Name: 实时测量中性粒细胞的线粒体生物能量特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习使用代谢细胞外通量分析仪测量小鼠和人类中性粒细胞及HL60细胞的线粒体呼吸功能。该方法可量化正常与疾病状态下的线粒体功能，为研究药物影响和线粒体功能障碍提供可靠方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Anthony T. Vella 博士和 Federica Aglianoin 博士在使用代谢细胞外通量分析仪方面的培训，以及康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Lynn Puddington 博士对仪器使用的支持。我们感谢康涅狄格大学医学院的 Geneva Hargis 博士在本论文的科学写作与编辑方面提供的帮助。本研究获得了美国国立卫生研究院下属国家心脏、肺和血液研究所（R01HL145454）、国家普通医学科学研究所（R35GM147713 和 P20GM139763）、康涅狄格大学健康中心启动资金以及美国免疫学家协会职业重返研究员奖学金的资助。

作者声明无竞争性财务利益。

使用代谢外流分析仪检测中性粒细胞线粒体呼吸的标准方法受到多种因素的限制，包括细胞数量、细胞生长状态和活力。在此检测中，不同种类和来源的细胞对每种化合物的浓度需求各不相同。&#160;寡霉素以及鱼藤酮/抗霉素A在大多数细胞类型中通常使用相似的浓度。然而，由于不同细胞的FCCP诱导最大呼吸速率存在差异，因此需要对FCCP进行仔细的滴定以优化其浓度42。在优化过程中，建议采用逐步添加FCCP的方式。尽管代谢外流分析仪可在气压作用下将药物注入检测板43，但由于某些线粒体复合物抑制剂难以穿透细胞膜，因此与分离的线粒体相比，其在完整细胞中的应用受到限制44。向加样孔中加载试剂时必须谨慎操作，以避免交叉污染。培养基中的底物浓度（如葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺）也可能影响线粒体活性，需进行优化。
除了药物浓度外，细胞接种密度也是获得良好OCR值的关键参数。最佳细胞接种密度因细胞类型而异，建议在预实验中使用不同的接种密度来测试测量效果。准确的细胞计数对于降低组间...

线粒体在细胞生物能量学中起着重要作用，通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）。此外，线粒体的功能还涉及活性氧的生成与解毒、胞质和线粒体基质钙离子的调控、细胞合成、分解代谢以及细胞内代谢物的转运1。线粒体呼吸对所有细胞都至关重要，其功能障碍可能导致代谢异常2，包括心血管疾病3以及多种神经退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性4、帕金森病和阿尔茨海默病5，以及腓骨肌萎缩症2A型（CMT2A）6。
对中性粒细胞的电子显微镜研究表明，其线粒体数量相对较少7，且主要依赖糖酵解产生能量，因为线粒体呼吸速率极低8。然而，线粒体对中性粒细胞的功能至关重要，例如趋化性9和凋亡10,11,12。先前一项研究揭示，人中性粒细胞中存在复杂的线粒体网络，并具有较高的膜电位。线粒体膜电位的丧失是中性粒细胞凋亡的早期指标10。使用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理后，趋化性受到显著抑制，同时线粒体形态也发生改变9,10。
尽管中性粒细胞的主要能量来源是糖酵解，但线粒体通过为嘌呤能信号传导的第一阶段提供能量，启动了中性粒细胞的活化，从而促进Ca2+信号传导，放大线粒体ATP的生成，并启动中性粒细胞的功能反应13。线粒体呼吸链功能障碍会导致毒性活性氧（ROS）的过度产生，进而引发致病性损伤14,15,16。NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成过程）是中性粒细胞的一项关键特性，有助于其抵抗病原体17，同时也参与多种病理状态，包括癌症、血栓形成和自身免疫性疾病18。线粒体来源的ROS参与NETosis过程19，线粒体DNA可成为NETs的组成部分18，而线粒体稳态的改变会损害NETosis20,21,22,23,24。此外，在正常的分化或成熟过程中，中性粒细胞的代谢重编程会因糖酵解活性受限而发生逆转，转而依赖线粒体呼吸并动员细胞内脂质25,26。
代谢细胞外通量分析仪可连续监测并定量活细胞的线粒体呼吸和糖酵解。该分析仪采用96孔板格式的传感器微孔板和两种荧光探针，用于定量氧气（O2）浓度和pH值的变化。在检测过程中，传感器微孔板位于细胞单层上方，形成约200 nm高的微腔室。分析仪中的光纤束用于激发荧光探针并检测荧光强度的变化。O2浓度和pH值的实时变化会自动计算并显示为氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。传感器微孔板上有四个加样孔，可在检测过程中向每个孔加入最多四种化合物。本实验方案重点介绍利用代谢细胞外通量分析仪定量小鼠和人中性粒细胞以及类中性粒细胞HL60细胞的线粒体呼吸。

<table><tbody><tr><td>37 &amp;deg;C 非 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;培养箱</td><td>Precision</td><td>Economy Model 2EG</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Biorender</td><td></td><td></td><td>软件应用</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Cell-Tak 细胞和组织粘附剂</td><td>Corning</td><td>102416-100</td><td>试剂</td></tr><tr><td>EasySep 磁力架</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td>磁铁</td></tr><tr><td>EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒</td><td>STEMCELL</td><td>19762A</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 9</td><td></td><td></td><td>软件应用</td></tr><tr><td>人血清白蛋白溶液 (25%)</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>试剂</td></tr><tr><td>氯胺酮 (VetaKet)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-114-10</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>试剂</td></tr><tr><td>板式转子桶</td><td>Eppendorf</td><td>UL155</td><td>配件</td></tr><tr><td>PolymorphPrep</td><td>PROGEN</td><td>1895 (之前为 1114683)</td><td>多糖溶液</td></tr><tr><td>纯化小鼠抗人 CD18 抗体</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td>克隆 TS1/18</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Seahorse 代谢细胞外通量分析仪</td><td>Agilent</td><td>XFe96</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Seahorse XF 细胞线粒体应激检测试剂盒</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>线粒体应激检测试剂盒</td></tr><tr><td>摆动式转子</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td>转子</td></tr><tr><td>Vactrap 2 真空捕集器</td><td>Fox Lifesciences</td><td>3052101-FLS</td><td>仪器</td></tr><tr><td>Wave</td><td></td><td></td><td>软件应用</td></tr><tr><td>XF 1.0 M 葡萄糖溶液</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td>试剂</td></tr><tr><td>XF 100 mM 丙酮酸溶液</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td>试剂</td></tr><tr><td>XF 200 mM 谷氨酰胺溶液</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td>试剂</td></tr><tr><td>XF DMEM 培养基</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>试剂</td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>材料</td></tr><tr><td>赛拉嗪 (AnaSed 注射液)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>麻醉剂</td></tr></tbody></table>

中性粒细胞线粒体生物能量谱的实时测量

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

中性粒细胞是人体的第一道防线，也是最丰富的白细胞类型。这些效应细胞具有吞噬作用、呼吸爆发等功能，并可形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）以清除微生物。近年来对中性粒细胞代谢活性的新认识挑战了早期认为其主要依赖糖酵解的观点。精确测定中性粒细胞的代谢活性，有助于揭示其在生理条件和疾病状态下不同的代谢需求，包括三羧酸循环（TCA循环，又称Krebs循环）、氧化磷酸化（OXPHOS）、磷酸戊糖途径（PPP）以及脂肪酸氧化（FAO）。本文介绍了一种逐步操作方案及前期准备要求，利用代谢外流分析仪通过代谢通量分析技术，测定小鼠骨髓来源中性粒细胞、人血液来源中性粒细胞以及类中性粒细胞的HL60细胞系的氧消耗率（OCR），作为线粒体呼吸的指标。该方法可用于定量分析中性粒细胞在正常和疾病状态下的线粒体功能。

代表性氧消耗率（OCR）动态变化显示了小鼠中性粒细胞（图3A）、人中性粒细胞（图3B）以及未分化和分化HL60细胞（图3C）在线粒体呼吸过程中对寡霉素、FCCP以及鱼藤酮/抗霉素A混合物的响应。在所有细胞中，寡霉素通过抑制ATP合酶的质子通道而降低OCR值；FCCP通过增加电子流和氧气消耗以维持膜电位，从而恢复OCR值并实现最大呼吸速率；而鱼藤酮/抗霉素A混合物则通过阻断电子传递链中的复合物I和III，完全消除线粒体呼吸。
我们观察到，在中性粒细胞定向分化后，HL60 细胞的线粒体呼吸作用降低（图 3C）。在定量分析上述不同的呼吸参数后发现，分化后的 HL60 细胞其基础线粒体呼吸（图 4B）、质子泄漏相关呼吸（图 4C）、AT...

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪逐步测定小鼠和人类中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的实验方案。

中性粒细胞是人体的第一道防线，也是数量最多的白细胞。这些效应细胞具有吞噬作用等功能，以及……

本方案重点介绍利用代谢外流分析仪定量小鼠和人类中性粒细胞以及类中性粒细胞HL60细胞的线粒体呼吸作用。该方法可使我们定量分析中性粒细胞在正常和疾病状态下的线粒体功能。这是一种简便的技术，可用于研究药物或任何疾病状态下细胞线粒体功能的变化。由于不同细胞的线粒体呼吸效率存在差异，必须精确优化细胞接种密度和试剂浓度，才能获得高质量的实验结果。开始进行代谢胞外通量检测时，取一个装有传感器微孔板的传感探头板，将200微升校准液加入其下方96孔板的每个孔中。小心提起装有校准液的探头板和微孔板，置于不含二氧化碳的、湿度饱和的37摄氏度培养箱中孵育过夜，以完成水合过程。接下来，根据细胞类型，用特定的包被物包被96孔板，以确保细胞贴壁。随后，用200微升无菌PBS洗涤孔板两次。在DMEM中配制检测培养基，其中含1毫摩尔丙酮酸、10毫摩尔葡萄糖和2毫摩尔谷氨酰胺。按照文稿中的描述获取小鼠和人中性粒细胞。对于从小鼠获取的中性粒细胞，通过加入检测培养基将细胞密度调整至每毫升 1.1 × 10⁶ 个细胞。然后将 180 µL 小鼠中性粒细胞悬液加入已准备好的 96 孔板的每孔中。同样，使用检测培养基将人中性粒细胞的细胞密度调整为每毫升 2.2 × 10⁶ 个细胞。在检测当天，使用血细胞计数板手动计数中性粒细胞样 HL60 细胞。然后将已分化或未分化的 HL60 细胞在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。用DMEM洗涤细胞一次，并将细胞重悬于检测培养基中，使细胞密度达到每毫升1.39 × 10⁶个细胞。随后，将180 µL已分化或未分化的HL60细胞接种至预先准备好的96孔板中，孔内含有小鼠和人中性粒细胞样本。最后，在接种细胞的同时，向细胞培养板无细胞的角落孔中加入完全培养基，用于背景校正。将培养板在室温下以300G离心3分钟，不刹车，以确保细胞充分贴附于培养板底部。最后，将培养板孵育1小时，使细胞预先与检测培养基达到平衡。打开线粒体应激检测试剂盒，并根据制造商说明书配制试剂。接下来，将试剂加入试剂盒中，首先将配制好的寡霉素加入A孔，FCCP加入B孔，鱼藤酮/抗霉素A混合液加入C孔，用于后续注射。将未使用的孔加入20 µL检测培养基。在检测前至少五小时，打开Wave软件并点击“Heater On”标签，将检测系统在37 °C下进行平衡。达到温度后，Wave 软件的左下角会显示“就绪”。在软件中打开线粒体应激检测试剂盒的模板。在左侧选择注射策略，然后点击“添加”，并将注射条件命名为人中性粒细胞、小鼠中性粒细胞或 HL60。通过点击选择 A 到 D 端口，点击“添加化合物”并分别输入寡霉素、FCCP 或鱼藤酮/抗霉素 A 及其相应浓度。在左侧选择“预处理”，然后点击“添加”并分别命名为 CD18 和 Cell Tak。在左侧选择细胞类型。然后点击“添加”并根据适用情况将其命名为人中性粒细胞、小鼠中性粒细胞以及HL60或DHL60，并设置相应的培养密度。通过点击“添加组”来定义分组，然后点击带下划线的定义项。单击顶部菜单中的“Plate Map”，可查看左侧定义的所有分组以及右侧的孔板图。通过拖放操作将每个孔分配至相应分组，同时保持四个角孔作为空白背景。为设置实验程序，在顶部菜单中选择“Protocol”选项卡，并定义三个循环：基础值（baseline）、寡霉素（oligomycin）、FCCP、鱼藤酮与抗霉素A混合物（rotenone and antimycin A mixture），设定混合时间为3分钟，静止时间为0分钟，检测时间为7分钟。进入“运行检测”页面，提供项目摘要信息以供参考，然后点击“开始运行”。指定文件保存位置，以便在检测完成后保存所有结果。然后再次点击“开始运行”。自动加载检测程序后，等待托盘打开，将传感器盒和含有200微升校准液的孔板放入。将传感器盒的条形码方向朝右放置。单击“我已准备就绪”开始校准，校准过程约需20分钟。校准完成后，单击“打开托盘”，将孔板替换为接种了细胞的孔板，然后单击“我已准备就绪”以继续进行检测。检测完成后，数据将自动保存。将结果导出至电子表格或其他分析软件文件中。绘制图表并分析数据。耗氧率（OCR）的代表性动态变化反映了小鼠和人中性粒细胞，以及未分化和分化HL60细胞在寡霉素、FCCP以及鱼藤酮与抗霉素A混合物作用下的线粒体呼吸变化。由于寡霉素抑制了ATP合酶的质子通道，所有细胞在寡霉素处理后OCR值均下降。FCCP处理促进了电子传递和氧气消耗，从而恢复OCR值并达到最大呼吸水平。鱼藤酮和抗霉素A的混合物阻断了电子传递链中的复合物1和复合物3，从而消除了线粒体呼吸。在HL60细胞向中性粒细胞定向分化后，观察到线粒体呼吸降低。分化后的HL60细胞的基础线粒体呼吸、质子泄漏相关呼吸、ATP相关呼吸以及非线粒体呼吸均显著降低。分化后的HL60细胞最大呼吸速率的增加并不显著，而备用呼吸能力则显著增强。确保细胞位于培养板底部，因为在读取OCR值时，悬浮细胞不应对传感器 cartridge 造成任何阻碍。该技术将有助于研究人员在中性粒细胞相关研究中探讨药物作用或线粒体功能障碍的影响。

real-time-measurement-mitochondrial-bioenergetic-profile

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

实时测量中性粒细胞的线粒体生物能量特征

提供了一种用于分析细胞线粒体功能的方法描述。该方法生成的线粒体功能谱可在一次实验中测量四个线粒体功能参数：基础呼吸速率、ATP偶联呼吸、质子漏和备用呼吸能力。...

使用C2C12成肌细胞的生物能量谱分析实验

本视频展示了利用细胞外通量分析仪分析活化人自然杀伤（NK）细胞能量代谢的方法。电子传递链复合物的不同抑制剂会影响ATP合成，该过程通过氧消耗率（OCR）进行测量，从而提供关于细胞代谢和生物能量学的见解。...

利用细胞外通量分析仪实时监测人自然杀伤细胞的能量代谢

血液中的白细胞和血小板可作为个体整体生物能量健康状况的标志物，因此具有监测病理过程及治疗效果的潜力。本文 介绍一种用于分离并检测这些细胞中线粒体功能和氧化爆发的方法。...

生物能量学与氧化爆发：人白细胞和血小板分离与评估的实验方案

我们的目标是开发一种实用的方案，用于评估癌症患者疲劳相关的线粒体功能障碍。该创新性方案针对临床应用进行了优化，仅需常规静脉采血和基本的实验室操作。...

评估线粒体功能在癌症相关性疲劳中的作用

Escherichia coli 是新生儿革兰氏阴性菌性脑膜炎的主要致病原因。在细菌感染过程中，中性粒细胞产生的活性氧物质发挥重要的杀菌作用。本文介绍一种检测脑膜炎致病性 E. coli...

实时定量检测感染脑膜炎病原体的中性粒细胞中的活性氧 大肠杆菌

代谢适应对T细胞至关重要，因其决定了T细胞的分化、存续及细胞毒性。本文介绍一种优化的用于监测线粒体呼吸的方案 离体 展示经细胞因子分化的原代人T细胞。...

细胞因子分化的原代人T细胞中线粒体呼吸的实时监测

实时细胞代谢通量检测利用pH和氧气传感器，测量氧消耗速率和细胞外酸化速率，分别对应线粒体和糖酵解途径的三磷酸腺苷（ATP）生成。本文详细阐述了一种用于理解成骨细胞能量状态以及细胞生物能量状态的表征与解读方法。...

使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量代谢

线粒体网络极为复杂，使其分析极具挑战性。一种新型的 MATLAB...

视黄酸受体亚型特异性调控活神经元线粒体稳态的优化自动化分析

我们介绍一种利用活细胞分析系统结合膜通透性依赖性双染料方法的自动化高通量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）定量技术。...

实时高通量技术定量人中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网的形成

在生理相关底物浓度下研究免疫细胞线粒体生物能量学的方法有限。本文提供了一种详细方案，利用高分辨率荧光测氧法，检测人T细胞、单核细胞和外周血单个核细胞中线粒体膜电位对能量需求变化的响应。...

高分辨率荧光测氧法评估人免疫细胞线粒体膜电位的动态变化

学习使用代谢细胞外通量分析仪测量小鼠和人类中性粒细胞及HL60细胞的线粒体呼吸功能。该方法可量化正常与疾病状态下的线粒体功能，为研究药物影响和线粒体功能障碍提供可靠方案。

中性粒细胞线粒体生物能量谱的实时测量

探索更多视频