Name: TACI:用于 3D 钙成像分析的 ImageJ 插件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 了解TACI这一开源ImageJ插件如何分析三维钙成像数据。该工具专门处理Z轴运动漂移，精准识别神经元最大荧光强度，提升重叠神经元信号分析的准确性，助力神经科学研究。

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弗拉林影像中心的蔡司 LSM 880 用于采集钙成像数据。我们感谢 Michelle L Olsen 博士和 Yuhang Pan 在使用 IMARIS 软件方面的协助。感谢 Lenwood S. Heath 博士对稿件提出的建设性意见，以及 Steven Giavasis 对 GitHub README 文件的反馈。本研究由 NIH R21MH122987（https://www.nimh.nih.gov/index.shtml）和 NIH R01GM140130（https://www.nigms.nih.gov/）资助，资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中未发挥任何作用。

1. 钙成像
<ol>
	<li>果蝇幼虫准备 
	注意：果蝇及幼虫在 12 h:12 h 明暗循环条件下，于 25 °C 环境中培养。
	<ol>
		<li>用 CO2 麻醉果蝇。将 20–45 只雄蝇和 20–45 只雌蝇分装至每支果蝇培养管中，使其至少恢复 24–48 小时，以从 CO2 暴露中恢复。 
		注意：果蝇暴露于 CO2 的时间应尽可能短。</li>
		<li>为同步幼虫年龄，将果蝇轻敲转移至含有酵母颗粒的新培养管中，让其产卵 4–8 小时，随后通过翻转移除果蝇。</li>
		<li>使用 10 mL 20% w/v 蔗糖溶液收集 72 小时龄的幼虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微镜与温度控制装置设置
	<ol>
		<li>在共聚焦显微镜（参见材料表）上进行成像，使用配备 z 轴压电载物台及载物台插件的系统，设置如下：激光器：氩离子；扫描模式：帧扫描；帧大小：512 × 512；扫描速度：最大；通道/位深度：1/8 位；缩放倍数：1.5；z 轴层叠：切片数 = 15，保留 = 切片；聚焦装置与策略：定焦；聚焦：开启定焦功能。</li>
		<li>使用导热化合物将帕尔帖制冷模块连接至散热片，构建热电冷却器。帕尔帖模块由 2 A 电源供电。</li>
		<li>将热电偶微探头连接至数据采集设备以记录温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>钙成像
	<ol>
		<li>用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗幼虫 3 次。</li>
		<li>用移液器将 75 μL 1× PBS 滴加至载玻片中央。</li>
		<li>将一至两条幼虫置于 1× PBS 中，并将热电偶微探头放置于幼虫附近。 
		注意：幼虫与微探头之间的距离应约为 5 mm。若微探头距离过近，幼虫可能移动；距离过远则可能导致温度读数不准确。</li>
		<li>用盖玻片覆盖幼虫和热电偶微探头，并用指甲油密封盖玻片。</li>
		<li>将载玻片置于显微镜载物台上，使用 25× 物镜调焦，并将热电冷却器放置于载玻片上。 
		注意：帕尔帖模块直接放置在载玻片上幼虫所在位置，以施加温度刺激。</li>
		<li>在共聚焦软件中对目标荧光细胞进行聚焦。调节激光功率以避免信号过饱和。在 z 轴层叠设置中设定首层与末层位置。 
		注意：记录前应使用尽可能低的激光功率，以防止光漂白。</li>
		<li>同时启动 z 轴层叠扫描与温度记录。</li>
		<li>通过控制为帕尔帖模块供电的电源来调节其表面温度。开启电源以降低温度，关闭电源以升高温度。</li>
		<li>停止 z 轴层叠扫描与温度记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 三维钙成像数据的分析
<ol>
	<li>将钙成像数据导出为 TIFF 文件，并保存在与 TIFF 文件基础名称相同的文件夹中。 
	注意：文件名 不得包含任何逗号.
	<ol>
		<li>使用以下参数从 ZEN（黑版）导出钙成像数据： 文件类型，TIFF；压缩方式，LZW；通道，2；Z轴位置，全部；时间点，全部；相位，1；区域，完整.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装
	<ol>
		<li>从 GitHub 下载 TACI-Calcium_Imaging.jar（https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases）。</li>
		<li>在 FIJI 中通过点击安装插件 插件 在 菜单栏 然后点击 安装 在下拉菜单中（插件 | 安装）。然后，重新启动 FIJI。 
		注意：请 NOT 使用 插件 | 安装插件.</li>
		<li>点击运行插件 插件 然后选择 TACI-钙成像 (插件 | TACI-钙成像).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 重命名 将TIFF文件名转换为所需结构的函数。 
	注意：该工具默认使用 filename_h#t#z#c#.tif 作为文件名结构（其中 h# 和 c# 为可选项；#：正整数）。如果图像文件名不符合默认结构，则 重命名 必须执行该功能。
	<ol>
		<li>单击以选择需要重命名TIFF图像的文件夹 浏览文件夹.</li>
		<li>填写参数信息。列出五个参数，包括 文件名, 相, 最大 T 位点, 最大Z轴位置，以及 通道每个参数包含三个数值： 前文内容，参数值，以及 订购. 
		注意：该信息是 区分大小写. 如果图像文件名包含 参数前的短语，填写短语作为 前文 相应参数。如果图像文件名中包含参数 所有参数之后的短语，填写短语作为 后文.
		<ol>
			<li>务必输入 文件名, 最大T位，以及 最大 Z 位置 以及参数值对于 最大 T 位置 和 最大 Z 位置 包括 所有手指.</li>
			<li>等待 文件名 使用文件夹名称自动填充。</li>
			<li>如果 TIFF 文件名不包含相位和通道信息，请将相应的参数值留空，并选择 Na 在 订购.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>点击 重命名 创建一个同名文件夹，并添加后缀 _r。注意，该文件夹内的 TIFF 文件名已重新排列，以兼容后续处理 组织 功能。 
		注意：TIFF 图像的文件名中已添加 _r。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 组织 用于将同一 z 位置的 TIFF 图像保存到一个文件夹中的函数。 
	注意：文件夹名称必须包含 同名 作为 TIFF 文件内部的基本名称 且必须 不包含任何逗号.
	<ol>
		<li>点击以选择需要整理TIFF图像的文件夹 浏览文件夹.</li>
		<li>如果参数 CSV 文件（param.csv）存在，请等待参数值自动填充完毕。 
		注意：param.csv 文件具有规定的格式。参数（包括 filename、phase、position_t、position_z、channel 和 is_gray）必须从 A 列开始从左至右依次填写在第 1 行。每个参数对应的值必须填写在第 2 行。</li>
		<li>如果参数 CSV 文件（param.csv）不存在，则需手动填写参数值。确保参数值的 相 和 通道 包括 字母，而参数值 T 位置 和 Z 轴位置 应为 最大数量 t-和z-位置。如果图像文件名不包含相位或通道信息，请输入 Na.</li>
		<li>必要时创建灰度 TIFF 图像。保留该复选框 图像是否为灰度？ 取消选中以将图像转换为灰度。</li>
		<li>点击 组织 创建一个同名文件夹，并在其中创建名为 _gray_stacks 的文件夹，同时生成以相同名称命名并附加 _#（#：z轴位置）的子文件夹。注意观察TIFF文件已按z轴位置被分类至相应的文件夹中，并生成了一个名为param.csv的文件，其中包含参数及其对应的数值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 FIJI 中使用 TrackMate 从每个 z 位置提取目标细胞的荧光强度。 
	注：此步骤也可通过其他成像软件完成。
	<ol>
		<li>在 FIJI 中打开 z 位置文件夹中的 TIFF 图像。</li>
		<li>单击以运行 TrackMate 插件 | 跟踪 | TrackMate，并在必要时调整以下参数。
		<ol>
			<li>使用 DoG 或 LoG 检测器.</li>
			<li>更换 斑点直径，阈值，以及 中值滤波器. 调整 斑点直径 与细胞的直径相似。如果细胞呈椭圆形，则调整 斑点直径 与短轴相似。 
			注意：增加 阈值 有助于避免背景噪声被误认为信号，同时不影响信号强度（补充图1）。然而，增加 阈值 可能会遗漏真实信号（补充图1。如果信号较强，则使用 中值滤波器 以减少椒盐噪声。</li>
			<li>设置滤波器以去除部分（若非全部）无关信号。 滤光片 X 和 Y 是空间滤波器。使用 滤光片 X 和 Y 去除远离真实信号的无关信号。 
			注意：当对一幅图像设置滤镜时，必须检查所有其他图像，以确保真实的信号未被去除。</li>
			<li>设置 连接最大距离，间隙闭合最大距离，以及 闭合间隙 最大帧间隙. 设置 连接最大距离 和 间隙闭合最大距离 是 3至5倍的斑点直径，尤其是在样本随时间显著移动时，有助于减少轨迹数量。设置 间隙闭合最大帧间隙 到 图像堆栈中的图像数量.</li>
			<li>将感兴趣区域（ROIs）的荧光强度导出为 CSV 文件。如果使用的是旧版本的 TrackMate，请选择 导出所有斑点统计数据 在 选择一个操作 窗口。如果 TrackMate 版本为 7.6.1 或更高版本，请选择 斑点 在 显示选项 将交互式文件导出或另存为 CSV 文件。 
			注意：两个文件均与图像窗口交互；高亮一个感兴趣区域（ROI）将在图像窗口中显示对应的 ROI。这些文件包含感兴趣细胞在相应时间点（POSITION_T）的平均荧光强度（MEAN_INTENSITY 或 MEAN_INTENSITY_CH1）。相同的 TRACK_ID 应代表不同时间点的同一 ROI。然而，此对应关系并非始终准确，必要时需手动校正。若 TrackMate 未能在某些时间点识别 ROI，则这些时间点将不显示。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取背景荧光强度，并创建 Background_list.csv 文件。 
	注：在本研究中，每个 z 位置的背景强度是通过选取不含荧光信号、来自不同时间点的三到五个大小相同的邻近区域，计算其平均值来估计的。
	<ol>
		<li>Background_list.csv 文件具有规定的格式：每一列包含一个神经元的信息，从 Neuron 0 开始。在第 1 行填写神经元编号，例如 Neuron 0。然后，在每个被分析的 z 位置下提供相应的背景强度值——如果 Neuron 0 分析了五个 z 位置，则在 Neuron 0 下方填写五个背景强度值。 
		注意：TACI 需要 Background_list.csv 文件 提取 功能。如果背景信号可忽略，则必须提供包含每个神经元零背景强度的 Background_list.csv 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 提取 用于识别每个 t 位置的最大荧光强度并计算 ΔF/F0 如公式（1). 
	<img alt="荧光变化公式 ΔF/F₀，静态平衡，定量分析" src="/files/ftp_upload/64953/64953eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">    (1)
	<ol>
		<li>创建一个文件夹，并以神经元编号命名，从“Neuron 0”开始。将包含对应神经元荧光信息的 CSV 文件保存至该文件夹中。每个 CSV 文件包含一个 z 轴位置的信息，因此 CSV 文件的数量等于所分析的 z 轴位置数量。将 CSV 文件命名为 Mean_Intensity#.csv（# 代表 z 轴位置），每个 CSV 文件至少包含两列：POSITION_T 和 MEAN_INTENSITY 或 MEAN_INTENSITY_CH1。 
		注意：为每一个目标细胞创建一个文件夹。</li>
		<li>将步骤 2.7.1 中生成的 Background_list.csv 文件和文件夹保存到同一个文件夹中。通过单击选择该文件夹 浏览文件. 
		注意：Background_list.csv 文件中的背景值数量必须与每个神经元对应的 Mean_Intensity#.csv 文件的数量相匹配。</li>
		<li>背景文件将自动填充。请填写t-位置的最大数量 T位点数量.</li>
		<li>点击 提取 创建一个结果文件夹，包含每个神经元的 CSV 文件和图表。CSV 文件包括最大荧光强度和 ΔF/F 的信息0 在每个 t 位置。图表为 ΔF/F 的线形图0 在 t-位点上方 
		注意：在本研究中，ΔF/F0 使用公式（1）。每个 z 位置的第一个值用作 F0. 如果这个 F0 不适用20插件提供文件，包括 python_files 文件夹中每个神经元的原始数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 融合 用于对每个神经元的 ΔF/F 进行平均的函数0，计算标准误（SEM），并绘制平均 ΔF/F 图0 超过 t-位点。
	<ol>
		<li>选择由系统创建的结果文件夹 提取 通过点击来实现功能 浏览文件.</li>
		<li>填写 T位点数量 t-位点数量最多。</li>
		<li>点击 合并 创建一个 merged_data 文件夹，其中包含一个 merged_data.csv 文件和一张 Average_dF_F0.png 图。CSV 文件包含平均值和标准误（SEM）ΔF/F 的信息0 在每个 t 位置。该图是平均 ΔF/F 的线形图0 超过 t-位点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
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<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
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<li>Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expression+atlas+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+identifies+a+molecular+basis+of+carbonation+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4252(2018).</li>
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<li>Klein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+determinants+of+behavioral+dynamics+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究开发了一种新的 ImageJ 插件 TACI，并描述了用于分析三维钙成像的流程。目前许多可用的工具主要关注 x/y 方向的运动校正，然而 z 轴方向的运动同样需要明确诊断或校正6。在活体生物中进行图像采集时，即使生物体已被固定，z 轴方向的移动仍不可避免；而某些刺激（如温度变化）常常引起显著的 z 轴漂移。增加 z 层叠的高度可确保在整个成像过程中记录到目标细胞；然而，分析 z 轴方向的运动并非易事，尤其是当单个细胞在多个 z 位置出现时。如果忽略此类运动，研究人员将无法获得这些细胞精确的钙信号响应。TACI 通过提取每个 z 位置的荧光信号来校正 z 轴漂移。TACI 的关键步骤是提取每个时间点的最大值，并用其代表细胞的强度。因此，在整个成像过程中包含目标细胞的所有 z 位置至关重要。此外，我们建议确保一个细胞至少出现在五个或更多的 z 位置，以避免 z 距离和 z 位置影响最大值的准确性（补充图 2A,B）。此外，TACI 还能够分离在横向（x/y 方向）重叠但出现在不同 z 位置的细胞。
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细胞内钙离子水平是神经元兴奋性的精确指标。钙成像通过检测细胞内钙离子浓度的变化来研究神经元活动1。随着细胞内钙浓度检测技术的发展，包括基因编码钙指示剂（GECIs）如GCamp2,3可通过遗传学方法在特定神经元群体中实现无创表达，钙成像在神经科学研究中的应用日益广泛。激光器和显微镜组件成本的降低也进一步推动了钙成像技术的使用4。尤为重要的是，钙成像能够在自由活动的动物中同时记录和研究单个神经元以及大规模神经元群体的活动5。
然而，钙成像数据分析具有挑战性，原因在于：（1）需要追踪单个细胞随时间变化的荧光信号；（2）由于神经元活动的影响，荧光信号会间歇性地消失或重新出现；（3）神经元可能在各个方向上移动，特别是进出焦平面或出现在多个焦平面上4,6。手动分析耗时较长，且随着记录时长和神经元数量的增加，变得难以实施。目前已开发出多种软件程序以加快钙成像数据分析的进程。过去开发的软件通常局限于特定实验条件，导致其他实验室难以采用。近年来，为满足现代软件共享标准，已涌现出若干可在不同研究团队间一致分析钙成像数据的工具7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。然而，这些工具大多需要编程知识和/或依赖商业软件。缺乏编程能力以及软件使用门槛限制了研究人员对这些方法的采纳。此外，许多现有工具主要关注x/y方向的运动校正，而z轴方向的运动同样需要被明确识别并加以校正6。目前亟需一种能够分析三维钙成像数据的计算工具，特别针对存在z轴漂移并在多个z平面上出现的神经元。理想情况下，该工具应基于开源软件，并且无需编程知识，以便其他实验室能够便捷地采用。
本文中，我们开发了一款新的 ImageJ 插件 TACI，用于分析三维钙成像数据。首先，该软件根据 z 轴位置对三维钙成像数据进行重命名（如需要）和组织。在每个 z 位置上追踪目标细胞，并通过 TrackMate 或其他计算工具提取其荧光强度。随后应用 TACI 分析细胞在 z 轴方向上的运动情况。该插件可识别 z 层切片中的最大值，并以此代表细胞在相应时间点的强度。该工作流程适用于分析在各个方向上存在运动，和/或在横向（x/y 方向）重叠但出现在不同 z 位置的神经元的三维钙成像数据。为验证该工作流程的有效性，我们使用了果蝇幼虫温敏神经元以及脑内蘑菇体神经元的三维钙成像数据集。值得注意的是，TACI 是一款开源的 ImageJ 插件，无需任何编程知识即可使用。

<table><tbody><tr><td>钝头填充针</td><td>BD</td><td>303129</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10035-04-8</td><td>果蝇食物成分</td></tr><tr><td>二氧化碳</td><td>Airgas</td><td>UN1013</td><td>200号高压钢瓶</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气泡发生器套件</td><td>Genesee</td><td>59-180</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 LSM880</td><td>Zeiss</td><td>4109002107876000</td><td>配备5个激光器、2个标准PMT检测器、32通道GaAsP检测器、Airyscan检测器和Definite Focus.2的倒置Axio Observer Z1显微镜。</td></tr><tr><td>DAQami软件</td><td>Measurement Computing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Genesee</td><td>62-113</td><td>果蝇食物成分</td></tr><tr><td>果蝇琼脂</td><td>Genesee</td><td>66-111</td><td>果蝇食物成分</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>64-17-5</td><td>果蝇食物成分</td></tr><tr><td>果蝇品系：&lt;em&gt;Ir21a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Dr. Paul Garrity 实验室</td><td></td><td>馈赠品</td></tr><tr><td>果蝇品系：&lt;em&gt;Ir21a-Gal80&lt;/em&gt;</td><td>Dr. Lina Ni 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>果蝇品系：&lt;em&gt;Ir68a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Dr. Aravinthan DT Samuel 实验室</td><td></td><td>馈赠品</td></tr><tr><td>果蝇品系：&lt;em&gt;Ir93a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Dr. Paul Garrity 实验室</td><td></td><td>馈赠品</td></tr><tr><td>果蝇品系：&lt;em&gt;UAS-GCaMP6&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington 果蝇品系中心</td><td>42750</td><td></td></tr><tr><td>Flypad</td><td>Genesee</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>通用锻造黄铜减压阀</td><td>Gentec</td><td>G152</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS pH 7.4 (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>绿色果蝇导管</td><td>Genesee</td><td>59-124</td><td></td></tr><tr><td>导热化合物</td><td>MG Chemicals</td><td>860-60G</td><td></td></tr><tr><td>散热片</td><td>Digi-Key Electronics</td><td>ATS2193-ND</td><td>裁剪至12.9 x 5.5 cm</td></tr><tr><td>照明器</td><td>AmScope</td><td>LED-6W</td><td></td></tr><tr><td>失活干酵母</td><td>Genesee</td><td>62-108</td><td>果蝇食物成分</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Pervical</td><td>DR-41VL</td><td>光暗周期：12小时光照:12小时黑暗；温度：25 &amp;deg;C；湿度：40-50% RH。</td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯</td><td>Thermo Scientific</td><td>126965000</td><td>果蝇食物成分</td></tr><tr><td>显微盖玻片</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;48382-126</td><td>22 x 40 mm</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-544-2</td><td>25 x 75 x 1.0 mm</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Kleancolor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>窄型果蝇培养管</td><td>Genesee</td><td>32-113RL</td><td></td></tr><tr><td>物镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>420852-9871-000</td><td>LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27</td></tr><tr><td>帕尔贴制冷模块</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-1.0-0.8</td><td>30 x 30 mm</td></tr><tr><td>塞子</td><td>Genesee</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Circuit Specialists</td><td>CSI1802X</td><td>10伏直流2.0安线性台式电源</td></tr><tr><td>Princeton艺术家画笔Nepture</td><td>Princeton Artist Brush Co.</td><td></td><td>系列4750，2号</td></tr><tr><td>四水合酒石酸钠钾</td><td>Thermo Scientific</td><td>033241-36</td><td>果蝇食物成分</td></tr><tr><td>载物台插件&amp;nbsp;</td><td>Wienecke and Sinske</td><td>432339-9030-000</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td>任何体视显微镜均可使用</td></tr><tr><td>T型接头</td><td>Genesee</td><td>59-123</td><td></td></tr><tr><td>热电偶数据采集设备</td><td>Measurement Computing</td><td>USB-2001-TC</td><td>单通道</td></tr><tr><td>热电偶微探针</td><td>Physitemp</td><td>IT-24P&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>黄色玉米粉</td><td>Genesee</td><td>62-101</td><td>果蝇食物成分</td></tr><tr><td>Z轴压电载物台</td><td>Wienecke and Sinske</td><td>432339-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

taci：用于三维钙成像分析的 imagej 插件

TACI: An ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis

神经科学研究已发展到使用复杂的成像和计算工具，从数据集中提取全面的信息。钙成像是一种广泛应用的技术，需要借助复杂的软件才能获得可靠的结果，但许多实验室在更新方案以符合现代标准时，难以采用计算方法。这一困难主要源于缺乏编程知识以及软件的付费壁垒。此外，在进行钙成像过程中，目标细胞会在各个方向上发生移动。目前已开发出多种方法用于校正横向（x/y方向）的运动。
本文介绍了一种利用新型 ImageJ 插件——钙成像轨迹分析工具（TrackMate Analysis of Calcium Imaging, TACI）来研究三维钙成像中 z 轴方向运动的工作流程。该软件可识别神经元在所有 z 层面中出现时的最大荧光值，并以此代表该神经元在相应时间点（t 位置）的强度。因此，该工具能够区分在横向（x/y 方向）上重叠但位于不同 z 层面的神经元。&#160;作为 ImageJ 插件，TACI 是一种用户友好、开源的三维钙成像分析计算工具。我们通过果蝇幼虫的温度敏感神经元验证了该工作流程，这些神经元在温度变化过程中表现出各个方向的运动，并结合从果蝇脑部获取的三维钙成像数据集进行了验证。

三维钙成像分析的工作流程 
在本研究中，我们开发了一款新的 ImageJ 插件 TACI，并描述了一种用于追踪 z 轴漂移并分析三维钙成像数据的工作流程，该流程可精确定位在多个 z 轴位置中出现的单个细胞的响应信号（图 1）。该工具包含四个功能：重命名（RENAME）、整理（ORGANIZE）、提取（EXTRACT） 和 合并（MERGE）。首先，如果图像文件名与 ORGANIZE 功能不兼容，可使用 RENAME 功能将文件名转换为所需的格式结构。接着，ORGANIZE 功能将对三维钙成像的 TIFF 数据按 z 轴位置进行灰度化处理（如需要）并进行整理，来自相同 z 轴位置的图像将被保存在同一文件夹中。随后，可使用不同的图像分析工具检测并追踪各 z 轴位置中的感兴趣区域（ROIs），并提取其随时间变化...

钙成像的TrackMate分析（TACI）是一款开源的ImageJ插件，用于3D钙成像分析，可检测z轴方向的运动，并识别每个z层堆栈的最大值，以表示细胞在相应时间点的强度。该插件能够分离在横向（x/y方向）重叠但位于不同z平面的神经元。

TACI：用于三维钙成像分析的 ImageJ 插件

神经科学研究已发展到使用复杂的成像和计算工具，从数据集中提取全面信息。钙成像……

在钙成像记录过程中，细胞会在各个方向上移动。目前已开发出多种工具用于校正 X 和 Y 方向的运动，但 Z 轴方向的运动也需要明确诊断并进行校正。TACI 是一款用户友好的开源 ImageJ 插件。它可检测Z轴漂移，并对各个方向存在运动的3D钙成像进行分析。制备果蝇幼虫后，用PBS清洗三次。将75微升PBS滴加到玻片中央。取一至两条幼虫置于PBS中，将热电偶微探针放置在幼虫附近。用玻璃盖玻片覆盖幼虫和热电偶微探针，并用指甲油密封。将载玻片置于显微镜载物台上。使用25倍物镜找到焦平面，并将热电冷却器放置在载玻片上。在共聚焦软件中，对目标荧光细胞进行调焦。调整激光功率以避免信号过饱和，并在Z轴堆栈设置中设定第一层和最后一层的位置。同时开始Z轴层扫成像和温度记录。调节供给帕尔帖元件的电源，以改变帕尔帖表面的温度。随后，停止Z轴层扫成像和温度记录。下载 TACI 钙成像点阵 jar 文件后，通过点击菜单栏中的“Plugins”，然后在下拉菜单中选择“Install”，将插件安装到 Fiji 中。随后重启 Fiji，并通过点击“Plugins”并选择 TACI 钙成像插件来运行该插件。选择重命名功能，以将 TIFF 文件名转换为所需的结构。单击“浏览文件夹”以选择需要重命名TIFF图像的文件夹，并等待文件名自动填充为文件夹名称。检查最大T位置和最大Z位置。确保最大T位置和最大Z位置的参数值包含所有数字。按顺序输入每个参数的位置。如果TIFF文件名中不包含相应短语和通道，请将对应的参数值留空，并按顺序选择NA。如果有任何后缀文本，请添加到后缀参数中。单击“重命名”以创建一个同名文件夹，名称后跟下划线 R。注意，TIFF 文件的文件名已在文件夹中重新排列，以兼容“整理”功能。接下来，使用“整理”功能将处于相同 Z 位置的 TIFF 图像保存到同一个文件夹中。通过单击“浏览文件夹”来选择需要整理 T 图像的文件夹。如果参数 CSV 文件存在，请等待参数值自动填充。如果参数 CSV 文件不存在，则手动填写参数值。确保相位和通道的参数值包含存在的字母，而 T 位置和 Z 位置的参数值应分别为 T 和 Z 位置的最大数值。如果图像文件名不包含相位或通道信息，请输入 NA。需要时通过取消勾选“R 图像灰度”复选框来生成灰度 TIFF 图像。单击“组织”以创建一个同名文件夹，其名称后跟下划线、gray、下划线和 stacks，并在该文件夹中生成以相同名称命名、后跟下划线和 Z 位置编号的子文件夹。随后可观察到 TIFF 文件按 Z 位置被分类至相应文件夹中，同时会生成一个名为 param.csv 的文件，其中包含参数及其对应的值。现在使用 Fiji 中的 TrackMate 从每个 Z 位置提取目标细胞的荧光强度。在 Fiji 中打开 Z 位置文件夹中的 TIFF 图像，通过点击插件并选择“跟踪”（Tracking），然后选择 TrackMate 来运行 TrackMate。使用 DOG 或 LOG 检测器调整参数。调整斑点直径阈值和中值滤波参数。设置滤波器以去除无关信号。设定轨迹连接的最大距离、空缺填补的最大距离以及空缺填补的最大帧间隔。将感兴趣区域的荧光强度导出为 CSV 文件。为每个神经元创建一个文件夹，并使用神经元编号命名，从编号为零的神经元开始。将包含相应神经元荧光信息的 CSV 文件保存至文件夹中。将 CSV 文件命名为“mean intensity Z position number dot CSV”，文件中至少包含两列：position T 和 mean intensity，或 mean intensity channel one。创建名为 background_underscore_list dot CSV 的文件，该文件以特定格式包含所有神经元的信息，起始神经元编号为 neuron zero。填写神经元编号，例如在第一行填写神经元零。然后提供所分析的每个 Z 位置的背景强度。如果对神经元零分析了四个 Z 位置，则在神经元零下方填写四个背景强度值。将生成的背景列表点 CSV 文件以及包含荧光信息 CSV 文件的文件夹保存在同一文件夹中。打开 TACI，选择提取功能，然后通过点击浏览文件来选择该文件夹。背景文件将自动填充。请填写T位置的最大数量。单击“提取”以创建结果文件夹，其中包含每个神经元的CSV文件和图表。CSV 文件包含每个 T 位置的最大荧光强度以及 ΔF/Δ0 值。图表为 ΔF/F0 与 T 位置关系的折线图。使用合并功能，对所有神经元的 ΔF/F0 值进行平均。计算标准误（SEM），并绘制平均 ΔF/F₀ 随 T 位置的变化图。通过点击“浏览文件”选择由提取函数创建的结果文件夹，并在相应位置填入最大的 T 位置数量。单击“合并”以创建一个合并的数据文件夹，其中包含一个合并的带下划线的数据 CSV 文件和一张平均 ΔF/F₀ 的 PNG 图。CSV 文件包含每个 T 位置处的平均值及标准误（SEM）ΔF/F₀ 信息。该图是以 T 位置为横坐标的平均 ΔF/F₀ 折线图。表达 GCaMP6M 的果蝇幼虫冷敏感细胞在 27 摄氏度的非激活状态下几乎不显示荧光。然而，在 10 摄氏度时，细胞内钙水平迅速升高。当温度回升时，钙水平迅速下降。表达GCaMP六F的果蝇脑神经元在0.1时间点的钙成像显示，七个神经元中有四个呈现荧光，且这些神经元的荧光强度随时间推移而降低。在存在辛醛的情况下，多个神经元变亮。在92时间点，10个神经元的荧光同时增强，表明这些蘑菇体神经元对辛醛气味产生响应。TACI 可以分离重叠的细胞。在此最大投影图像中，识别出两个重叠的神经元。在正交视图中，这些神经元被分离开来，表明这些神经元出现在不同的 Z 位置。橙色细胞在Z7处显示出最强信号，而蓝色细胞在Z10处信号最强。这两个细胞荧光的变化揭示了橙色细胞存在延迟但强烈的激活。在提取过程中，神经元出现的所有Z位置中的最大荧光值被用来代表该神经元在相应层面上的强度。若使用 TACI 分析大量神经元，需在新开发的函数中整合跨 Z 轴位置的配准，并结合荧光信息。TACI 提供了一种用户友好的开源计算方法，用于三维胶囊成像分析，可在单个细胞出现在多个 Z 轴位置时检测其在 Z 轴上的细胞运动。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

TACI:用于 3D 钙成像分析的 ImageJ 插件

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TACI：用于三维钙成像分析的 ImageJ 插件

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