Name: 使用全内反射荧光（TIRF）显微镜对脂质双层中的横向迁移率和离子通道活性进行单分子成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 了解使用全内反射荧光显微镜对脂质双层中的离子通道进行单分子成像的方法。该技术无需荧光标记即可追踪离子通道的横向迁移率，揭示膜扩散与通道功能之间的关系，为膜蛋白研究提供可靠方案。

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感谢 Beate Nitschke 在蛋白质制备方面的帮助，感谢 Robin Ghosh、Michael Schweikert（Stuttgart）和 Maximilan Ulbrich（Freiburg）富有见地的讨论。本工作由斯图加特系统生物学研究中心（SRCSB）以及巴登-符腾堡基金会（资助号：BiofMO-6，授予 SN）的资助支持。

我们声明不存在利益冲突。

本文介绍的实验方案旨在利用单分子全内反射荧光显微镜，通过DIB膜研究侧向离子通道运动与通道功能之间的相互作用。为了获得最佳数据，制备稳定且含有尽可能多分离良好的通道的DIB膜至关重要，这是获取可被充分分析的单个粒子时间序列的前提。
需要优化的关键参数包括脂质的选择、油相中的脂质浓度，以及水相液滴中蛋白质和去垢剂的浓度。所使用的脂质具有特殊性，因其在低温下无明显的相变。DPhPC 是一种常用于构建稳定膜系统的脂质40。原则上，任何在低温下仍能维持其流动性环境的脂质均可能适用于此用途。此外，该脂质应不易被氧化。液滴中的去垢剂浓度应尽可能低，以避免膜破裂。通常在去垢剂浓度低于临界胶束浓度（cmc）时，可实现稳定的膜结构和良好的蛋白质整合效率，前提是膜蛋白不会发生沉淀。
如果DIB膜不能耐受特定去垢剂21,41，或者当蛋白质无法从低去污剂溶液中直接整合到DIB膜时，可先将蛋白通道重构至小型单层脂质体（SUVs）中，再从液滴侧使SUVs与DIB膜融合，该方法已成功应用于 E. coli MscL42有时，由于油相中的脂质浓度过低，无法形成DIB膜。为防止DIB膜破裂，还应注意水凝胶与液滴之间的渗透压必须精确平衡，且不能影响Ca2+-flux 来自 顺式 到 转 过度。优化琼脂糖的厚度和孔径大小对于观察膜蛋白的扩散似乎至关重要。应避免琼脂糖层的任何干燥。厚度可使用原子力显微镜测定。17通过调整琼脂糖浓度、体积以及旋涂过程中的旋转速度，可优化水凝胶的孔径大小和厚度。但需注意，水凝胶层的厚度会影响成像对比度。为在DIBs中捕获膜蛋白，可将普通琼脂糖水凝胶替换为定制合成的非交联、镍-NTA修饰的低熔点琼脂糖，以实现对目标蛋白的捕获。 通过 一个His标签17过高的荧光背景通常由DIB膜破裂引起。对于多孔培养板而言，这一问题尤为突出，因为Ca2+-敏感染料扩散进入水凝胶。此时应避免使用相邻的孔。Ca的荧光漂白2+- 敏感性染料在膜上方不应成为显著的限制因素，因为它会被液滴主体中未激发的染料所置换（图3A）位于TIRF隐逝场之外。该蛋白质的定位精度由斑点拟合的准确度和像素大小决定。
微弱的荧光信号可能是由于通过通道的 Ca2+ 流量较低所致。可能的原因包括：(i) TIRF 设置不准确（例如激光强度），(ii) 跨膜的渗透性 Ca2+ 压力，或 (iii) 通道本身的 Ca2+ 通透性过低。针对第一个问题，需要优化激光强度、TIRF 角度和相机增益。后两个问题可通过在膜两侧施加电势来克服2,43。然而，施加外部电压可能扭曲实验结果，因为电学效应可能影响那些实际上不受电压调控的配体门控或机械敏感性离子通道的开放状态。此类通道的例子包括线粒体蛋白转运酶 TOM-CC27 及其形成通道的亚基 Tom4026,44,45,46。最后需要指出的是，将膜蛋白以特定方向插入 DIB 膜以实现预期功能具有较大挑战性，相关定量研究极为罕见47,48。在某些情况下，整合蛋白的方向是随机的。这对于膜蛋白研究而言是一个严重问题，因为某些膜蛋白仅在膜的一侧被激活。
全内反射荧光显微镜（TIRF）是一种研究平面支撑膜中单分子事件的有力方法49。相关实例包括利用该技术阐明通道蛋白（如α-溶血素50、产气荚膜梭菌溶素O51和OmpG52）的组装与折叠途径，这些研究同时结合了FRET作为辅助技术。此外，机械敏感性离子通道MscL的激活此前已通过电流测量方法，在机械刺激支撑的DIB双层膜系统中得到研究42。基于上述工作，未来的研究可将本文所述平台与单分子FRET实验相结合，以光学方式在单分子水平上研究机械敏感性通道17。通过向液滴中注入缓冲液、拉伸内层DIB单层膜，或靶向结合单个通道至底层水凝胶，可进一步研究不仅响应膜张力和/或曲率的机械激活通道的物理机制——此类通道包括MscL和MscS、双孔域K+通道TREK-1、TREK-2和TRAAK，以及PIEZO通道（综述见53）——还可研究通道与细胞骨架的局部结合，正如在触觉敏感离子通道NOMPC中所展示的那样54,55。

本实验方案旨在描述如何在聚合物支撑的液滴界面双层膜（DIB）膜中研究膜蛋白的膜流动性与离子通道通透性之间的相关性1,2,3。
目前这一技术补充了一系列先进的光学和表面分析工具，例如单颗粒追踪4,5、荧光相关光谱6,7以及高速原子力显微镜8,9,10。这些技术为膜的动态组成和结构提供了宝贵的见解，而这些组成和结构会影响基于膜的反应11,12,13。蛋白质在膜中的运动和侧向扩散依赖于其在膜内的局部蛋白密度，同时单个蛋白质分子也可能被脂筏14或蛋白质-蛋白质相互作用15,16所捕获。根据从膜延伸至胞外环境或胞质溶胶的蛋白质结构域不同，蛋白质的流动性可从高度可动到完全不可动不等。然而，由于膜及其周边结构的复杂性，通常难以解析侧向流动性特征与蛋白质功能之间的相互关系17。
DIB 膜已被证明是进行膜蛋白生物物理单分子分析的有效平台18,19,20,21,22。它们通过水相液滴与脂质/油相中水凝胶支撑基底接触后发生脂质自组装而形成。与常用的支撑脂双层（SLBs）1,23,24,25类似，当DIBs被修饰上合适的配体时，可通过蛋白质与聚合物基质的临时或永久结合，实现对侧向流动性的局部调控17。后者可作为细胞膜中蛋白质分布不均等生化过程的模型系统10。
本文所述的实验方法依赖于对 Ca2+ 敏感的荧光染料，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）检测靠近细胞膜的单个通道中的 Ca2+ 离子流2,22。这种光学方法通过渐逝波激发光的物理特性，将样品的照明范围限制在膜附近极短的距离内，从而显著降低荧光背景信号。这对于实现单分子检测所需的高空间和时间分辨率至关重要。与传统的电生理学方法26,27不同，该方法无需施加膜电位即可研究单个通道的离子流动。此外，该方法无需对通道进行荧光染料或可能干扰其在膜内侧向移动的分子标记。
该方法特别适用于在单分子水平上研究嵌入膜中的蛋白质通道，而无需使用传统的电生理学技术。通过利用来自Neurospora crassa的线粒体蛋白质转运通道TOM-CC28,29,30以及支持小分子亲水性物质跨Escherichia coli外膜扩散的OmpF通道17,31，我们展示了如何研究并关联这两种蛋白质的膜流动性与通道活性。我们建议，尽管该方法已针对TOM-CC和OmpF进行了优化，但仍可轻松应用于其他蛋白质通道。

<table><tbody><tr><td>1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>100x 油镜 Apochromat N.A. 1.49</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>TIRF 显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x 霍夫曼调制反差物镜 NA 0.25&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于评估 DIB 膜形成的显微镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x 物镜 N.A. 0.25</td><td>Nikon</td><td>MRL00102</td><td>TIRF 显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>40x 霍夫曼调制反差物镜 NA 0.55</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于评估 DIB 膜形成的显微镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>488 nm 激光器，100 mW&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Visitron</td><td></td><td>TIRF 显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta pure&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td>蛋白质纯化系统</td></tr><tr><td>Bradford 检测试剂盒，Pierce</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>Chelax 100 树脂</td><td>Biorad</td><td>143-2832</td><td></td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MC1024452500</td><td></td></tr><tr><td>透析盒 Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>87735</td><td></td></tr><tr><td>DIB 腔室&amp;nbsp;</td><td>定制</td><td></td><td>用于 DIB 膜的 PMMA 腔室</td></tr><tr><td>数字功率计和能量控制台</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>激光功率计&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>双蒸 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100 霍夫曼调制反差显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于评估 DIB 膜形成的显微镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8042.2</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 相机 iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>TIRF 显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>固定角转子 Ti70</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8, CalciFluor&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-362561</td><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;敏感染料</td></tr><tr><td>法国压细胞破碎均质器</td><td>Igneus</td><td>Igneus 40000 psi</td><td></td></tr><tr><td>GFP 滤光片</td><td>AHF</td><td></td><td>用于白光光源落射荧光激发 DIB 膜的滤光片设置&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td><td>Roth</td><td>1870.2</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Roth</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器 10 mL</td><td>Roth</td><td>X033.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器 100 mL</td><td>Roth</td><td>X049.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器 500 mL</td><td>Roth</td><td>EY49.1</td><td></td></tr><tr><td>加热块&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Minitube&amp;nbsp;</td><td>HT200</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>9205.3</td><td></td></tr><tr><td>十六烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296317</td><td></td></tr><tr><td>His Trap HP 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>29051021</td><td>Ni-NTA 柱</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.04716.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>10314243</td><td></td></tr><tr><td>KLM 旋涂仪&amp;nbsp;</td><td>Schaefer Tec</td><td>SCV-10</td><td></td></tr><tr><td>List medical L/M-3P-A 垂直移液器拉制仪</td><td>Artisan Technology Group</td><td>57761-1</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>M8 体视显微镜</td><td>Wild</td><td></td><td>体视显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab&amp;nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>R2022a</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil 移液器吸头</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter 2010 注射器&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanoliter 2010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷</td><td>Glycon Biochemicals</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖，非交联型</td><td>Cube Biotech</td><td>124115393</td><td>定制</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 软件</td><td>Nikon</td><td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>n-辛基-聚氧乙烯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40530</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>6367.3</td><td></td></tr><tr><td>光电二极管传感器&amp;nbsp; Si，400 - 1100 nm，500 mW</td><td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>激光功率计传感器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Diener Electronics</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>制备型超速离心机 Optima</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四通道 TIRF 滤光片 446/523/600/677 HC</td><td>AHF</td><td></td><td>用于 488 nm 激光激发 DIB 膜的滤光片设置&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Resource Q 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17117701</td><td>阴离子交换柱</td></tr><tr><td>硅油 AR 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Super LoLux 相机</td><td>JVC</td><td></td><td>体视显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>热振荡器</td><td>Gerhardt</td><td>THL 500/1</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E 荧光显微镜&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Roth</td><td>8952.2</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪&amp;nbsp;</td><td>Bandelin Sonorex</td><td>RK 100</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Vacuubrand</td><td>MD 4C NT</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光照明用白光光源（100 W）</td><td>Nikon</td><td>MBF72655</td><td>TIRF 显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Roth</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

高分辨率成像技术表明，许多离子通道并非静态结构，而是参与高度动态的过程，包括孔形成亚基与辅助亚基的瞬时结合、侧向扩散以及与其他蛋白质的聚集。然而，侧向扩散与功能之间的关系尚不清楚。为解决这一问题，我们描述了如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜监测并关联支撑脂质膜中单个通道的侧向移动性与活性。膜通过液滴界面双层（DIB）技术在超薄水凝胶基底上构建。与其他类型的模型膜相比，这些膜具有机械稳定性强、适用于高灵敏度分析技术的优点。本方案测量Ca2+ 通过观察Ca²⁺指示荧光染料的荧光发射来检测单通道离子流2+-敏感染料位于膜附近。与传统的单分子追踪方法不同，该技术无需使用可能干扰膜蛋白侧向运动和功能的荧光融合蛋白或标记物。与蛋白质构象变化相关的离子流改变仅由蛋白质在膜中的侧向运动引起。实验以线粒体蛋白转位通道TOM-CC和细菌通道OmpF为例展示了代表性结果。与OmpF相比，TOM-CC的门控行为对分子限域效应和侧向扩散性质高度敏感。因此，支撑性液滴界面双层膜是研究离子通道侧向扩散与其功能之间关联的有力工具。

实时无电极光学单通道记录揭示了DIB膜中侧向蛋白质运动与单个离子通道功能之间的相互作用。将线粒体TOM核心复合物（图1A）重构至DIB膜（图4D）中，显示出侧向移动性与离子通透性之间存在显著的时间相关性（图5A）。TOM-CC的门控似乎对侧向运动模式敏感17。移动中的通道表现出通过其孔道的Ca2+流以及较高的荧光点强度；而被束缚、不移动的分子则显示低至中等荧光强度。对于线粒体蛋白质导入通用孔道TOM-CC，该单分子方法揭示了其侧向移动性与离子通透性之间存在强烈的时间相关性，提示TOM-CC通道具有机械敏感特性17。自由移动的TOM-CC分子发生侧向停止时，伴随着TOM-CC通道的部分或完全关闭。对嵌入OmpF（图1E 和 图4F）的DIB膜进行成像，由于OmpF几乎完全嵌入膜内，未观察到“走-停”效应（图5B）。OmpF的随机停止不伴随荧光强度变化，因此也不涉及其孔道的关闭。根据荧光信号38，可估计单个通道的位置精度在5至10 nm之间。然而需要注意的是，若通道因与琼脂糖水凝胶发生移动锚定而轻微晃动，则无法达到该精度，例如在中间状态下的TOM-CC分子，其均方位移可达120 nm（图5A）。
<img alt="TOM复合物结构、层析洗脱谱、SDS-PAGE凝胶；蛋白质分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：TOM-CC的分离。（A）N. crassa TOM-CC的冷冻电镜结构30,39。对表达带有6xHis标签Tom22的N. crassa菌株来源的线粒体，使用DDM进行溶解，并依次进行Ni-NTA亲和层析（B）和阴离子交换层析（C）。（D）分离得到的TOM-CC的SDS-PAGE结果。（E）晶体结构（PDB，1OPF）以及（F）纯化的E. coli OmpF的SDS-PAGE结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="应用琼脂糖水凝胶并结合全内反射荧光显微镜的DIB膜形成过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：PMMA腔室组装流程图。 步骤1：将玻璃盖玻片通过旋涂法涂覆琼脂糖水凝胶。步骤2：将旋涂后的盖玻片安装至定制的PMMA显微镜腔室中。步骤3：在35 °C加热板上，向PMMA腔室的进样口加入额外的低熔点琼脂糖。步骤4：在缓冲液/油相界面（左侧）和琼脂糖水凝胶/油相界面（右侧）处，于水相液滴周围形成脂单层。步骤5：使用移液器将单个水相液滴加入PMMA腔室的孔中，当两个脂单层接触时形成脂双层。步骤6：通过霍夫曼调制对比显微镜验证DIB膜的形成。步骤7：利用全内反射荧光（TIRF）显微镜获取插入离子通道的DIB膜特定区域的图像。绿色：0.75%琼脂糖；黄色：含Ca2+离子的2.5%琼脂糖；品红色：脂质/油相；深蓝色：含有Ca2+敏感染料和蛋白的水相液滴缓冲液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞膜动态、通过 Fluo-8 的钙离子内流（Ca²⁺）、光谱图、蛋白质运动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：实验装置示意图。（A）PMMA 孔板中 DIB 膜的示意图。双层膜置于超薄 0.75% 琼脂糖薄膜上，以便利用 TIRF 成像技术，在 trans 侧使用 Ca2+ 敏感型荧光染料（Fluo-8）随时间监测离子通道中的 Ca2+ 流动。（B）Ca2+ 流动完全由从 cis 到 trans 的渗透压控制。这使得能够同时确定通道在膜中的位置及其开/关状态。此处所示通道为 N. crassa 线粒体的蛋白质传导通道 TOM-CC30。（C）单个 TOM-CC 通道的运动轨迹。绿色：移动中的通道；黄色：静止的通道。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米盘蛋白质分析、强度映射、荧光显微镜、光谱强度图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：在 DIB 膜中对 TOM-CC 和 OmpF 进行成像。 （A）通过霍夫曼调制对比显微镜成像的 DIB 膜，显示水凝胶与液滴之间的双层接触区域。（B）如（A）所示方式成像的断裂 DIB 膜。箭头：PMMA 腔室边缘。（C）无蛋白质通道的 DIB 膜，通过 TIRF 显微镜成像。（D）通过 TIRF 显微镜成像的含有重建 TOM-CC 的 DIB 膜。白色方框标记了高强度（SH）、中等强度（SI）和低强度（SL）的区域。（E）将（A）中标记的三个区域的荧光强度分布拟合为二维高斯函数，可揭示单个 TOM-CC 的位置及其通道中的 Ca2+ 流。(F) 含有重建 OmpF 的 DIB 膜。（G）对（F）中标记的荧光斑点进行高斯拟合。与具有两个孔道的 β-桶状蛋白复合物 TOM-CC 不同，具有三个孔道的 β-桶状蛋白 OmpF 仅表现出一种通透性状态。像素大小：0.16 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质动力学图；振幅与时间关系；显示 TOM-CC、OmpF；实验结果与分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：通道活性与 TOM-CC 的侧向移动性相关。（A）TOM-CC 的荧光振幅轨迹（上图）及其对应的运动轨迹（下图）表明，TOM-CC 的开-关通道活性与其复合物在膜中的侧向移动性相关。轨迹显示出三种通透状态：绿色表示完全开放状态；黄色表示中间通透状态；红色表示通道关闭状态；红色星号表示处于中间状态的 TOM-CC 在其平均位置附近约 ±60 nm 范围内摆动。基于完全开放状态和中间状态荧光信号计算的位置精度37在 5 nm 至 10 nm 之间。（B）OmpF 的荧光振幅轨迹（上图）及其对应的运动轨迹（下图）。无论 OmpF 处于运动状态还是被捕获状态，均仅显示一个强度水平。对应于分子被捕获时间段的轨迹片段以灰色标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液 </td>
			<td colspan="3">试剂浓度</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1 % (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 10% (v/v) 甘油, 300 mM NaCl, 和 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) DDM, 10% (v/v) 甘油, 1 M 咪唑 和 1 mM PMSF</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 2% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO)</td>
			<td>100 mL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO)</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* 使用前脱气并经 0.22 μm 滤膜过滤。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：TOM-CC 分离用缓冲溶液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液 </td>
			<td colspan="3">试剂浓度</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB*</td>
			<td colspan="3">1% (w/v) 胰蛋白胨、1% (w/v) NaCl 和 0.5% (w/v) 酵母提取物 </td>
			<td>1100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2、约 750 单位 DNase 以及 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）  </td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl，pH 7.5</td>
			<td>50 mL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3</td>
			<td colspan="3">4% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）、2 mM β-巯基乙醇和 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C4</td>
			<td colspan="3">2% (w/v) SDS、500 mM NaCl 和 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C5</td>
			<td colspan="3">0.5% (w/v) 辛基聚氧乙烯醚（octyl POE）、1 mM EDTA 和 20 mM Tris（pH 8.5） </td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* 使用前灭菌。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：OmpF 分离用缓冲溶液。

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。

高分辨率成像技术表明，许多离子通道并非静止不动，而是处于高度动态的过程中，包括瞬时的……

离子通道在生物膜中并非静止不动。本文介绍了一种单分子光学方法，用于揭示侧向膜扩散与离子通道功能之间的关联。该技术相较于其他方法的主要优势在于，无需对蛋白质进行荧光标记，从而避免了标记可能对其侧向运动和功能造成的干扰。该方法可应用于任何自由扩散或受限扩散对其结构和功能具有重要意义的膜蛋白通道。首先，将380微升DPhPC储备溶液转移至玻璃小瓶中，并用氩气或氮气覆盖脂质储备溶液，以防止脂质氧化。使用尽可能低的气体流速，以避免溶解脂质的有机溶剂蒸发，或防止溶剂液滴从小瓶中飞溅出来。在氮气流下干燥脂质样品，并使用无油真空泵在真空条件下过夜去除脂质样品中残留的有机溶剂。用1毫升移液器取等体积的十六烷和硅油，加入脂质薄膜中，将其溶解于十六烷-硅油溶液中，最终脂质浓度为9.5毫克/毫升。将若干玻璃盖玻片放入不锈钢盖玻片架中，置于玻璃烧杯内，在超声波清洗器中用丙酮清洗约10分钟。用双蒸水冲洗盖玻片，并在氮气流下干燥。随后，将盖玻片置于氧气等离子清洗仪中清洁并增强亲水性，处理五分钟。将经等离子处理的盖玻片固定在旋涂仪上，使用200微升移液器缓慢加入140微升加热的0.75%低熔点琼脂糖溶液，在3,000 RPM转速下旋涂30秒，使盖玻片表面形成一层亚微米厚度的琼脂糖薄膜。立即将带有薄层琼脂糖水凝胶的旋涂盖玻片贴附到PMMA腔室的底面，确保琼脂糖水凝胶朝上。用透明胶带将盖玻片边缘固定在PMMA微加工装置上，并将该装置置于预热至35°C的加热板上。小心地将 200 微升 2.5% 琼脂糖溶液倒入腔室的入口，避免产生气泡。立即用约 60 微升脂质油溶液覆盖 PMMA 腔室的孔，以在琼脂糖与油的界面处启动脂质单层的形成，防止 PMMA 腔室孔中旋涂的琼脂糖脱水。将装置置于 35 摄氏度的加热板上约两小时。在液滴孵育室的多个微加工孔中，每个孔加入约 20 微升脂质十六烷硅油溶液。使用垂直或水平微量移液器拉制仪制备尖端开口直径约为 20 微米的微毛细玻璃针。用约 5 微升含有 8.8 毫摩尔 HEPES、7 微摩尔荧光染料 Fluo-8、400 微摩尔 EDTA、1.32 摩尔氯化钾以及 30 纳摩尔 TOM 核心复合物或 alternatively 20 纳摩尔 OMPF 的水相注射溶液填充该针头。将含有水相注射溶液的针头安装到压电驱动的纳米注射仪上，使用该纳米注射仪向已填充脂质十六烷硅油溶液的液滴孵育室的孔中注入100至200纳升的水相液滴。将PMMA腔室和液滴孵育腔室置于加热至35摄氏度的加热板上，保持约两小时，使脂质单分子层在液滴与油相界面处形成。使用带有10微升一次性聚丙烯吸头的单通道微升移液器，手动将液滴孵育腔室各孔中的单个水相液滴转移至PMMA腔室的孔中。让液滴沉降到水凝胶-油界面处的脂质单层上，从而在液滴与琼脂糖水凝胶之间形成脂质双层。将含有液滴界面双层（DIB）膜的PMMA腔室安装在倒置光学显微镜的样品台上，使用10倍Hoffman调制反差物镜观察膜的形成情况。若已形成DIB膜，则将PMMA腔室转移至配备常规透射光源用于落射荧光照明、488纳米激光器以及背照式电子倍增CCD相机的全内反射荧光（TIRF）显微镜样品台上，以实现约0.16微米的像素尺寸。使用高强度光源和GFP滤光片组，在落射荧光照明下，用10倍物镜对DIB膜的边缘进行聚焦。随后，在相同条件下，改用100倍、数值孔径1.49的复消色差油浸TIRF物镜，在高倍下对DIB膜的同一边缘进行精细聚焦。将滤光片组从GFP切换至四波段TIRF滤光片组，开启488纳米激光器，并调节激光在物镜处的强度。为了观察单个离子通道，调整TIRF角度和EM CCD相机增益，使DIB膜中开放的离子通道在暗背景下呈现为高对比度的荧光斑点，并使信号与背景的比值达到最大。确保对应于单个离子通道钙离子流的荧光斑点保持在焦平面内，形状呈圆形，中心亮度高，向边缘逐渐减弱。检查荧光斑点是否在焦平面内，以确认离子通道已成功重组到DIB膜中，并能在膜平面内进行侧向移动。最后，记录一系列膜图像，以便准确定位并监测各个离子通道的开放-关闭状态。为了确定侧向运动类型和通道活性状态，需获取足够长且采样充分的轨迹。此处展示的是粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）TOM-CC的冷冻电镜结构。从含有带6-His标签TOM22的粗糙脉孢菌（N. crassa）菌株中分离线粒体，用DDM溶解后，进行镍NTA亲和层析和阴离子交换层析。此处展示了分离得到的TOM-CC晶体结构的SDS-PAGE结果，以及用于比较的纯化大肠杆菌（E. coli）OMP F蛋白的SDS-PAGE结果。TOM-CC相应轨迹中的荧光强度变化表明，TOM-CC通道的开-关活性与其复合物在膜中的侧向移动性相关。振幅轨迹显示出三种通透性状态：对应于运动通道的完全开放状态、中间通透性状态，以及对应于非运动通道的闭合通道状态。处于中间状态的TOM-CC在其平均位置附近约正负60纳米范围内摆动。此处显示了OMPF在相应轨迹中的荧光振幅轨迹。与TOM-CC相比，OMPF无论是在运动状态还是被捕获状态下，均仅显示一个强度水平。对应于分子被捕获时间段的轨迹片段以灰色标出。需要注意的一个重要之处是，该方法可在完整的膜环境中分析单个膜蛋白。膜蛋白的动态特性将在可预见的未来继续成为科学研究的前沿领域。我们期望本方法将对此领域做出重要贡献。

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