使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

离子通道在生物膜中并非静止不动。本文介绍了一种单分子光学方法，用于揭示侧向膜扩散与离子通道功能之间的关联。该技术相较于其他方法的主要优势在于，无需对蛋白质进行荧光标记，从而避免了标记可能对其侧向运动和功能造成的干扰。

该方法可应用于任何自由扩散或受限扩散对其结构和功能具有重要意义的膜蛋白通道。首先，将380微升DPhPC储备溶液转移至玻璃小瓶中，并用氩气或氮气覆盖脂质储备溶液，以防止脂质氧化。使用尽可能低的气体流速，以避免溶解脂质的有机溶剂蒸发，或防止溶剂液滴从小瓶中飞溅出来。

在氮气流下干燥脂质样品，并使用无油真空泵在真空条件下过夜去除脂质样品中残留的有机溶剂。用1毫升移液器取等体积的十六烷和硅油，加入脂质薄膜中，将其溶解于十六烷-硅油溶液中，最终脂质浓度为9.5毫克/毫升。将若干玻璃盖玻片放入不锈钢盖玻片架中，置于玻璃烧杯内，在超声波清洗器中用丙酮清洗约10分钟。

用双蒸水冲洗盖玻片，并在氮气流下干燥。随后，将盖玻片置于氧气等离子清洗仪中清洁并增强亲水性，处理五分钟。将经等离子处理的盖玻片固定在旋涂仪上，使用200微升移液器缓慢加入140微升加热的0.75%低熔点琼脂糖溶液，在3,000 RPM转速下旋涂30秒，使盖玻片表面形成一层亚微米厚度的琼脂糖薄膜。

立即将带有薄层琼脂糖水凝胶的旋涂盖玻片贴附到PMMA腔室的底面，确保琼脂糖水凝胶朝上。用透明胶带将盖玻片边缘固定在PMMA微加工装置上，并将该装置置于预热至35°C的加热板上。

小心地将 200 微升 2.5% 琼脂糖溶液倒入腔室的入口，避免产生气泡。立即用约 60 微升脂质油溶液覆盖 PMMA 腔室的孔，以在琼脂糖与油的界面处启动脂质单层的形成，防止 PMMA 腔室孔中旋涂的琼脂糖脱水。将装置置于 35 摄氏度的加热板上约两小时。

在液滴孵育室的多个微加工孔中，每个孔加入约 20 微升脂质十六烷硅油溶液。使用垂直或水平微量移液器拉制仪制备尖端开口直径约为 20 微米的微毛细玻璃针。用约 5 微升含有 8.8 毫摩尔 HEPES、7 微摩尔荧光染料 Fluo-8、400 微摩尔 EDTA、1.32 摩尔氯化钾以及 30 纳摩尔 TOM 核心复合物或 alternatively 20 纳摩尔 OMPF 的水相注射溶液填充该针头。

将含有水相注射溶液的针头安装到压电驱动的纳米注射仪上，使用该纳米注射仪向已填充脂质十六烷硅油溶液的液滴孵育室的孔中注入100至200纳升的水相液滴。将PMMA腔室和液滴孵育腔室置于加热至35摄氏度的加热板上，保持约两小时，使脂质单分子层在液滴与油相界面处形成。使用带有10微升一次性聚丙烯吸头的单通道微升移液器，手动将液滴孵育腔室各孔中的单个水相液滴转移至PMMA腔室的孔中。

让液滴沉降到水凝胶-油界面处的脂质单层上，从而在液滴与琼脂糖水凝胶之间形成脂质双层。将含有液滴界面双层（DIB）膜的PMMA腔室安装在倒置光学显微镜的样品台上，使用10倍Hoffman调制反差物镜观察膜的形成情况。若已形成DIB膜，则将PMMA腔室转移至配备常规透射光源用于落射荧光照明、488纳米激光器以及背照式电子倍增CCD相机的全内反射荧光（TIRF）显微镜样品台上，以实现约0.16微米的像素尺寸。

使用高强度光源和GFP滤光片组，在落射荧光照明下，用10倍物镜对DIB膜的边缘进行聚焦。随后，在相同条件下，改用100倍、数值孔径1.49的复消色差油浸TIRF物镜，在高倍下对DIB膜的同一边缘进行精细聚焦。将滤光片组从GFP切换至四波段TIRF滤光片组，开启488纳米激光器，并调节激光在物镜处的强度。

为了观察单个离子通道，调整TIRF角度和EM CCD相机增益，使DIB膜中开放的离子通道在暗背景下呈现为高对比度的荧光斑点，并使信号与背景的比值达到最大。确保对应于单个离子通道钙离子流的荧光斑点保持在焦平面内，形状呈圆形，中心亮度高，向边缘逐渐减弱。检查荧光斑点是否在焦平面内，以确认离子通道已成功重组到DIB膜中，并能在膜平面内进行侧向移动。

最后，记录一系列膜图像，以便准确定位并监测各个离子通道的开放-关闭状态。为了确定侧向运动类型和通道活性状态，需获取足够长且采样充分的轨迹。此处展示的是粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）TOM-CC的冷冻电镜结构。

从含有带6-His标签TOM22的粗糙脉孢菌（N. crassa）菌株中分离线粒体，用DDM溶解后，进行镍NTA亲和层析和阴离子交换层析。此处展示了分离得到的TOM-CC晶体结构的SDS-PAGE结果，以及用于比较的纯化大肠杆菌（E. coli）OMP F蛋白的SDS-PAGE结果。TOM-CC相应轨迹中的荧光强度变化表明，TOM-CC通道的开-关活性与其复合物在膜中的侧向移动性相关。

振幅轨迹显示出三种通透性状态：对应于运动通道的完全开放状态、中间通透性状态，以及对应于非运动通道的闭合通道状态。处于中间状态的TOM-CC在其平均位置附近约正负60纳米范围内摆动。此处显示了OMPF在相应轨迹中的荧光振幅轨迹。

与TOM-CC相比，OMPF无论是在运动状态还是被捕获状态下，均仅显示一个强度水平。对应于分子被捕获时间段的轨迹片段以灰色标出。需要注意的一个重要之处是，该方法可在完整的膜环境中分析单个膜蛋白。

膜蛋白的动态特性将在可预见的未来继续成为科学研究的前沿领域。我们期望本方法将对此领域做出重要贡献。