中性粒细胞线粒体生物能量谱的实时测量

本方案重点介绍利用代谢外流分析仪定量小鼠和人类中性粒细胞以及类中性粒细胞HL60细胞的线粒体呼吸作用。该方法可使我们定量分析中性粒细胞在正常和疾病状态下的线粒体功能。这是一种简便的技术，可用于研究药物或任何疾病状态下细胞线粒体功能的变化。

由于不同细胞的线粒体呼吸效率存在差异，必须精确优化细胞接种密度和试剂浓度，才能获得高质量的实验结果。开始进行代谢胞外通量检测时，取一个装有传感器微孔板的传感探头板，将200微升校准液加入其下方96孔板的每个孔中。小心提起装有校准液的探头板和微孔板，置于不含二氧化碳的、湿度饱和的37摄氏度培养箱中孵育过夜，以完成水合过程。

接下来，根据细胞类型，用特定的包被物包被96孔板，以确保细胞贴壁。随后，用200微升无菌PBS洗涤孔板两次。在DMEM中配制检测培养基，其中含1毫摩尔丙酮酸、10毫摩尔葡萄糖和2毫摩尔谷氨酰胺。

按照文稿中的描述获取小鼠和人中性粒细胞。对于从小鼠获取的中性粒细胞，通过加入检测培养基将细胞密度调整至每毫升 1.1 × 10⁶ 个细胞。然后将 180 µL 小鼠中性粒细胞悬液加入已准备好的 96 孔板的每孔中。

同样，使用检测培养基将人中性粒细胞的细胞密度调整为每毫升 2.2 × 10⁶ 个细胞。在检测当天，使用血细胞计数板手动计数中性粒细胞样 HL60 细胞。然后将已分化或未分化的 HL60 细胞在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。

用DMEM洗涤细胞一次，并将细胞重悬于检测培养基中，使细胞密度达到每毫升1.39 × 10⁶个细胞。随后，将180 µL已分化或未分化的HL60细胞接种至预先准备好的96孔板中，孔内含有小鼠和人中性粒细胞样本。最后，在接种细胞的同时，向细胞培养板无细胞的角落孔中加入完全培养基，用于背景校正。

将培养板在室温下以300G离心3分钟，不刹车，以确保细胞充分贴附于培养板底部。最后，将培养板孵育1小时，使细胞预先与检测培养基达到平衡。打开线粒体应激检测试剂盒，并根据制造商说明书配制试剂。

接下来，将试剂加入试剂盒中，首先将配制好的寡霉素加入A孔，FCCP加入B孔，鱼藤酮/抗霉素A混合液加入C孔，用于后续注射。将未使用的孔加入20 µL检测培养基。在检测前至少五小时，打开Wave软件并点击“Heater On”标签，将检测系统在37 °C下进行平衡。

达到温度后，Wave 软件的左下角会显示“就绪”。在软件中打开线粒体应激检测试剂盒的模板。在左侧选择注射策略，然后点击“添加”，并将注射条件命名为人中性粒细胞、小鼠中性粒细胞或 HL60。

通过点击选择 A 到 D 端口，点击“添加化合物”并分别输入寡霉素、FCCP 或鱼藤酮/抗霉素 A 及其相应浓度。在左侧选择“预处理”，然后点击“添加”并分别命名为 CD18 和 Cell Tak。在左侧选择细胞类型。

然后点击“添加”并根据适用情况将其命名为人中性粒细胞、小鼠中性粒细胞以及HL60或DHL60，并设置相应的培养密度。通过点击“添加组”来定义分组，然后点击带下划线的定义项。

单击顶部菜单中的“Plate Map”，可查看左侧定义的所有分组以及右侧的孔板图。通过拖放操作将每个孔分配至相应分组，同时保持四个角孔作为空白背景。为设置实验程序，在顶部菜单中选择“Protocol”选项卡，并定义三个循环：基础值（baseline）、寡霉素（oligomycin）、FCCP、鱼藤酮与抗霉素A混合物（rotenone and antimycin A mixture），设定混合时间为3分钟，静止时间为0分钟，检测时间为7分钟。

进入“运行检测”页面，提供项目摘要信息以供参考，然后点击“开始运行”。指定文件保存位置，以便在检测完成后保存所有结果。然后再次点击“开始运行”。

自动加载检测程序后，等待托盘打开，将传感器盒和含有200微升校准液的孔板放入。将传感器盒的条形码方向朝右放置。单击“我已准备就绪”开始校准，校准过程约需20分钟。

校准完成后，单击“打开托盘”，将孔板替换为接种了细胞的孔板，然后单击“我已准备就绪”以继续进行检测。检测完成后，数据将自动保存。将结果导出至电子表格或其他分析软件文件中。

绘制图表并分析数据。耗氧率（OCR）的代表性动态变化反映了小鼠和人中性粒细胞，以及未分化和分化HL60细胞在寡霉素、FCCP以及鱼藤酮与抗霉素A混合物作用下的线粒体呼吸变化。由于寡霉素抑制了ATP合酶的质子通道，所有细胞在寡霉素处理后OCR值均下降。FCCP处理促进了电子传递和氧气消耗，从而恢复OCR值并达到最大呼吸水平。

鱼藤酮和抗霉素A的混合物阻断了电子传递链中的复合物1和复合物3，从而消除了线粒体呼吸。在HL60细胞向中性粒细胞定向分化后，观察到线粒体呼吸降低。分化后的HL60细胞的基础线粒体呼吸、质子泄漏相关呼吸、ATP相关呼吸以及非线粒体呼吸均显著降低。

分化后的HL60细胞最大呼吸速率的增加并不显著，而备用呼吸能力则显著增强。确保细胞位于培养板底部，因为在读取OCR值时，悬浮细胞不应对传感器 cartridge 造成任何阻碍。该技术将有助于研究人员在中性粒细胞相关研究中探讨药物作用或线粒体功能障碍的影响。