的酶（本例中为 KpnI）设置反应体系，并在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
			<li>然后加入 100 mM NaCl 和 10 单位 BglII，继续孵育 15 分钟。反应产物纯化方法见步骤 1.1.4。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照步骤 1.2.1 中描述的顺序消化方案，使用 BglII 和 KpnI 消化 pLEXSY 表达载体。</li>
		<li>使用 T4 DNA 连接酶将 pLEXSY 载体与 eGFP 基因连接，摩尔比为 1:3（载体:插入片段）。简要操作如下：在 20 µL 反应体系中加入 100 ng 消化的 pLEXSY 载体和 28 ng 消化的 eGFP 产物，加入终浓度为 1× 的连接酶缓冲液和 3 单位 T4 DNA 连接酶。4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>使用标准转化方法33，将步骤 1.2.3 获得的连接产物转化至感受态 E. coli 细胞（如 XL-10、DH5α 或 DH10B）。将转化后的细胞涂布于含氨苄青霉素的 LB 琼脂平板，30 °C 培养 24 小时以筛选重组克隆（pLEXSY 质粒在 E. coli 中于 30 °C 下比 37 °C 更稳定）。</li>
		<li>通过菌落 PCR 筛选质粒中插入片段的存在。
		<ol>
			<li>挑取单个菌落，重悬于 20 µL 无核酸酶水中，95 °C 加热 15 分钟，取 1 µL 裂解液作为菌落 PCR 的 DNA 模板。使用步骤 1.1.2 中描述的 eGFP 扩增正向引物（本例中为 EGFP1）和反向引物 A264（5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3'）29。</li>
			<li>引物 A264 的设计使其在 pLEXSY-2.1 表达载体中插入片段终止密码子下游约 80 bp 处退火。例如，使用引物对 EGFP1 + A264 时，PCR 循环程序为：94 °C 预变性 2 分钟，随后进行 30 个循环（94 °C 变性 30 秒，50 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分钟），最后在 72 °C 延伸 10 分钟。引物终浓度为 0.2 µM。 
			注意：使用该引物组合预期扩增产物长度为 859 bp。引物 EGFP1 和 A264 的退火位点见图 2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用商业质粒提取试剂盒或标准碱裂解法33，从阳性克隆中制备纯化的质粒 DNA，用于后续转染。使用 30 °C 培养的 50 mL 过夜培养物，以获得每克隆至少 10 µg 的质粒 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. pLEXSY 表达质粒的线性化
<ol>
	<li>使用至少 10 µg 纯化的 pLEXSY-eGFP 质粒，用 SwaI（识别位点：5'-ATTTAAAT-3'）进行消化。在 25 °C 下消化 3–4 小时，然后在 65 °C 下加热失活 20 分钟。</li>
	<li>将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳，以分离产生的片段。该消化将产生两个片段：一个 2.9 kbp 的片段，代表在 E. coli 中复制和筛选所需的元件；另一个 7–8 kbp 的片段，代表线性化的表达盒。</li>
	<li>使用商业化的琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化表达盒。</li>
</ol>
3. 利用电穿孔法转染L. panamensis和L. donovani
注意：Leishmania 的培养操作如其他文献所述34。本示例中，将巴拿马利什曼原虫（L. panamensis）和杜氏利什曼原虫（L. donovani）前鞭毛体培养于添加了20%（v/v）胎牛血清（FBS）和50 µg/mL 庆大霉素的 Schneider 昆虫培养基中，并在 26 °C 下孵育。
<ol>
	<li>培养寄生虫至对数期或早期稳定期，获得足够数量的前鞭毛体，用于每次转染约 4 x 107 个寄生虫。在进入稳定期前，每培养瓶的最大细胞密度可能因利什曼原虫（Leishmania）种类及菌株对实验室条件的适应程度而异。如需要，可合并多个培养瓶的内容物。</li>
	<li>在室温（RT）下以 2,000 x g 离心寄生虫培养物 3 分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于 4 °C 的电穿孔缓冲液中（21 mM HEPES、137 mM NaCl、5 mM KCl、0.7 mM Na2HPO4 和 6 mM 葡萄糖；pH 7.5）27，使寄生虫浓度达到 1 x 108 个/mL。冰上孵育 10 分钟。 
	注意：电穿孔缓冲液在使用前必须通过过滤灭菌。</li>
	<li>同时，将含有 2–10 µg 线性化 pLEXSY-eGFP 载体的 2 mm 电穿孔杯和离心管预冷，载体溶于最大体积为 50 µL 的水或 10 mM Tris 缓冲液（pH 8.0）中。</li>
	<li>将 350 µL 预冷的寄生虫加入含线性化质粒的离心管中，并将全部 400 µL 混合液转移至冰上的电穿孔杯中。同时，以不含质粒 DNA 的寄生虫细胞作阴性对照进行电穿孔。</li>
	<li>采用以下两种方案之一进行电穿孔： 
	指数衰减：450 V，450 µF，单次脉冲。 
	时间常数：450 V，T = 3.5 ms，单次脉冲。 
	注意：上述方案使用商用基因脉冲仪（材料表）配合 PC 和 CE 模块完成。</li>
	<li>将电穿孔杯放回冰上 10 分钟，然后将电穿孔后的寄生虫转移至 5 mL 适宜的培养基中。本示例使用添加了 20%（v/v）胎牛血清（FBS）的 Schneider 昆虫培养基。在 26 °C 下孵育 20 小时。</li>
</ol>
4. 培养中的多克隆筛选
<ol>
	<li>电穿孔后约 20 小时，在显微镜下观察培养物。至少应有一半的寄生虫群体表现出良好的形态和运动能力（呈泪滴状的前鞭毛体，具有摆动的鞭毛，在培养基中移动和/或形成活跃的寄生虫聚集体）。根据所使用的 pLEXSY 质粒，加入相应的选择性抗生素。本示例中使用 pLEXSY-sat2.1，其含有链霉菌素乙酰转移酶作为筛选标记，因此使用浓度为 0.1 mg/mL 的诺尔斯托林（nourseothricin）作为选择性抗生素。</li>
	<li>通过显微镜持续观察培养物，直至观察到转染质粒 DNA 与未转染质粒 DNA 的寄生虫之间出现明显差异。</li>
	<li>通过流式细胞术验证寄生虫的荧光表达。
	<ol>
		<li>取 1 mL 对数后期培养物，在室温下以 2,000 × g 离心 3 分钟。用 PBS 洗涤两次，将最终沉淀重悬于 1 mL PBS 中。 
		注意：eGFP 的荧光可在大多数商用流式细胞仪的 FL1 通道中检测。不同仪器的前向散射、侧向散射及 FL1 通道的增益设置可能有所不同。本示例使用的是 CyFlow space（Sysmex）流式细胞仪。</li>
		<li>运行样品，以 0.5 µL/s 的速度收集 20,000 个事件，并将前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）和荧光 1（FL-1）通道的增益值分别设为 225.0、200.0 和 520.0。运行非荧光寄生虫的对照样品，以在 FSC 与 SSC 散点图中确定寄生虫群体。</li>
		<li>创建包含寄生虫群体的门控（G1），并通过该门控过滤 FL-1 通道，以确定前鞭毛体的自发荧光，并为 FL-1 通道设置荧光阳性门控范围（G2）。</li>
		<li>运行转染后的寄生虫样品以验证是否存在荧光。记录 G1 中荧光阳性寄生虫的百分比以及 G2 中荧光强度的平均值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 基因组整合的验证
注意：可通过诊断性 PCR 确认 pLEXSY-eGFP 表达盒的整合，使用与表达盒结合的正向引物（根据所用 pLEXSY-2.1 载体的不同而有所变化）和与染色体 ssu 侧翼序列结合的反向引物 F3002（5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3'），该侧翼序列在表达盒中不存在。在本示例中，使用正向引物 F2999（5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3'），因其可与 pLEXSY-sat2.1 表达盒中的序列结合。整合后表达盒的示意图及诊断性 PCR 引物的结合位点如图 2所示。
<ol>
	<li>通过常规酚/氯仿抽提法35或使用 commercial kit 从 2-5 mL 的静止期寄生虫培养物中纯化基因组 DNA。</li>
	<li>使用以下循环程序对 pLEXSY-sat2.1 进行诊断性 PCR：94 °C 预变性 2 分钟，随后进行 30 个循环（每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、53 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 1 分钟），最后在 72 °C 延伸 10 分钟。引物的终浓度为 0.2 µM。</li>
</ol>
<img alt="整合表达盒示意图；基因编辑、eGFP、抗性筛选标记、PCR引物、UTR区域。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64939/64939fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：整合表达盒的示意图。 标注为 Chr-S（灰色）的方框代表18S rRNA基因座（ssu）两侧的染色体序列，表达盒即整合至该位点。整合后的表达盒包含用于在ssu位点进行同源重组的5'和3'序列（蓝色）、一个额外的Leishmania核糖体启动子（红色）以增强蛋白表达、eGFP基因（绿色）、一个筛选标记基因（黄色），以及三个非翻译区（浅灰色），即utr1、2和3，这些非翻译区提供剪接信号，以实现转录后mRNA的加工，从而优化eGFP和筛选标记在Leishmania寄生虫中的表达。用于通过菌落PCR验证插入片段存在（步骤1.2.5）的正向与反向引物的退火位点，分别用标注为cpcr-fwd（EGFP1引物）和cpcr-rev（A264引物）的黑色箭头表示，扩增产物大小为859 bp。用于通过诊断性PCR验证基因组整合（步骤5）的正向与反向引物的退火位点，分别用标注为sat-fwd（F2999引物）和ssu-rev（F3002引物）的黑色箭头表示，扩增产物大小为2,271 bp。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64939/64939fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 有限稀释法克隆（可选）
<ol>
	<li>通过流式细胞术确认荧光后，将重组寄生虫稀释至每毫升含五个前鞭毛体的浓度36.</li>
	<li>添加 100 µL 将该稀释液各取适量加入96孔板的每孔中。以此方式，使板孔中的前鞭毛体平均接种密度为0.5个/孔，从而确保部分孔中恰好含有单个寄生虫，同时最大限度降低每孔含多个寄生虫的概率36.</li>
	<li>将培养板静置至少12小时。在显微镜下以不低于100倍的放大倍数观察培养板，直至检测到寄生虫生长的孔。</li>
	<li>当培养板孔中充满寄生虫时，用其内容物接种5 mL培养液。此过程需要1-2周。</li>
	<li>当克隆接种的培养物达到稳定期时，按照步骤 4.3 中所述，使用流式细胞术验证荧光。筛选可用于后续实验的克隆 体外 和 体内 基于荧光寄生虫百分比及在FL-1通道中测得的平均荧光强度的检测方法。应选择荧光寄生虫比例达98%–99%的克隆，并从中挑选平均荧光强度最高的克隆。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

多种报告基因在若干原虫寄生虫中的优缺点已被广泛研究。其中，GFP 和 eGFP 具有内在荧光特性，便于定量和成像。这些蛋白的荧光活性可通过荧光显微镜、荧光光度法或流式细胞术进行检测，操作简便。尽管GFP及其衍生物在旧大陆利什曼原虫（Leishmania）物种中作为报告基因已表现出良好的稳定性15,16,18,24，但针对表达GFP的L.（Viannia）株系的构建研究仍较少。Varela 等人37建立了以附加体质粒形式表达GFP的L. panamensis株系。对无鞭毛体外培养的前鞭毛体和细胞内无鞭毛体进行流式细胞术分析，表明这些寄生虫适用于药物筛选实验。然而，其荧光表达具有高度异质性，且转染群体中荧光寄生虫的数量依赖于抗生素衣霉素持续施加的选择压力。这一限制使得这...

原生动物寄生虫中的属 利什曼原虫 导致利什曼病，该病具有多种临床表现。此疾病流行于98个国家，每年发病率估计为90万至160万例1. 利什曼原虫 对人类具有致病性的物种分为两个亚属，即 L. (利什曼原虫）和 L. (维安娜亚属（Viannia））。感染某些属于 L. (利什曼原虫）亚属，例如 L. donovani 和 L. infantum，可能导致内脏利什曼病（VL），若不及时治疗可致死亡2属于该属的物种 L. (维安尼亚亚属)亚属与中美洲和南美洲大多数皮肤利什曼病（CL）和黏膜皮肤利什曼病（MCL）病例相关，尤其在巴拿马、哥伦比亚和哥斯达黎加， L. panamensis 这些临床表现的主要病因学病原体3,4.
目前用于抗利什曼原虫的化学治疗药物，如五价锑剂、米替福司和两性霉素B，具有高度毒性且价格昂贵。此外，近几十年来药物耐药性的增加，已成为影响全球患者有效治疗的又一阻碍因素5。已有研究证实，不同种属的Leishmania在药物敏感性方面存在显著差异，尤其是新大陆种与旧大陆种之间的差异更为明显6,7。基于上述原因，亟需将研究重点转向新型抗利什曼原虫药物的发现与开发，并特别关注针对不同物种的特异性策略。采用传统方法筛选大规模药物候选化合物库十分困难，因为这些方法在评估化合物对细胞内无鞭毛体的活性或开展in vivo实验时工作量极大8；因此，有必要发展新技术以克服这些局限性，包括报告基因的应用以及高内涵表型筛选技术的建立9。
报告基因的使用已显示出提高药物筛选效率的潜力，因为它有助于高通量筛选方法的开发和优化。 体内 检测。重组 利什曼原虫 表达多种报告基因的寄生虫已被多个研究团队成功构建。β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和荧光素酶等报告基因已在多种寄生虫中被引入 利什曼原虫 使用附加体载体的物种，对寄生虫胞外和胞内形式的药物筛选显示出有限的应用价值10,11,12,13,14,15这些方法存在一定的局限性，需要在培养过程中施加强烈的选择压力，以避免附加体质粒结构的丢失，同时还需使用额外的试剂来检测报告基因的活性。相比之下，绿色荧光蛋白（GFP）及其改良版本增强型绿色荧光蛋白（eGFP）已被广泛应用于大量转基因动物的构建 利什曼原虫 用于菌株的 体外 由于其灵活性和高灵敏度，以及能够利用流式细胞术或荧光测定法实现筛选过程自动化，药物筛选检测方法具有显著优势15,16,17,18,19尽管结果令人鼓舞，但这些转基因品系的培养物在荧光水平上表现出高度异质性，因为各寄生虫中GFP基因的拷贝数并不相同。此外，由于GFP基因被插入到一个附加体质粒结构中，维持荧光需要在培养过程中对寄生虫持续施加选择压力。
基于前述原因，许多研究致力于开发用于构建稳定重组菌株的新方法。这些研究大多依赖于将报告基因整合到核糖体位点，利用核糖体基因较高的转录速率20。L. infantum 和 L. amazonensis 的菌株已被成功构建，其基因组中整合了编码 β-半乳糖苷酶21、IFP 1.4、iRFP22 以及 tdTomato23 的基因，并已评估其在药物筛选实验中的应用价值。多个研究团队已开发出组成型表达 GFP 的 L. donovani 菌株，通过同源重组将 GFP 编码基因整合至 18S 核糖体 RNA 位点（ssu 位点）24,25；结果显示转染后的虫体群体中 GFP 表达稳定且均一，包括胞内无鞭毛体24,25，并已成功应用于药物筛选实验24,25,26。Bolhassani 等人27 构建了表达 GFP 的 L. major 和 L. infantum 菌株，其中 GFP 作为整合型转基因表达。他们使用的整合载体为 pLEXSY，该载体最初设计用于以 L. tarentolae 为宿主的系统中进行转基因蛋白表达28。pLEXSY-GFP 载体已被证明在构建多种组成型表达 GFP 的 Leishmania 菌株方面具有很高效率24,25,27,29,30。在这些寄生虫中，荧光信号均一，并可在胞内形态中维持，甚至可在感染小鼠的足垫病变部位检测到荧光27。
在本研究中，我们描述了利用 pLEXSY 系统构建表达 eGFP 基因（作为整合型转基因）的 L. panamensis 和 L. donovani 菌株的方法。通过该方法获得的菌株已被应用于本实验室的药物筛选实验，用于评估天然或合成来源分子对利什曼原虫的潜在抗利什曼活性。

<table><tbody><tr><td>96孔微孔板</td><td>康宁</td><td>CLS3340</td><td>平底透明黑色聚苯乙烯，无菌，带盖</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4718</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8351</td><td>BioXtra，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bgl&lt;/em&gt;II型限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R0144S</td><td>2,000 单位。10,000 单位/mL</td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>CLS430168</td><td>表面积 25 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，倾斜的颈部，瓶盖（塞密封）</td></tr><tr><td>ChemiDoc 成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>CyFlow Space</td><td>希森美康</td><td>暂无内容</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>粉末，BioReagent，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 &amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2526</td><td>&amp;nbsp;迁移速率随凝胶成分而变化。上样前将样品按1:3至1:6比例稀释。</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell 电穿孔系统</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652660</td><td>该系统由一个主机单元、两个辅助模块（电容扩展器模块（CE模块）和脉冲控制器模块（PC模块））以及一个ShockPod比色皿腔室组成。</td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652086</td><td>50个装，0.2 cm&amp;ndash;无间隙无菌电穿孔比色皿，适用于Gene Pulser和MicroPulser系统，用于哺乳动物及其他真核细胞</td></tr><tr><td>庆大霉素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>50 mg/mL，去离子水溶液，液体，0.1 &amp;mu;m 过滤，BioReagent，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>GoTaq Long PCR 预混液</td><td>Promega</td><td>M4021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>1 M，pH 7.0–7.6，经无菌过滤，BioReagent，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>IXplore Standard</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Kpn&lt;/em&gt;I-HF 限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R3142S</td><td>4,000 单位。20,000 单位/mL</td></tr><tr><td>含琼脂的LB肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>含琼脂的高营养参考微生物生长粉末培养基，适用于常规培养&amp;nbsp;E.coli&amp;nbsp;培养</td></tr><tr><td>LB肉汤&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2542</td><td>液体微生物培养基</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT 水平电泳系统</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1640300</td><td>小型水平电泳系统，包含8孔和15孔梳子，7 cm × 10 cm 紫外透射托盘</td></tr><tr><td>pEGFP-N1-1x</td><td>Addgene</td><td>172281</td><td>表达与一段50个碱基串联重复序列融合的eGFP mRNA</td></tr><tr><td>pLEXSYcon2.1 表达试剂盒</td><td>Jena Bioscience</td><td>EGE-1310sat</td><td>包含整合型组成型表达载体 pLEXSY-sat2.1。使用Nourseothricin（NTC，clonNAT）对抗生素转染子进行筛选。包含用于诊断性PCR和测序的所有引物。</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td>分子生物学级 - CAS 7447-40-7 - Calbiochem</td></tr><tr><td>PureYield 质粒小提系统</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td>最多15个 &amp;mu;从3 mL培养物中提取转染级质粒DNA</td></tr><tr><td>施耐德&amp;prime;昆虫培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>我们实验室用于培养利什曼原虫的培养基。</td></tr><tr><td>SOC培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1797</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>分子生物学级别，未检测到DNase、RNase和蛋白酶 &amp;ge;99%（滴定）</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD038</td><td>生物试剂，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养， &amp;ge;99.0%，易流动，Redi-Dri</td></tr><tr><td>SwaI 限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R0604S</td><td>2,000 单位。10,000 单位/mL</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>康宁</td><td>CLS431212</td><td>再生纤维素膜，直径 4&amp;nbsp;毫米，孔径0.2&amp;nbsp;&amp;mu;m</td></tr><tr><td>T100热循环仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1861096</td><td>热循环仪系统，包括96孔热循环仪、电源线、管架支撑环</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td>连接具有黏性末端或平末端的两条DNA链</td></tr><tr><td>Tris-硼酸-EDTA缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td>生物试剂，适用于电泳，10&amp;times; 浓缩物</td></tr><tr><td>Wizard 基因组DNA纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9285</td><td></td></tr><tr><td>XL10-Gold 超级感受态细胞</td><td>安捷伦</td><td>200317</td><td>XL10-Gold Kanr 超级感受态细胞，10 × 0.1 mL。F'附加体上携带卡那霉素抗性基因，适用于在氯霉素抗性载体中进行极高要求的克隆实验。转化效率： &gt; 5 × 10⁹ 转化子/&amp;micro;g pUC18 DNA</td></tr></tbody></table>

leishmania 物种菌株的构建及其egfp的组成型表达

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

原生动物寄生虫中的属 利什曼原虫 导致利什曼病，这是一种临床表现多样、影响全球数百万人的疾病。感染 L. donovani 可导致致命的内脏疾病。在巴拿马、哥伦比亚和哥斯达黎加， L. panamensis 是大多数报道的皮肤利什曼病和黏膜皮肤利什曼病病例的致病原因。鉴于现有方法在评估化合物对寄生虫胞内形态的活性或进行相关实验时极为耗时费力，研究大量药物候选物十分困难。 体内 检测方法。在本研究中，我们描述了生成 L. panamensis 和 L. donovani 在编码18S rRNA的位点整合了编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因且该基因组成型表达的菌株（ssu）。增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的编码基因来自商业载体，通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，以富集该基因并添加用于后续克隆的限制性酶切位点 BglII 和 KpnI 酶。通过琼脂糖凝胶纯化分离 eGFP 扩增片段，并用这些酶进行消化 BglII 和 KpnI，并连接到 利什曼原虫 表达载体pLEXSY-sat2.1（经相同酶切体系消化后）。将含有克隆基因的表达载体在 E. coli，纯化后通过菌落PCR验证插入片段的存在。将纯化的质粒线性化后用于转染 L. donovani 和 L. panamensis 寄生虫。通过PCR验证了基因的整合。通过流式细胞术评估eGFP基因的表达。采用有限稀释法对荧光寄生虫进行克隆，并利用流式细胞术筛选出荧光强度最高的克隆。

构建pLEXSY-eGFP质粒并转化感受态E. coli细胞后，含有eGFP插入片段的阳性菌落经第1.2节所述的菌落PCR扩增，将产生一条大小约为859 bp的产物（图3A）。使用SwaI对阳性菌落中提取的质粒进行完全酶切后，在琼脂糖凝胶电泳中应得到两个特征性片段：一条为2.9 kbp的片段，代表PLEXSY载体中包含E. coli复制和筛选所需全部元件的部分；另一条为7–8 kbp的片段，代表用于转染的线性化表达盒（图3B）。
转染后，多克隆筛选主要通过定性方式进行。在使用抗生素筛选过程中，需通过显微镜监测寄生虫培养物的状态，特别关注寄生虫的形态和运动能力。在成功恢复转染寄生虫的培养物后，应能在流式细胞仪的FL-1通道中检测到有效表达eGFP的寄生虫（图4A）；不同利什曼原虫（Leishmania）物种之间的转染效率可能存在差异。本...

本文描述了利用 pLEXSY 系统构建表达 eGFP 基因的稳定整合转基因L. panamensis和L. donovani菌株的方法。转染后的寄生虫通过有限稀释法进行克隆，针对两种物种均筛选出荧光强度最高的克隆，用于后续药物筛选实验。

Leishmania 物种菌株的构建及其eGFP的组成型表达

利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫引起利什曼病，该疾病具有多种临床表现，影响全球数百万人……

该方案对于构建可用于高通量筛选实验的菌株至关重要，这些菌株可用于评估分子的潜在活性及传统活性。本实验操作将由本实验室的研究助理 Juana Quintero 和 Laura Pineda 进行示范。首先，使用高保真聚合酶扩增目标基因，以保持其编码序列的完整性。将引物加入反应体系中，使其终浓度为 0.2 µM，并按照论文中所述条件运行PCR扩增程序。使用常规的PCR产物纯化试剂盒纯化扩增后的PCR片段。为了切除eGFP PCR产物的末端，根据制造商说明书设置含有Kpn I酶的反应体系，并在37摄氏度孵育1小时。然后向反应体系中加入100毫摩尔的氯化钠和10单位的Bgl II，再孵育15分钟。消化完成后，按照之前所示方法纯化反应产物。接下来，使用 Bgl II 和 Kpl I 对 pLEXSY 表达载体进行双酶切，操作步骤同前述的顺序消化方法。在含有连接酶缓冲液和 3 单位 T4 DNA 连接酶的 20 微升反应体系中，连接 100 纳克酶切后的 pLEXSY 载体与 28 纳克酶切后的 eGFP。在4°C下过夜孵育。孵育结束后，采用标准转化方法将连接产物转入感受态大肠杆菌细胞中。将转化后的细胞接种于LB氨苄青霉素琼脂平板上，在30°C下培养24小时，以筛选重组克隆。筛选菌落后，使用商业质粒提取试剂盒从阳性克隆中纯化质粒DNA，用于后续转染。为获得质粒的线性化片段，取至少10微克纯化的pLEXSY eGFP质粒，用SWA1在25摄氏度下消化三至四小时。孵育结束后，在65摄氏度下加热20分钟以灭活消化产物。然后将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳，以分离产生的片段。根据制造商说明书，使用商业化的琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化表达盒。培养寄生虫培养物，直至获得足够数量的对数期或早期稳定期前鞭毛体。如有需要，可合并多个培养瓶中的培养物。将寄生虫培养物在室温下以 2,000 G 离心三分钟。用 4 摄氏度的电穿孔缓冲液重悬沉淀，使浓度达到每毫升 1 × 10⁸ 个寄生虫，并置于冰上保存 10 分钟。同时，将含有2至10微克线性化pLEXSY eGFP质粒的离心管置于冰上预冷，管中加入50微升水或pH 8.0的10毫摩尔Tris缓冲液，并将2毫米直径的电穿孔比色皿一同预冷。接着，将350微升预冷的寄生虫加入含线性化质粒的离心管中，并将全部400微升混合液转移至冰上的电穿孔比色皿中。对含有质粒的寄生虫细胞进行电穿孔处理，同时平行设置不含质粒DNA的寄生虫细胞作为阴性对照。将比色皿置于冰上10分钟。将电穿孔后的寄生虫转移至5毫升相应的培养基中，在26摄氏度下培养20小时。电穿孔约20小时后，在显微镜下观察培养物，并根据所使用的pLEXSY质粒加入相应的选择性抗生素。在显微镜下持续观察培养物，直至电穿孔导入质粒DNA与未导入质粒DNA的寄生虫之间出现明显差异。为通过流式细胞术验证寄生虫的荧光表达，取1毫升处于稳定期的培养物，在室温下以2,000 G离心3分钟。用PBS洗涤细胞两次后，将最终沉淀重悬于1毫升PBS中。运行样品并在每秒0.5微升的速度下收集20,000个事件。将前向散射、侧向散射和荧光一通道的增益值分别设置为225.0、200.0和520.0。创建一个包含寄生虫群体的门G1。通过该门控过滤FL1通道，以确定前鞭毛体的自发荧光，并为FL1通道设置范围门控G2。运行转染后的寄生虫样本，以验证是否存在荧光。记录G1中具有荧光的寄生虫百分比以及G2中荧光强度的平均值。采用常规酚-氯仿抽提法或商用试剂盒，从2至5毫升处于静止期的寄生虫培养物中纯化基因组DNA。使用文中所述的循环程序对 pLEXSY-sat2.1 进行诊断性 PCR。通过流式细胞术确认荧光后，将重组寄生虫稀释至每毫升含五个前鞭毛体。取 100 微升该稀释液加入 96 孔板的每个孔中，并静置平板至少 12 小时。在显微镜下以至少100倍的放大倍数观察培养板，直至检测到有寄生虫生长的孔。当某一孔中充满寄生虫时，取该孔内容物接种至5毫升培养液中。待接种的克隆培养物进入稳定期后，按照前述方法通过流式细胞术验证荧光表达。选择荧光寄生虫比例为98%至99%且平均荧光强度最高的克隆，用于体外和体内实验。对转化了pLEXSY eGFP质粒的大肠杆菌（E.coli）进行菌落PCR，扩增出859个碱基对的产物。使用SWA1对质粒进行完全酶切，产生两个片段：一个为2.9千碱基对的片段，包含在大肠杆菌中复制和筛选所需的所有必要元件；另一个为7至8千碱基对的片段，代表用于转染的线性化表达盒。流式细胞术分析显示，82%的转染L. panamensis寄生虫表达了eGFP。多克隆筛选后，通过流式细胞术分析的L. donovani寄生虫中98.44%具有荧光，而L. panamensis中为82.0%。pLEXSY eGFP成功整合至SSU位点，在诊断性PCR中产生了一个2.3千碱基对的产物。选择荧光寄生虫比例最高且平均荧光强度最强的克隆，用于后续药物筛选实验。该方法可实现重组利什曼原虫的制备，具有

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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