通过转录组学研究温和噬菌体对其溶原宿主的影响

前噬菌体是已整合到细菌基因组中的细菌病毒。我们采用转录组学方法，全面探究前噬菌体对其宿主细菌生物学特性的影响。

本文所述方法解决了前噬菌体裂解周期自发诱导的关键难题。通过仔细优化培养条件，可实现对前噬菌体状态下基因表达的清晰分析。

大多数细菌病原体中都存在前噬菌体，但其意义通常尚未被充分理解。这些工具可以揭示前噬菌体作为多种细菌功能调控因子的作用。

几乎有无限多的前噬菌体-宿主关系尚未被研究。这代表着一个巨大的、尚未开发的潜在治疗靶点资源，而这些方案有助于预测这些靶点。主要挑战在于找到合适的培养条件，以平衡溶原菌的生长与前噬菌体的自发诱导。

众所周知的次要挑战在于，保持RNA的完整性以用于后续研究。

首先，将过夜培养物以1:100的比例接种到100毫升LB培养基中，制备新鲜的溶原菌和指示菌宿主培养物。在37摄氏度、180 RPM振荡条件下培养。

为监测溶原菌的生长，从接种开始每小时采集一次一毫升样品，持续八小时。将培养物进行连续稀释：取100 µL加入900 µL LB培养基中。涡旋振荡至最高速度，并继续进行10⁻¹至10⁻⁹的系列稀释。

取10微升所需稀释液滴加到LB琼脂平板上。待其干燥后，在30摄氏度下培养18至24小时。培养结束后，计数菌落数量，并使用给定公式计算可存活细菌细胞的数量。

接下来，为了计数时间样品中的感染性噬菌体颗粒，将100微升对数生长期的利福平抗性指示宿主细胞加入熔化的顶层琼脂中，并加入利福平。将经连续稀释的溶原菌培养物各10微升点样于接种了指示菌的顶层琼脂表面。待其完全干燥后，在37摄氏度下孵育18至24小时。

孵育后，计数噬菌斑数量，并使用给定公式计算具有感染性的噬菌体颗粒数。将第一个烧瓶标记为未诱导组，其余烧瓶标记为诱导组，并标注各样品应收获的时间点。随后将过夜培养的溶原性菌液按1:100的比例接种至8个250毫升的烧瓶中，每个烧瓶含80毫升LB培养基进行继代培养。

将锥形瓶在37摄氏度、180转/分钟振荡条件下孵育。90分钟后，当600纳米处的光密度值在0.1至0.2之间时，向未诱导的锥形瓶中加入4微升1%冰醋酸。将未诱导锥形瓶中的80毫升培养物加入720毫升LB培养基中，并立即加入160毫升终止液，然后将锥形瓶置于冰上30分钟，以稳定RNA转录本。

接下来，向含有80毫升培养物的诱导标记烧瓶中加入诺氟沙星，终浓度为每毫升1微克。充分混匀，并在37摄氏度、180转/分钟振荡条件下孵育1小时。将80毫升诱导培养物加入720毫升LB培养基中，使细胞恢复生长。从0到1小时，每隔10分钟向每个烧瓶中加入终止液，收集细菌细胞。

在4 °C条件下，以10,000 g离心15分钟，弃去上清液。用可调式自动移液器轻轻将沉淀在残留液体中重新悬浮。将悬浮液转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C条件下以13,000 g离心1分钟。

弃去残留的上清液，密封微量离心管，然后将沉淀物迅速浸入液氮中进行速冻。向每个冻存的沉淀物中加入 1 毫升 Trizol，通过移液吹打使悬液充分匀浆。

在确定一组可作为目标噬菌体复制各阶段标志物的靶基因后，使用相应的引物从基因组DNA中扩增每个靶基因。

使用文稿中所述的扩增条件进行PCR。PCR完成后，使用PCR纯化试剂盒纯化每个扩增子，并根据制造商说明书将其克隆至TA克隆载体中。通过Sanger测序验证每个克隆产物的序列。

在计算四种单个质粒的拷贝数后，将质粒DNA用无核酸酶水进行系列稀释，为每个标记基因制备标准模板。在96孔板中分别加入1微升cDNA和各目标基因对应的质粒标准品，按照试剂盒制造商的说明进行定量PCR反应。

PCR结束后，使用Excel程序绘制DNA拷贝数的对数值与循环阈值（Ct值）的关系图。进行线性回归计算，以显示决定系数及线性方程。接着，利用线性回归得出的线性方程，估算每个检测目标的拷贝数。

然后利用标准曲线线性回归的参数和给定公式计算PCR扩增效率。在根据引物的扩增效率百分比验证引物后，计算DNA的绝对拷贝数。

对自发性 LES 噬菌体产生的时序测定表明，每细胞的噬菌斑形成单位（PFU）在 2 小时时最低，在 6 小时时最高。

溶原状态在两小时时最为稳定，因此采用该条件进行qRT-PCR分析。结果显示，cro基因为裂解复制的早期标志基因，其表达量在诱导后30分钟内从未诱导培养物中的2.31 × 10⁹拷贝显著上升至3.02 × 10¹¹拷贝。

类似地，裂解复制中期标志物P蛋白和O蛋白的表达量也显著上调，其拷贝数分别从1.74 × 10⁸上升至1.25 × 10¹⁰，以及从6.05 × 10²上升至5.68 × 10⁵。在未诱导培养物至诱导后30分钟期间，裂解复制周期的晚期标志物表达量也表现出显著增加。在所检测的内参基因中，RPOD的表达最为稳定，相较于16S RNA或ProC基因表现更优。

与裂解复制标志物相比，C-one基因的表达相对稳定。此外，与裂解复制标志物相比，未诱导培养物中C-one基因的拷贝数也明显较高。

糟糕的RNA文库制备无法产生可靠的数据或解释。

控制自发诱导和RNA完整性是最重要的因素。可以利用表达谱分析来研究任何基因的时间动态变化。设计合适的实验条件和时间点，对于准确描绘生物体对任何刺激的生物学响应至关重要。

该技术已鉴定出两种不同原噬菌体与宿主之间的先前未知的相互作用。由于大多数细菌都含有尚未研究的原噬菌体，这一方法可能有助于发现大量新的治疗靶点或应用。