Leishmania 物种菌株的构建及其eGFP的组成型表达

该方案对于构建可用于高通量筛选实验的菌株至关重要，这些菌株可用于评估分子的潜在活性及传统活性。本实验操作将由本实验室的研究助理 Juana Quintero 和 Laura Pineda 进行示范。首先，使用高保真聚合酶扩增目标基因，以保持其编码序列的完整性。将引物加入反应体系中，使其终浓度为 0.2 µM，并按照论文中所述条件运行PCR扩增程序。

使用常规的PCR产物纯化试剂盒纯化扩增后的PCR片段。为了切除eGFP PCR产物的末端，根据制造商说明书设置含有Kpn I酶的反应体系，并在37摄氏度孵育1小时。然后向反应体系中加入100毫摩尔的氯化钠和10单位的Bgl II，再孵育15分钟。

消化完成后，按照之前所示方法纯化反应产物。接下来，使用 Bgl II 和 Kpl I 对 pLEXSY 表达载体进行双酶切，操作步骤同前述的顺序消化方法。在含有连接酶缓冲液和 3 单位 T4 DNA 连接酶的 20 微升反应体系中，连接 100 纳克酶切后的 pLEXSY 载体与 28 纳克酶切后的 eGFP。

在4°C下过夜孵育。孵育结束后，采用标准转化方法将连接产物转入感受态大肠杆菌细胞中。将转化后的细胞接种于LB氨苄青霉素琼脂平板上，在30°C下培养24小时，以筛选重组克隆。

筛选菌落后，使用商业质粒提取试剂盒从阳性克隆中纯化质粒DNA，用于后续转染。为获得质粒的线性化片段，取至少10微克纯化的pLEXSY eGFP质粒，用SWA1在25摄氏度下消化三至四小时。孵育结束后，在65摄氏度下加热20分钟以灭活消化产物。

然后将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳，以分离产生的片段。根据制造商说明书，使用商业化的琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化表达盒。培养寄生虫培养物，直至获得足够数量的对数期或早期稳定期前鞭毛体。

如有需要，可合并多个培养瓶中的培养物。将寄生虫培养物在室温下以 2,000 G 离心三分钟。用 4 摄氏度的电穿孔缓冲液重悬沉淀，使浓度达到每毫升 1 × 10⁸ 个寄生虫，并置于冰上保存 10 分钟。

同时，将含有2至10微克线性化pLEXSY eGFP质粒的离心管置于冰上预冷，管中加入50微升水或pH 8.0的10毫摩尔Tris缓冲液，并将2毫米直径的电穿孔比色皿一同预冷。接着，将350微升预冷的寄生虫加入含线性化质粒的离心管中，并将全部400微升混合液转移至冰上的电穿孔比色皿中。对含有质粒的寄生虫细胞进行电穿孔处理，同时平行设置不含质粒DNA的寄生虫细胞作为阴性对照。

将比色皿置于冰上10分钟。将电穿孔后的寄生虫转移至5毫升相应的培养基中，在26摄氏度下培养20小时。电穿孔约20小时后，在显微镜下观察培养物，并根据所使用的pLEXSY质粒加入相应的选择性抗生素。

在显微镜下持续观察培养物，直至电穿孔导入质粒DNA与未导入质粒DNA的寄生虫之间出现明显差异。为通过流式细胞术验证寄生虫的荧光表达，取1毫升处于稳定期的培养物，在室温下以2,000 G离心3分钟。用PBS洗涤细胞两次后，将最终沉淀重悬于1毫升PBS中。

运行样品并在每秒0.5微升的速度下收集20,000个事件。将前向散射、侧向散射和荧光一通道的增益值分别设置为225.0、200.0和520.0。创建一个包含寄生虫群体的门G1。

通过该门控过滤FL1通道，以确定前鞭毛体的自发荧光，并为FL1通道设置范围门控G2。运行转染后的寄生虫样本，以验证是否存在荧光。记录G1中具有荧光的寄生虫百分比以及G2中荧光强度的平均值。采用常规酚-氯仿抽提法或商用试剂盒，从2至5毫升处于静止期的寄生虫培养物中纯化基因组DNA。

使用文中所述的循环程序对 pLEXSY-sat2.1 进行诊断性 PCR。通过流式细胞术确认荧光后，将重组寄生虫稀释至每毫升含五个前鞭毛体。取 100 微升该稀释液加入 96 孔板的每个孔中，并静置平板至少 12 小时。

在显微镜下以至少100倍的放大倍数观察培养板，直至检测到有寄生虫生长的孔。当某一孔中充满寄生虫时，取该孔内容物接种至5毫升培养液中。待接种的克隆培养物进入稳定期后，按照前述方法通过流式细胞术验证荧光表达。

选择荧光寄生虫比例为98%至99%且平均荧光强度最高的克隆，用于体外和体内实验。对转化了pLEXSY eGFP质粒的大肠杆菌（E.coli）进行菌落PCR，扩增出859个碱基对的产物。使用SWA1对质粒进行完全酶切，产生两个片段：一个为2.9千碱基对的片段，包含在大肠杆菌中复制和筛选所需的所有必要元件；另一个为7至8千碱基对的片段，代表用于转染的线性化表达盒。

流式细胞术分析显示，82%的转染L. panamensis寄生虫表达了eGFP。多克隆筛选后，通过流式细胞术分析的L. donovani寄生虫中98.44%具有荧光，而L. panamensis中为82.0%。pLEXSY eGFP成功整合至SSU位点，在诊断性PCR中产生了一个2.3千碱基对的产物。

选择荧光寄生虫比例最高且平均荧光强度最强的克隆，用于后续药物筛选实验。该方法可实现重组利什曼原虫的制备，具有